Name: high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43
Uploaded: 2018-10-23T15:00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43 at JoVE.com

Авторы благодарят D. стекла, H. Ким, N. Cira, A. Choksi, S. Раджан и б. ключи за их полезные предложения и в Spormann лабораторию для доступа к их конфокального микроскопа. Кроме того авторы признают поддержки от Стэнфорда био-X Bowes и Сенти PGS стипендии, Национальный институт здравоохранения (R21-Ай-139941) и американского общества рака (RSG-14-177-01).

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+Biofilms.">Microbial Biofilms.</a> Annual Review of Microbiology. 49 (1), 711-745 (1995).</li><li>Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+commensalism+and+competition+in+a+two-species+microbial+consortium.">Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium.</a> Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).</li><li>Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., M&#246;glich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dusk+till+dawn:+one-plasmid+systems+for+light-regulated+gene+expression.">From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression.</a> Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).</li><li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+high-density+bacterial+colony+arrays+and+patterns+by+the+ink-jet+method.">Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).</li><li>Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Biofilm+Formation+Reveals+A+Mechanism+for+Structural+Heterogeneity+in+Bacterial+Biofilms.">Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).</li><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).</li><li>Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+biofilm-based+materials+from+engineered+curli+nanofibres.">Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres.</a> Nature Communications. 5, 4945 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13, 515-523 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Plasmid+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Bacterial+Transformation:+The+Heat+Shock+Method.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Bacterial+Transformation:+Electroporation.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Laboratory+Techniques.+Introduction+to+Fluorescence+Microscopy.">General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2010).</li><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. 47, e2437 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering.+Soft+Lithography.">Bioengineering. Soft Lithography.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li><li>Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Kac, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Signs of Life: Bio Art and Beyond. , (2007).</li><li>Lee, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trap+it!:+A+Playful+Human-Biology+Interaction+for+a+Museum+Installation.">Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation.</a> Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).</li><li>Cira, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Biotic+Game+Design+Project+for+Integrated+Life+Science+and+Engineering+Education.">A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education.</a> PLOS Biology. 13 (3), e1002110 (2015).</li><li>Bybee, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+generation+science+standards+and+the+life+sciences.">The next generation science standards and the life sciences.</a> Science and Children. 50 (6), 7 (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

С учетом необходимости исследовательских инструментов, которые позволяют биопленки структуры управления мы представили это easy-to-use протокол для структурирования бактериальных биопленок, с помощью конструкции optogenetic pDawn-Ag43. С этой техникой кишечной биопленки можно оптически узором на различные поверхности среды, включая замкнутые камеры, с пространственным разрешением ниже 25 мкм.
В целом, этот протокол может быть разбита на четыре основных раздела: (1 Подготовка бактерий, pDawn-Ag43, (2 Подготовка оптического и аппаратные настройки культуры, (3 шаги предварительной освещения рост бактерий и (4 после освещения полоскания и изображений.
Важной частью раздела 1 является успешное превращение плазмида pDawn-Ag43 в штамм E. coli интерес. Этому способствует изоляции высокого качества очищенные плазмид и создания компетентных клеток высокого качества для преобразования (Таблица 1, устранение неполадок).
Важной частью раздела 2 является оптимизация проектора set-up так что освещенности корректируется до 50 мкВт/см2 на длине волны 460 Нм, и проектор правильно ориентирован на высоте образца биопленки. Обратите внимание, что в настоящем Протоколе, мы описываем set-up Перевернутый освещения, где проектора излучает свет снизу, вверх к биопленки образца. Преимущество этой настройки является, что свет только нужно пройти через нижнюю часть культуры блюдо до достижения поверхности образования биопленки. Подсветка сверху означает, что свет будет путешествовать через жидких сред над поверхностью биопленки, который, в ходе роста, получает облачно с планктонных клеток. Помимо этих проблем, это также важно для сведения к минимуму рассеянного света в оптической системы как можно больше, например, путем покрытия до отражающих поверхностей на интерьер инкубатора — это помогает получить резким рисунком биопленки. На соответствующую записку острее биопленки шаблоны можно также получить с помощью фотошаблонов для управления освещением патронирования (3D рисунок, Рисунок 4 c). Общие вопросы, требующие устранения неполадок включают вопросы надежности проектора при более высоких температурах (например, 37 ° C), которые могут быть уменьшиты инкубации биопленки роста при более низких температурах (например, 30 ° C), а также компьютерного программного обеспечения, Причины обновления операционной системы или синий свет, фильтрации во время ночи роста (Таблица 1). Важно также отметить, что, в зависимости от модели проектора и инкубатор используется, это также возможно, что тепла от проектора приведет к более высокой температуры внутренних чем инкубатора установить температуру, которая может потребоваться исправить.
Важной частью раздела 3 является получение надежные и повторяемые бактериальные образцы, прежде чем они индуцированных освещения. По этой причине мы рекомендуем вам получить клоновых колоний бактерий, pDawn-Ag43, мелирование их вне на плите агар и затем с помощью жидкого культуры шаги для обеспечения того, чтобы бактерии освещенные индуцированной в конце фазы экспоненциального роста в повторяемые образом.
Наконец важнейшей частью раздела 4 является тщательно, но также осторожно, смыть планктонных клеток, оставшихся после биопленки, кучность протокола; Таким образом рекомендуется выполнить несколько шагов нежно полоскания с PBS.
По сравнению с существующими методами для клеток патронирования5,6, оптические биопленки, кучность на основе pDawn-Ag43 имеет достаточно низкий барьер входа для использования, в том, что она не требует микротехнологий, чистота помещений, комплекс Химия, или подготовка поверхности, пока еще в состоянии картины с высоким разрешением (25 мкм), обычно связанные с микротехнологий методов. Этот метод расширяет предыдущие работы на бактериальных фотолитографии для контроля ген выражение17. В настоящее время pDawn-Ag43 плазмиды ограничивается E. coli, как он использует на основе МПУЕ происхождения репликации, но pDawn и Ag43 являются совместимыми в других (грамотрицательные) бактериальных видов. Генетические методы доступны для потенциально представляя свет регулируемых биопленки различных видов бактерий и представляет возможные направления будущих исследований. Другим потенциальным ограничением методики является, что она работает путем увеличения биопленки в штаммов с слабой родной биопленки (например, MG1655 E. coli). Однако штаммы с сильным родной биопленки имеют форму биоплёнки независимо от условий освещения, исключающие узорной биопленки, с помощью pDawn-Ag43 как описано здесь; еще optogenetic методы по-прежнему может оказаться применимым в регулировании биопленки. Мы отмечаем, что в других контекстах, альтернативные методы структурирования биопленки могут быть доступны, например через оптические c ди GMP модуляции18.
В целом, pDawn-Ag43 на основе структурирования будет подходящим для использования в приложениях, которые исследовать эффект биопленки структуры на функция1 и, таким образом, могли бы воспользоваться перестраиваемый контроль над биопленки патронирования — особенно актуально Пример для выделения является изучение микробной экологии в биопленке2. Будущие направления деятельности включают в себя рисунком биоматериалов8,9 и/или структурированные бактериальных сообществ. Альтернативные приложения этот доступ протокола также включают в себя био искусства19, учитывая ясно эстетический потенциал, а также науки о жизни формального и неформального образования20,21,22. С образовательной точки зрения, протокол, описанные здесь сочетает в себе многие соответствующие методы (бактериальной культуры, преобразование, оптика/Оптогенетика) и также модульно удлиняемым (например, включать микрофлюидика).

Биоплёнки являются придает поверхности сообществ микробов и хорошо известны за их сильные структуры функция сцепления. Пространственной геометрии и кучность биоплёнки играют важную роль в общей функции сообщества (и наоборот)1. Малая длина шкалы участвует в структуре биопленки — порядка десятков мкм2— сделать настраиваемый и удобный контроль над биопленки, кучность является сложной проблемой. Здесь мы показываем, протокол, который позволяет для биоплёнки быть точно рисунком в произвольной геометрии, основанный на оптические освещения.
Представленные здесь протокол использует pDawn-Ag433, optogenetic конструкцию, что пары биопленки бактерий E. coli оптическое освещение, ведя выражение Ag43 (принимает ген, ответственный за поверхности сцепления и биопленки формирование) под контролем pDawn4 (транскрипционный анализ регулятор, контролируемых оптическое освещение). Этот метод удобно использовать и может биоплёнки шаблон на различные поверхности средах, в том числе закрытых (прозрачный) культуры камер. По сравнению с существующими методами осаждения ячейки, например осаждения на основе капли5 или поверхности prepatterning/лечения6, pDawn-Ag43 не требует микротехнологий или чистый номер Услуги и не требуют материалов, помимо тех, которые доступно для типичного микробиологической лаборатории. Она способна узор с пространственным разрешением ниже 25 мкм, приближается к пространственные размеры microcolonies естественно существующих биоплёнки2. В целом этот метод обеспечивает возможность манипулировать биопленки структура, которая затем открывает много возможностей для изучения микробиоценоза в бактериальных сообществ7. Кроме того узорные биоплёнки может предоставить удобную платформу для инженер полезные биоматериалов8,9. В этой статье мы обсуждаем основной протокол, необходимые для структурирования биоплёнки с помощью pDawn-Ag43 и устранения потенциальных изменений и устранения неполадок, связанных с методом.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DH5alpha/pDawn-Ag43</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>107742</td>
			<td>DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG1655 E. coli</td>
			<td>Coli Genetic Stock Center - Yale University</td>
			<td>CGSC #6300</td>
			<td>MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper&#39;s representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP expression plasmid</td>
			<td>iGEM biobricks</td>
			<td>J04450-pSB4K5bb</td>
			<td>Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75852</td>
			<td>Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin to get sterile LB+spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75851</td>
			<td>Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 &#956;g/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>431760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin hydrochloride pentahydrate</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab141968</td>
			<td>Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 media salts 5X solution</td>
			<td>Bio-world</td>
			<td>705729</td>
			<td>Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet&#160;</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>212120250</td>
			<td>Dilute to 0.1% in water prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-hardening mounting media (Shandon immumount)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td>Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can also use PBS prepared from powder / tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>351146</td>
			<td>Used as biofilm culture dish for representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td>For use with liquid handling with enclosed microchambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt tip needle</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-23-050</td>
			<td>Attaches to 1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-901</td>
			<td>Use to attach culture chamber to incubator ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial incubator</td>
			<td>Sheldon Manufacturing</td>
			<td>SMI6</td>
			<td>Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable projector</td>
			<td>Ivation</td>
			<td>IV-PJ-PRO-4-1</td>
			<td>Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical breadboard base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MSB6</td>
			<td>Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR8</td>
			<td>2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post right-angle clamp</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90</td>
			<td>Connects vertical and horizontal posts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Connects optical breadboard base and vertical post</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SH25S050</td>
			<td>Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34;-20 set-screw</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SS25E63D</td>
			<td>Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>840</td>
			<td>Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter detector</td>
			<td>Newport</td>
			<td>818-UV</td>
			<td>Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable ND filter</td>
			<td>K&#38;F Concept</td>
			<td>SKU0689</td>
			<td>Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presentation-projector software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Powerpoint</td>
			<td>Any software that allows drawing / presentation will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk&#160;</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film photomask</td>
			<td>Fineline Imaging</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Many photomask printer services exist for high resolution (&#62;30000DPI) film photomask printing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution patterned biofilm deposition using pdawn-ag43

Пространственная структура и кучность играют важную роль в бактериальные биопленки. Здесь мы показываем, доступный метод для культивирования кишечной биопленки в произвольных пространственных моделей с высоким пространственным разрешением. Техника использует конструкцию генетически закодированный optogenetic — pDawn-Ag43 — это пары биопленки в E. coli оптических стимуляции, синий свет. Мы подробно процесс преобразования кишечной палочки с pDawn-Ag43, подготовка необходимых оптических set-up и протокол для культивирования узорной биоплёнки с помощью pDawn-Ag43 бактерий. Используя этот протокол, можно узорной биоплёнки с пространственным разрешением ниже 25 мкм на различных поверхностях и сред, включая замкнутые камеры, не требуя микротехнологий, чистота-услуги или подготовка поверхности. Метод является удобным и подходящим для использования в приложениях, которые исследовать эффект биопленки структуры, обеспечивая настраиваемый контроль над биопленки кучность. Более широком смысле он также имеет потенциальные применения биоматериалов, образования и био Арт.

Как показано на рисунке 4A, pDawn-Ag43 бактерии были использованы для создания биоплёнки узорной в хорошо плит с проектор освещения (проектор был установлен для освещения шаблон горошек), образы через brightfield микроскопии с кристаллом фиолетовые пятна контрастного вещества, и микроскопии флуоресцирования, с использованием красного флуоресцентный белка выражая бактерий. Флуоресцентный биопленки образцы можно также образы с помощью конфокальной микроскопии14 для получения изображения биопленки в 3-D (рис. 4В). В рисунке 4 cмы иллюстрируем разрешением патронирования можно с помощью фильм фотошаблонов для узорной освещения в образце биопленки. Наконец, в рисунке 4 d и 4E, мы показываем примеры кучность на стекла и PDMS поверхностей, а также закрытых камерах PDMS культуры — они иллюстрируют различные типы сред, где может применяться кучность pDawn-Ag43.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig1.jpg"> Рисунок 1: подготовка pDawn-Ag43 бактерий (протокол раздел 1). Подготовка pDawn-Ag43 бактерий, способных света регулируемых биопленки включает очистки pDawn-Ag43 плазмиду с хоста клонирование штамм, превращая его в штамм E. coli интереса и создание фондовой бактериальных морозильник для долгосрочного хранения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig2.jpg"> Рисунок 2: подготовка оптический настройки для освещения образца биопленки (протокол раздел 2). Оптических set-up расположен внутри бактериальной инкубатора и состоит из компьютер подключен проектор, освещающая образец биопленки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig3.jpg"> Рисунок 3: Культура протокол для структурирования биоплёнки (протокол раздел 3). (A) до их освещения, pDawn-Ag43 бактерии готовят до кучность таким образом, что они надежно наведены на этапе надлежащего роста. (B) после того, как ночь освещается рост, узорные биофильмов будет присутствовать в нижней части культуры блюдо, наряду с планктонных клетки в жидких средах, и после некоторых дальнейшей обработки, биопленки готова к визуализации. (C) как альтернатива хорошо пластины, биопленки можно культивировали в закрытых культуры камер как литьевые полости PDMS. В этом случае шприцы, прилагается к тупым кончик иглы может использоваться для внедрения образца и промойте жидкости из камеры. (D) как альтернатива шаблонов на основе проектор освещения, шаблоны могут создаваться лентой фильм фотошаблонов непосредственно к нижней палаты культуры биопленки. В этом случае следует настроить проектора загорается синий свет через полное поле. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58625/58625fig4.jpg"> Рисунок 4: представитель результаты биоплёнки узором, с помощью pDawn-Ag43. Все результаты были получены с помощью штамм E. coli MG1655 узла. (A) pDawn-Ag43 бактерии были использованы для создания биоплёнки узорной в хорошо плит с проектор освещения (проектор был установлен для освещения шаблон горошек), образы через brightfield микроскопии с Фиолетовый Кристалл пятно как контрастное вещество и микроскопии флуоресцирования, с использованием красного флуоресцентный белка выражая бактерий. (B) флуоресцентных биопленки образцы отражаются с помощью конфокальной микроскопии для получения объемного изображения биопленки. (C) с высоким разрешением биопленки можно узорной с фильма фотошаблонов для узорной освещения в образце биопленки. (D) биопленки можно узором на поверхности PDMS и стекла. Биоплёнки (E) можно узором в закрытых культуры камер. Эта цифра была адаптирована из предыдущей работы3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58625/58625fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Проблема</td>
			<td>Возможные причины/решения</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tranforming pDawn-Ag43 в хост-штамм - нет колонии</td>
			<td>Низкая концентрация плазмида - проверить плазмида концентрация на спектрометре. Типичный алкалический pDawn-Ag43 должна принести по крайней мере 100 нг/мкл; Используйте до 10-100 нг для преобразования</td>
		</tr>
<tr>
<td>Проверка/римейк сведущие клетки: сведущие клетки должны иметь эффективность преобразования по крайней мере 10 ^ 6 кое/мкг, проверяются с помощью стандартного плазмида например pUC19 - если нет, римейк сведущие клетки</td>
		</tr>
<tr>
<td>Неправильно (уровень) антибиотик на табличке агар LB - не забудьте использовать 50 мкг/мл спектиномицин для выбора</td>
		</tr>
<tr>
<td>Проектор освещения превращает off / несовместимыми на ночь</td>
			<td>Отключение проблемных программного обеспечения таких как: автоматическое обновление программного обеспечения/OS в ночь, ночь время синий свет фильтр</td>
		</tr>
<tr>
<td>Проектор может перегрев - набор инкубатор для низкой температуры, а проектор включен (например 30 ° C вместо 37 ° C) - Примечание проектор как источник тепла может перегреться инкубатор после застывания</td>
		</tr>
<tr>
<td>Удалите ненужные источники влажности из инкубатора, как они могут повлиять на проектор-Электроника</td>
		</tr>
<tr>
<td>No/низкий уровень биопленки формируется после ночного освещения, рост не планктонных клетки либо (т.е. жидкость ясно)</td>
			<td>Антибиотик неправильно (уровень) - не забудьте использовать 50 мкг/мл спектиномицин</td>
		</tr>
<tr>
<td>Проверьте, что все должным образом добавляется M63 рецепт</td>
		</tr>
<tr>
<td>No/низкий уровень биопленки формируется после ночного освещения, только планктонные клетки (т.е. жидкость мутная)</td>
			<td>Проверьте свет уровень, проектор должен осветительные синий свет на 50 мкВт/см ^ 2 в 460 Нм длины волны</td>
		</tr>
<tr>
<td>Попробуйте позволить бактерии растут на короткий/длительный срок после 1: 1000 фунтов subdilution шаг перед добавлением M63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Restreak бактерий на табличке LB, начать с свежие колонии для создания культуры ночи стационарной фазы</td>
		</tr>
<tr>
<td>Обеспечить проектор работает последовательно на ночь - см. выше пункт</td>
		</tr>
<tr>
<td>Нечетких биопленки шаблоны, высокий уровень фонового шума</td>
			<td>Уменьшить рассеянный свет от системы оптического освещения, отражающей поверхности на интерьер инкубатора</td>
		</tr>
<tr>
<td>Рассмотрите возможность использования на основе фотошаблонов (в отличие от проектора основе) структурированного освещения</td>
		</tr>
<tr>
<td>Убедитесь, что проектор должным образом ориентирован на поверхности нижней палаты культуры биопленки</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Общие, устранение неполадок.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43 at JoVE.com

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Мы демонстрируем метод для депонирования бактериальных биопленок Escherichia coli в произвольные пространственные закономерности с высоким разрешением с помощью оптических стимуляции генетически закодированный адгезию поверхности конструкции.

Высоким разрешением узорной биопленки осаждения с pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Мы разработали метод под названием биопленка литографии, чтобы светить свет на поверхность, и бактерии накапливаются там, где свет. Этот метод позволит нам ответить на ключевой вопрос в исследованиях биопленки, например, как пространственные структуры влияют на функции сообщества. Этот метод имеет много преимуществ.Например, он работает с очень высоким разрешением 25 микрометров, не требует предварительной картины поверхности, а также работает внутри закрытых жидкостных устройств. Хотя этот метод может дать представление о структуре-функции отношения природных биопленок, он также может быть применен к другим дисциплинам, таким как биопленка инженерии, биоматериалы, и многоклеточной синтетической биологии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку существуют ключевые предварительные шаги по подготовке оптической установки культуры и бактериального образца до биопленки шаблона.Во-первых, превратить pDawn-Ag43 плазмид в штамм E.coli интерес, и пластины на пластину LB агар дополнены спектромицин. Привить одну колонию в бульон LB с спектромицином в трубке культуры, и вырастить его до экспоненциальной фазы в трясущимся инкубаторе при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию. После прививки, подготовить 25%глицерол запас pDawn-Ag43 преобразован штамма путем смешивания одного миллилитра 50%стерильный глицерол с одним миллилитр культуры в крио-трубке.Храните бульон в морозильной камере до минус 80 градусов по Цельсию. Далее начните подготовку оптической установки путем размещения портативного проектора в нижней части бактериального инкубатора с диафрагмой, указывающей прямо вверх на потолок, где будет прикреплена камера культуры биопленки. Подключите ноутбук через дисплей кабеля к проектору внутри инкубатора.Используйте ленту, чтобы прикрепить пустое блюдо культуры манекен к потолку инкубатора. Отрегулируйте фокус на проекторе, повернув фокусированную ручку так, чтобы фокусировка плоскости совпадала с нижней поверхностью блюда культуры биопленки, прикрепленного к потолку инкубатора. Проектор должен осветить резкое, не размытое изображение на дно культурного блюда.Удалите манекен культуры блюдо после того, как проекция была оптимизирована. Используя программное обеспечение ноутбука, направьте проектор, чтобы осветить полное поле зрения с максимальным синим освещением, представляя полный синий слайд. Измерьте интенсивность освещения проектора с помощью оптического счетчика мощности, поместив голову фотодетектора на потолок инкубатора и читая интенсивность соответствующего счетчика мощности, откалиброванного до световой длины волны 460 нанометров.Затем отрегулируйте интенсивность освещения с помощью регулируемого фильтра нейтральной плотности, размещенного в диафрагме проектора. Поверните фильтр, чтобы регулировать интенсивность освещения, измеряемую счетчиком мощности, до тех пор, пока интенсивность освещения в центре области, проецируемой синим светом, не будет считывает 50 микроватт на сантиметр в квадрате. Важно обеспечить, чтобы интенсивность освещения была установлена на должном уровне с помощью откалиброванного фотодетектора, расположенного на потолке инкубатора.Это позволяет точно настроить интенсивность освещения путем вращения фильтра нейтральной плотности. Теперь нарисуйте произвольные шаблоны с помощью программного обеспечения презентации проектора на ноутбуке, и отобразить эти шаблоны на потолке инкубатора, используя проектор. Перед освещением, полоса pDawn-Ag43 штамм из глицерола фонда на LB-плюс-спец агар пластины.Разрешить колоний расти в одночасье при 37 градусов по Цельсию. Прививка колонии pDawn-Ag43 бактерий из агар пластины в LB-плюс-спец бульон, и расти культуры ночь на стационарной фазе в трясущимся инкубатором на 250 об / мин и 37 градусов по Цельсию. На следующий день, подширить культуру в соотношении от одного до 1000 в бульоне LB со спектромицином.Разрешить субразбавленной культуры расти в трясущимся инкубаторе в шесть часов при 250 об / мин и 37 градусов по Цельсию до конца экспоненциальной, ранней стационарной фазы. Важно, чтобы обратно разбавить ночь культуры и расти до поздней экспоненциальной фазы до освещения. Это гарантирует, что бактерии надежно здоровы и активны после индукции.После инкубации, subdilute поздней экспоненциальной фазы культуры в соотношении от одного до 100 с ранее подготовленных M63 средств массовой информации дополняется 50-микрограмм на миллилитр спектромицин. Затем ввимите разбавление в блюдо культуры биопленки. Поскольку образцы теперь готовы к освещению, лента культуры блюдо к потолку инкубатора, гарантируя, что поверхность в нижней части блюда является прозрачной для освещения снизу проектором.После ночного роста образцов биопленки удалите блюдо культуры из инкубатора. Блюдо будет иметь биопленоплено бактерий, прикрепленных к его нижней поверхности, где она была освещена, а также планктонных бактерий, рассеянных в жидком смирее выше. Откажитесь от планктонных клеток, удалив жидкие средства из культуры блюдо.Затем, промыть образец два раза с PBS, чтобы удалить оставшиеся планктонные клетки, мягко трубопроводов в PBS, а затем стремление. Если клетки флуоресцентно помечены, непосредственно изображение образцов с помощью флуоресценции микроскопии. Как видно здесь, бактерии pDawn-Ag43 использовались для создания биопленок, узорчатых в полистирола хорошо пластин с проектором освещения.Биопленки можно визуализировать с помощью кристально фиолетового окрашивания или в качестве альтернативы с помощью флуоресцентной микроскопии при использовании флуоресцентных бактерий. Флуоресцентные образцы биопленки также могут быть изображены с помощью конфокалиптерной микроскопии для получения изображений биопленки в 3D. Узор с высоким разрешением возможен с помощью фотомаска пленки для обеспечения узорчатого освещения образца биопленки.Примеры узора на стеклянных и PDMS поверхностях, а также закрытые камеры культуры PDMS, показаны здесь и иллюстрируют различные типы сред, где pDawn-Ag43 шаблон может быть применен. При попытке этой процедуры, важно сначала превратить pDawn-Ag43 в ваш штамм интереса, а затем правильно сосредоточиться и откалибровать проектор, и, наконец, следовать требуемой культуры и обратно разбавления шаги для подготовки бактерий для освещения. Следуя этому методу, могут быть развернуты другие методы, например, мониторинг биопленки в долгосрочной перспективе в различных культурных условиях.Таким образом, мы можем понять, как структура биопленки влияет на ее функцию. Этот метод будет широко применяться, например, для синтетической биологии и исследований материалов, для разработки биопленок для различных применений.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Узорные Фотостимуляция с цифровыми устройствами Micromirror по расследованию Дендритные интеграции между точками ветвления

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Высокое разрешение Волоконно-оптические Microendoscopy для На месте Сотовые изображений

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Высокое разрешение изображения в 3D Экс-Vivo Биологические образцы от Micro КТ

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Непрерывная высокого разрешения Микроскопическое исследование репликативного старения у почкующихся дрожжей

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Подготовка Mica Поддерживаемые липидного бислоя за большой размер оптической микроскопии изображений

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

Микрожидкостных генипин осаждения Техника для расширенной культуры Micropatterned сосудистых мышечной тонких пленок

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Слой за слоем Коллаген осаждения в микрофлюидных Устройства для стабилизации Microtissue

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Правильное позиционирование и сдержанность крыса задние конечности для целенаправленного высоким разрешением изображений кости с помощью микро архитектуры в естественных условиях Микро Компьютерная томография

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...