Name: measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我们感谢亚历山大·科列斯尼科夫博士和弗拉基米尔·凯法洛夫博士提供了 gnat1-/mics,提供了有益的反馈和建议, 并阅读了手稿。
这项工作得到了 nih ey025269 (rr)、华盛顿大学糖尿病研究中心-nih dk020579 (jrm 和 rr)、预防失明研究职业发展奖、霍恩克雷斯特基金会 (rr)、jdrf 职业发展奖 (jrm)、nih dk101392 (cfs)、dk020579 (cfs)、dk056341 (cfs) 和 dk114233 (jrm)。

这些议定书遵循了《动物使用视觉和眼科研究声明》, 并得到了华盛顿大学的批准。
1. 动物准备
<ol><li>将动物放在标准的住房中, 有12小时的黑暗到12小时的光循环。在标准化时间开始实验, 以避免生理影响, 通常在早晨打开灯后不久。</li>
</ol>2. 解决方案准备
<ol><li>在双蒸馏 h2o (ddh2o)中溶解8.4 毫克粉末介质, 并使用 hcl 或 naoh 将 ph 值调整到 ...

<ol>
	<li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival.">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113 (2017).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina.">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li><li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. 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N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina.">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li></ol>

ocr 和 ecar 很容易测量在解释视网膜组织使用生物分析仪使用所述的技术。此方法在几个关键步骤中与其他组的方法不同。视网膜组织是通过一个大的角膜切口分离而不是在地球上摘除的, 正如温克勒15 最初所描述的那样。这种视网膜隔离方法允许从活眼快速转移到组织捕捉板 (通常在5分钟内)。在整个过程中, 组织保持在 37°c, 比放在冰上时更好地保持细胞呼吸。使用最少添加剂?...

视网膜是中枢神经系统中能量要求最高的组织之一 1.与大多数组织一样, 它通过细胞溶胶中的糖酵解或线粒体中的氧化磷酸化生成三磷酸腺苷 (atp)。氧化磷酸化比糖酵解产生 atp 的高能优势是显而易见的:36 分子的 atp 产生的前者与2分子产生的 atp产生后者。因此, 视网膜神经元主要依靠线粒体呼吸来获得能量供应, 这反映在它们的高密度线粒体2上。然而, 即使氧气丰富, 视网膜也严重依赖糖酵解机械。奥托尔·沃堡3号最初在癌细胞中描述了这种有氧糖酵解的过程, 他曾经指出, 视网膜是唯一能够产生这种代谢形式的有丝分裂后组织.自从这些初步观察, 许多有丝分裂后的组织已被描述为从事不同程度的糖酵解, 除了氧化磷酸化, 以满足他们的 atp 需求。
光转导、视觉色素回收、光感受器外段的生物合成和突触活动都是光感受器中的能量要求过程, 是视网膜中的主要神经元亚类。但在神经元1中, 积极地根据其电梯度和浓度梯度运输离子的需要是迄今为止最有活力的消耗过程。光感受器是一种特殊的神经元, 因为它们在没有刺激的情况下 (即在黑暗中) 会去极化, 而光刺激会触发通道闭合和随后的超极化。因此, 在黑暗中, 视网膜消耗大量的 atp 来维持其去极化或通常所说的 "暗流"。从适应性的角度来看, 提供大量 atp 的一个主要挑战是生物体需要通过光轴保持视觉清晰度。在现代生物中看到的倒置视网膜结构是主要的解决方案, 因为它使密集的毛细管网络远离光的路径提供光感受器。但这种自然生物工程的奇迹使视网膜在代谢储备方面处于悬崖状态。即使是对视网膜的小侮辱, 也有可能破坏能源供应与需求的微妙平衡, 视觉功能障碍或坦率失明可能会很快接踵而至。
鉴于神经视网膜独特的能量需求, 再加上其对血管供应的严格限制, 准确测量视网膜中 atp 的消耗及其在疾病期间的变化可能对理解和治疗产生深远的影响。致盲疾病, 如视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变。传统上, 这些测量需要昂贵的、定制设计的设备, 大多数研究来自于少数完全致力于测量代谢活动2,5, 6、 7,8。技术包括针对特定代谢物的单独检测、使用无线电标记前体的示踪剂研究、使用克拉克电极的耗氧量记录以及代谢组学特征分析 9。
随着高通量技术的进步和商业设备供应的增加, 记录视网膜代谢的技术越来越容易获得, 而且价格也越来越实惠。这里描述的方法测量氧化磷酸化和糖酵解在视网膜使用解释组织和一个商业上可用的细胞外通量分析仪9,10,11, 12.该分析仪单独记录耗氧率 (ocr) 和细胞外酸化率 (ecar), 分别作为氧化磷酸化和糖酵解的间接指标 13.这些测量是通过一个埋在所关注组织上的微腔内的探针完成的。这种对先前公布的方法的调整使用了最初为朗格汉胰岛设计的捕获板, 记录小鼠视网膜小的圆形部分的代谢活动。由于该系统包含每个样品井的4个注射端口, 因此在一次记录过程中, 可以将多种药物暴露传递给组织。使用该系统与单独的协议优化 ecar 和 ocr 记录, 野生类型视网膜的反应可以比较视网膜缺乏传感器(gnat1-/-), 一个先天性固定夜盲症的原因人类14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:777px;" width="778">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td style="width:155px;">Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:337px;">Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>101174-100</td>
			<td style="width:167px;">Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640 Media (Powdered medium)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R1383</td>
			<td style="width:167px;">RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td style="width:167px;">1M D-Glucose filtered, for media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25000CI</td>
			<td style="width:167px;">100 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Antimycin-A</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">FCCP</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Rotenone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">2-deoxyglucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td style="width:167px;">Glycolysis protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">1 mm skin biopsy punches with plunger</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>33-31AA-P/25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Mini-Forceps Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11200-10</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont #7 Forceps - Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td style="width:167px;">Loading normalization assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base (Tris base)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>&#160;Strain 000664</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+&#160;</td>
			<td colspan="2">Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis

高敏锐度视觉是一个消耗大量能源的过程, 视网膜已经开发了几个独特的适应, 以精确地满足这些需求, 同时保持视觉轴的透明度。这种微妙平衡的扰动会导致致盲疾病, 如糖尿病视网膜病变。因此, 了解疾病期间视网膜能量代谢的变化, 对于开发合理的治疗各种原因的粘滞丢失至关重要。最近出现的商业细胞外通量分析仪使视网膜能量代谢的研究更容易获得。该协议描述了使用这种分析仪来测量通过其两个主要武器-氧化磷酸化和糖酵解-通过量化氧气消耗率 (ocr) 和细胞外的变化对视网膜能量供应的贡献酸化率 (ecar) 作为这些途径的代理。这项技术很容易在视网膜组织的移植中进行, 有助于在一个实验中评估对多种药理制剂的反应。利用该方法将缺乏棒光感受器信号的动物视网膜的代谢特征与野生型对照进行了比较。这项技术的一个主要局限性是缺乏区分光适应和暗适应能量利用的能力, 这是视网膜组织中的一个重要的生理考虑因素。

利用所述技术 (如图 1所示), 将8个一周龄野生小鼠的视网膜外植体与零小鼠 (gnat1-/-)的年龄和背景匹配的传感器进行了比较. 由于gnat1--/-动物缺乏关闭环核苷酸门控离子通道以响应光刺激的机制, 它们的棒光感受器即使在光14中也能保持去极化状态.随后需要保持钾的流出将产生大量的 atp 需求, 导致...

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Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

细胞外通量分析技术在视网膜组织外种中的能量代谢测定

该技术描述了使用细胞外助焊剂分析仪实时记录小鼠视网膜组织的耗氧量和细胞外酸化率。

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

此方法可以帮助回答关键问题，例如视网膜组织中的能量代谢在生物样本之间如何不同，或在接触药理剂后。该技术的主要优点是，它利用外植的有机视网膜组织来测量糖解和氧化磷酸化的速率，并允许评估体外实时干预。要校准细胞外通量测定的仪器，首先在24个井传感器盒的每个井中加入一毫升的校准溶液，并在37摄氏度的Co2无培养箱中孵育过夜。将线粒体应力协议或糖解协议中的添加剂加载到传感器盒上的每个喷油器端口中，根据井中的体积变化进行调整。假设初始井容量为 450 微升，典型的测定将包括 45 微升的添加剂进入第一喷油器端口，49.5 微升进入第二个喷油器端口，54.5 微升进入第三个喷油器，60 微升进入最后。在前几次实验中，将基座介质加载到端口 A 中，以测量端口注射后发生的组织运动伪影量。允许加载的传感器板在非 Co2 培养箱中以 37 摄氏度孵育至少 60 分钟。开始用新鲜安乐死小鼠隔离新鲜小鼠视网膜组织。使用一对中等大小的弯曲钳子抓住视神经的后球，轻轻施加向前压力来支撑眼睛。使用干净的剃须刀刀片，使用刀片的单个故意通过，在角膜上创建边缘切口。使用细角麦克弗森风格的钳子，捏后球，以表达镜头和前催眠膜的角膜切口。用钳子重复捏合动作以表达神经视网膜。然后，像勺子一样用钳子将视网膜从角膜切口上抬开。将视网膜直接放入三厘米的培养皿或六井组织培养簇盘中的暖介质中。接下来，使用两对细角麦克弗森的风格钳子轻轻地解剖视网膜上剩余的视网膜。这是最好的工作，通过抓住视网膜杯外围的玻璃，并拉向中心，最终分离的玻璃体从整个中心。然后，从视网膜的光受体表面去除任何残留的视网膜色素上皮。用剃须刀切割 P1000 移液器尖端，以创建大约 4 毫米的开口，以防止在转移过程中对细腻的视网膜组织造成不必要的创伤。然后，使用切割移液器尖端将分离的视网膜组织转移到新鲜介质中。最后，使用配备柱塞的一毫米活检孔，在视神经周围切割视网膜的冲孔。将视网膜冲孔放在干净的介质上，保存在 37 摄氏度的方块上，或加热垫上。收集到所需的冲孔数后，使用可爱的 P1000 尖端在 450 微升介质中吸气单个冲孔，并将其转移到 37 摄氏度热垫或热块上的 24 孔眼皮捕获微板。使用精细、直钳轻轻操纵冲孔进入微板的中心。保持冲孔朝向同一方向。例如，用结节细胞侧向上。对于每个实验，留出三到四个空白井，其中450个微升基介质作为负控制。在避免气泡或过度移动的同时，轻轻地将小孔捕获网格插入到每个孔中，并将刀片用金属柱塞或切割的 P1000 移液器尖端固定。虽然微型腔室有足够的深度来容纳典型的小鼠视网膜，但偶尔网状插入中的机器缺陷会导致组织在屏幕插入过程中变得过度压缩。如果发生这种情况，只需记下这种粉碎的组织，然后从最终分析中排除该样本。在37摄氏度的二氧化碳无二培养箱中孵育组织板至少60分钟。使用混合、重量、测量和重复命令对额外的蜂窝通量分析仪进行编程。例如，视网膜组织的典型实验可能包括以下内容。混合两分钟，等待两分钟，测量五分钟。重复实验，这三个步骤在五到八次之间进行基准线记录，并在测试的每个化合物注射后重复。按细胞外通量分析仪上的程序启动按钮，然后按照屏幕上的说明插入传感器盒进行校准。在校准结束时，按照屏幕上的说明将校准板替换为包含视网膜样本的板，然后允许程序按照编程运行。运行完成后，按照屏幕上的说明弹出组织板。查看运行结果并存储数据文件。用弯曲的 20 表针和钳子，从井中去除所有网状刀片，留下视网膜冲头。小心地从组织中吸出培养基，用0.5毫升的冷磷酸盐缓冲盐水洗涤组织两次。吸气第二次PBS洗涤后，每次洗涤时加入100微升的解液缓冲液，并上下移液器进行均质化组织。最后，通过一对一稀释 1 个 lysed 样品，用 100 微升 Tris-EDTA 缓冲液，将稀释样品的 100 微升转移到 96 井板，根据总双绞合 DNA 含量对输入电平进行定量。然后，向每个井添加 100 微升检测缓冲器，混合两到五分钟。最后，通过与标准曲线比较，在480纳米的激发和520纳米的发射后量化荧光。将原始的细胞外通量追溯到井内的DNA含量。在基准线上，在5毫毫升葡萄糖存在的情况下，在10毫摩尔丙酮酸酯的存在下，以细胞外酸化率测量的酸脂率没有显著差异。在视网膜组织之间，来自枯萎型动物，或淘汰缺乏机制关闭循环核苷酸门离子通道以响应光刺激的小鼠。在添加20毫耳血糖和糖解抑制剂2DG后，也可以看到类似的模式。这些数据可能在数学上转换，以表示基线的分数变化，这种格式可以可以更好地比较不同的实验干预。基线的绝对耗氧率在控制和突变视网膜组织之间也是等值的。增加20毫摩尔葡萄糖会增加线粒体呼吸，但在绝对定量或基线变化方面，各组之间观察到的呼吸没有变化。添加一毫升穆勒FCCP，一种未脱钩剂，以证明最大的线粒体呼吸速率不会显著增加OCR高于高葡萄糖在控制和突变视网膜组织的水平。然而，在加入RAA鸡尾酒后，来自两只小鼠的信号急剧下降。最后，我们演示了一种在小鼠视网膜的有机体外阴中氧化磷酸化和糖解率的定量技术。通过有效隔离视网膜组织，该技术可进行可靠且可重复的测量。可以评估暴露的实时影响，如脱钩剂。除了这个程序，其他方法，如定量RTPCR和西印迹，可以在解剖步骤中分离的余组织上执行，以获得与视网膜代谢研究相关的平行信息。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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胞外多糖的OLIGO质谱分析（OLIMP）

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定量测量的侵袭伪足介导的细胞外基质蛋白水解单和多细胞的情况下

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细胞外离子流的使用离子选择性自引用的微电极技术测量

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

测量外产酸和分析，以确定糖酵解率

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

小鼠原发性肾管上皮细胞的分离、鉴定及高通量的细胞外流量分析

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

激光捕获微分块RNA-测序空间和时间组织特异性基因表达分析

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

使用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞和原始祖细胞中的细胞生物能量学

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...