Name: measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

אנו מודים ד ר אלכסנדר Kolesnikov, ד ר ולדימיר Kefalov על מתן Gnat1- / -עכברים, משוב מועילים ועצות, ולכל לקרוא את כתב היד.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY025269 (RR), המרכז לחקר הסוכרת באוניברסיטת וושינגטון - NIH DK020579 (JRM ו- RR), פרס פיתוח הקריירה מן המחקר כדי למנוע עיוורון (RR), קרן Horncrest (RR), פרס פיתוח הקריירה של האגודה לסוכרת נעורים ( JRM), DK101392 NIH (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS), DK114233 (JRM).

פרוטוקולים עקב האגודה לחקר חזון והצהרת רפואת עיניים עבור שימוש של בעלי החיים ואושרו על-ידי אוניברסיטת וושינגטון.
1. הכנה בעלי חיים
<ol><li>לשמור חיות בדיור סטנדרטי עם 12 שעות כהה מחזור אור 12 שעות. בגין ניסויים ב סטנדרטית פעמים כדי למנוע תופעות היממה, בדרך כלל בבוקר זמן קצר לאחר א...

<ol>
	<li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function:+high+cost+of+Na++transport.">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration.">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).</li><li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers.">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li><li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging.">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function.">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival.">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113 (2017).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina.">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li><li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proton+and+electron+leaks.">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina.">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li></ol>

OCR, ECAR נמדדים ברצון ברקמת הרשתית explanted באמצעות bioanalyzer תוך שימוש בטכניקות המתואר. שיטה זו יוצאת מאלו של קבוצות אחרות במספר שלבים קריטיים. רקמות ברשתית מבודדים דרך חתך גדול הקרנית ללא enucleating העולם, כפי שהם במקור מתוארת על ידי וינקלר15. שיטה זו של בידוד ברשתית מאפשר העברה מהירה מעינ?...

הרשתית היא בין הרקמות ביותר דורש אנרגיה מערכת העצבים המרכזית1. כמו רוב רקמות, שהיא מייצרת אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך גליקוליזה ב זרחון חמצוני ציטוזול או דרך בתוך המיטוכונדריה. היתרון האנרגטי של זרחון חמצוני על גליקוליזה לייצר ATP ממולקולה אחת של גלוקוז נקי: 36 מולקולות של ATP שנוצר מתוך לשעבר לעומת 2 מולקולות של ATP שנוצר האחרון. בהתאם לכך, הנוירונים ברשתית תלויים בעיקר נשימה מיטוכונדריאלי לאספקת אנרגיה, זה משתקף על ידי שלהם צפיפות גבוהה של המיטוכונדריה2. ובכל זאת, הרשתית גם מסתמכת במידה רבה על מכונות glycolytic גם כאשר חמצן בשפע. תהליך זה של אירובי גליקוליזה תוארה לראשונה על ידי אוטו ורבורג3, מי פעם ציין, כי הרשתית הרקמה רק שלאחר mitotic מסוגל צורה זו של חילוף החומרים4בתאים סרטניים. מאז תצפיות ראשוניות אלה, ברקמות רבות שלאחר mitotic תוארו לעסוק בדרגות שונות של גליקוליזה בנוסף זרחון חמצוני כדי לענות על דרישותיהם ATP.
Phototransduction, פיגמנט חזותי מיחזור, ביוסינטזה של מקטעי החיצוני קולט אור, בפעילות הסינפטית הם כל התהליכים תובעניים אנרגיה photoreceptors, מחלקת המשנה השולט עצביים ברשתית. אך הצורך להעביר באופן פעיל יונים נגד שלהם חשמל ומעברי הריכוז הוא עד כה התהליך לארוך ביותר אנרגטית נוירונים1. Photoreceptors הם נוירונים מוזר במובן שהם אינם depolarized בהיעדר גירוי (קרי, בחושך), ואילו גירוי אור מפעילה ערוץ הסגר, hyperpolarization הבאים. לכן, בחושך, הרשתית צורכת כמויות גדולות של ATP כדי לשמור על דפולריזציה או "זרם אפל" שלה, כפי שהיא מכונה בדרך כלל. מההיבט אדפטיבית, הוא אתגר גדול באספקת אלה כמויות אדירות של ATP עבור אורגניזמים לשמור על בהירות חזותית באמצעות לציר האופטי. הארכיטקטורה ברשתית הפוך אצל יצורים מודרני הוא הפתרון דומיננטי, כמו זה שומרת את הרשת נימי צפופה הספקת photoreceptors לברוח מדרכו של אור. . אבל זה מעורר פליאה bioengineering טבעי מקומות הרשתית צוק במונחים של שמורת מטבולית. עלבונות קטן אפילו לרשתית פוטנציאלי יכול לשבש את האיזון העדין של אספקת אנרגיה לדרוש, תפקוד חזותי או עיוורון פרנק עשוי לנבוע במהירות.
בהתחשב הדרישות האנרגטי הייחודי של הרשתית עצבית, בשילוב עם הגבלה חזק של אספקת הדם, מדידה מדויקת של צריכת ATP הרשתית ואת שלו משתנה במהלך המחלה עשויות להיות השלכות עמוקה תוך הבנה וטיפול מעלף מצבים כגון רטיניטיס פיגמנטוזה רטינופתיה סוכרתית. באופן מסורתי, מדידות אלה דורשים ציוד יקר, אישית מעוצבת עם רוב המחקרים מתוך קומץ של מעבדות שכולו מוקדש מדידות של פעילות חילוף החומרים2,5,6, 7,8. טכניקות כוללים מבחני בודדים של המטבוליטים ספציפיים, מחקרים מעקב באמצעות התווית על-ידי רדיו סימנים מקדימים, צריכת חמצן הקלטה באמצעות אלקטרודות קלארק, ו metabolomic פרופיל9.
עם ההתקדמות בטכנולוגיית תפוקה גבוהה וזמינות מוגברת של התקנים מסחריים, טכניקות כדי הרשומה מטבוליזם ברשתית הם יותר ויותר נגיש וזול. השיטה המתוארת כאן מודד בשני זרחון חמצוני, גליקוליזה רשתית העין באמצעות explanted רקמות ו זמין מסחרית השטף חוץ-תאית מנתח9,10,11,12. זה מנתח מתעדת בנפרד קצב צריכת החמצן (OCR), שער חוץ-תאית acidification (ECAR), הגשה אינדיקטורים עקיף של זרחון חמצוני, גליקוליזה, בהתאמה13. מדידות אלה נעשית על ידי בדיקה submersed במרחק microchamber שנוצרו על הרקמה של ריבית. זה עיבוד של שיטות שפורסמו בעבר משתמש צלחת לכידת תוכנן במקור עבור לנגרהנס בלבלב כדי להקליט את פעילות חילוף החומרים בסעיפים קטנים, עגולים של רשתית העכבר. חשיפות מרובות תרופתי יכול להיות מועברת הרקמה במהלך הקלטה יחיד כי המערכת מכילה 4 יציאות הזרקת עבור כל דגימה. טוב. באמצעות מערכת זו עם פרוטוקולים נפרד אופטימיזציה עבור הקלטות ECAR, OCR, התגובות של פראי-סוג באדמומיות ניתן להשוות הרשתיות חסר transducin (Gnat1- / -), סיבת עיוורון לילה נייח מולדות ב בני14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:777px;" width="778">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td style="width:155px;">Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:337px;">Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>101174-100</td>
			<td style="width:167px;">Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640 Media (Powdered medium)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R1383</td>
			<td style="width:167px;">RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td style="width:167px;">1M D-Glucose filtered, for media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25000CI</td>
			<td style="width:167px;">100 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Antimycin-A</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">FCCP</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Rotenone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">2-deoxyglucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td style="width:167px;">Glycolysis protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">1 mm skin biopsy punches with plunger</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>33-31AA-P/25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Mini-Forceps Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11200-10</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont #7 Forceps - Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td style="width:167px;">Loading normalization assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base (Tris base)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>&#160;Strain 000664</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+&#160;</td>
			<td colspan="2">Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis

חזון חדות גבוהה היא תהליך בכבדות הצורכים אנרגיה, הרשתית פיתחה מספר עיבודים ייחודיים לדרישות בדיוק כזה תוך שמירה על שקיפות של הציר חזותי. לפליטת כדי איזון עדין זה לגרום מחלות מסנוור, כגון רטינופתיה סוכרתית. לכן, ההבנה של האנרגיה חילוף החומרים משתנה ברשתית במהלך המחלה הכרחי להתפתחות של טיפולים רציונלי עבור גורמים שונים של אובדן vison. הופעתו האחרונה של מנתחי השטף חוץ-תאית זמין מסחרית הפך המחקר של חילוף החומרים האנרגיה ברשתית נגיש יותר. פרוטוקול זה מתאר את השימוש כזה מנתח כדי למדוד את התרומות לאספקת אנרגיה ברשתית באמצעות זרועותיה עיקרון שני - זרחון חמצוני, גליקוליזה - מאת לכימות שינויים בשערי צריכת חמצן (OCR), חוץ-תאית המחירים acidification (ECAR) כאל שליחים עבור המסלולים הללו. טכניקה זו מבוצעת בקלות ברקמת הרשתית explanted, הקלה על הערכה של התגובות מרובות סוכנים תרופתי בניסוי יחיד. חתימות מטבולית הרשתיות מחיות חסר רוד קולט אור איתות מושווים לפקדים פראי-סוג בשיטה זו. מגבלה משמעותית בטכניקה זו הוא חוסר היכולת להבחין בין ניצול האנרגיה הותאם-אור, dark-adapted, שיקול חשוב הפיזיולוגיות ברקמת הרשתית.

תוך שימוש בטכניקות המתואר (מסוכם באיור1), explants ברשתית מ 8 בת שבוע פראי סוג (WT) עכברים היו לעומת גיל - ועל רקע-מתאימים transducin null עכברים (Gnat1- / -). כי Gnat1- / - בעלי חיים חסרי המכונות כדי לסגור מחזורית-נוקלאוטיד מגודרת תעלות יונים בתגובה לגיר...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כגון כיצד חילוף החומרים של האנרגיה ברקמת הרשתית שונה בין דגימות ביולוגיות, או לאחר חשיפה לסוכנים פרמקולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת ברקמת רשתית אורגנותית מופרשת כדי למדוד שיעורים של גליקוליזה, וזרחון מחומצן ומאפשר הערכות של התערבויות בזמן אמת במבחנה. כדי לכייל את המכשור עבור מישן שטף חוץ-תאי, הוסף תחילה מיליליטר של תווי כיול לכל באר של מחסנית החיישנים של 24 הבאר, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא Co2 במהלך הלילה.טען תוספים עבור פרוטוקול הלחץ המיטוכונדריאלי, או פרוטוקול הגליקוליזה לכל יציאת מזרק במחסנית החיישן, תוך כוונון לשינויי נפח באר. בהנחה נפח באר ראשונית של 450 microliters, בדיקה טיפוסית תכלול 45 microliters של תוסף לתוך יציאת המזרק הראשון, 49.5 microliters ב השני, 54.5 microliters לתוך השלישי, ו 60 microliters עד האחרון. במהלך הניסויים הראשונים, לטעון בסיס בינוני לתוך יציאה A כדי לאמוד כמה חפץ תנועת רקמות מתרחשת לאחר הזרקת יציאה.אפשר לצלחת החיישן הטעון להידגר ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור שאינו Co2 למשך 60 דקות לפחות. התחל בידוד של רקמת רשתית עכבר טרי עם עכבר מרופד טרי. השתמש בזוג ממטרים מעוגלים בגודל בינוני כדי לתפוס את הגלובוס האחורי בעצב הראייה, ולהחיל בעדינות לחץ קדימה כדי להניע את העין.עם סכין גילוח נקי, צור לימבוס לחתך לימבוס על פני הקרנית באמצעות מעבר יחיד ומכוון של הלהב. באמצעות מדפים בסגנון מקפרסון בזווית עדינה, צובטים את הגלובוס האחורי כדי לבטא את העדשה ואת קרום ההילואידים האחורי מתוך החתך הקרנית. חזור על תמרון הצביטה עם מטלות כדי לבטא את הרשתית העצבית.לאחר מכן, השתמש במקלות כמו כף כדי להרים את הרשתית הרחק החתך הקרנית. מניחים את הרשתית ישירות לתוך המדיום החם בצלחת של שלושה סנטימטרים, או צלחת אשכול תרבות רקמות שש באר. לאחר מכן, השתמש בשני זוגות של מטלשי הסגנון של מקפרסון בזווית עדינה כדי לנתח בעדינות את הזייפים הנותרים מהרטינה.הדבר נעשה בצורה הטובה ביותר על ידי תפיסת ההוויה בפריפריה של גביע הרשתית, ומושך לכיוון המרכז, עם disinsertion הסופי של הגוף ההגשום מהמרכז בכללותו. לאחר מכן, להסיר כל אפיתל פיגמנט רשתית שיורית מפני השטח קולטן צילום של הרשתית. חותכים קצה פיפטה P1000 עם סכין גילוח כדי ליצור פתח משוער ארבעה מילימטר כדי למנוע טראומה מיותרת לרקמת הרשתית העדינה במהלך תמרוני העברה.לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה לחתוך להעביר את רקמת הרשתית מבודדת לתוך מדיום טרי. לבסוף, להשתמש אגרוף ביופסיה מילימטר אחד מצויד בוכנה, כדי לחתוך אגרופים של רשתית סביב עצב הראייה. מניחים את האגרופים ברשתית בצד במדיום נקי, נשמר על בלוק 37 מעלות צלזיוס, או כרית חימום.לאחר איסוף מספר האגרופים הרצוי, השתמש בקצה P1000 חמוד כדי לשאיף אגרוף בודד ב-450 מיקרוליטרים של מדיום, והעבר אותו לצלחת מיקרו לכידת עפעפיים באורך 24 מעלות על כרית חום או בלוק חום של 37 מעלות צלזיוס. השתמש במדפים ישרים עדין כדי לתפעל בעדינות אגרופים למרכז צלחת המיקרו. שמור על אגרופים מכוונים באותו כיוון.לדוגמה, כאשר צד תא הגנגליון כלפי מעלה. עבור כל ניסוי להפריש שלוש עד ארבע בארות ריקות עם 450 microliters של מדיום הבסיס לשמש פקדים שליליים. תוך הימנעות בועות אוויר או תנועה מוגזמת, בעדינות למקם את העין ללכוד רשת מוסיף לתוך כל באר, ולאבטח את מוסיף עם בוכנה מתכת או עם קצה פיפטה P1000 לחתוך.למרות שלמיקרו-תא יש עומק הולם כדי להכיל רשתית עכבר טיפוסית, מדי פעם פגמים במכונה במוסיף הרשת גורמים לרקמות להידחס יתר על מדי במהלך החדרת המסך. אם זה קורה, פשוט רשום את הרקמה המרוסקת הזו, ואל תכלול את הדגימה מהניתוח הסופי. הדגירה את צלחת הרקמה באינקובטור ללא פחמן דו חמצני 37 מעלות לפחות 60 דקות.תכנת את מנתח השטף התאי הנוסף באמצעות פקודות ערבוב, משקל, מדידה וחזרה. כדוגמה, ניסוי טיפוסי עם רקמת רשתית עשוי לכלול את הדברים הבאים. מערבבים שתי דקות, מחכים שתי דקות, ומודדים חמש דקות.חזור על הניסוי עם שלושה שלבים אלה בין חמש לשמונה פעמים עבור הקלטת קו הבסיס, ולאחר הזרקה של כל תרכובת נבדק. לחץ על לחצן ההפעלה של התוכנית במנתח השטף החוץ-תאי ובצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי להכניס את מחסנית החיישן לכיול. בסוף הכיול, בצע את ההוראות על המסך כדי להחליף את הלוח כיול עם הלוח המכיל את דגימות הרשתית, ולאחר מכן לאפשר לתוכנית לפעול כ מתוכנת.בסיום הריצה, בצע את ההוראות על המסך כדי להוציא את לוחית הרקמה. הצג את תוצאות הריצה ואחסן את קובץ הנתונים. עם מחט מכופפת 20 מד ומדפים, להסיר את כל מוסיף רשת מן בארות, משאיר את אגרוף הרשתית מאחור.בזהירות שאפו את המדיום מן הרקמה, ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 0.5 מיליליטר של מלוחים פוספטים קרים. לאחר שאיפה לשטוף PBS השני, להוסיף 100 microliters של חיץ תמוגה לכל לשטוף, ואת פיפטה למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה של רקמה. לבסוף, לכמת את רמות הקלט בהתבסס על תוכן ה-DNA כפול תקוע הכולל על ידי דילול דגימות lysed אחד לאחד, עם 100 microliters של מאגר טריס-EDTA, והעברת 100 microliters של המדגם מדולל לצלחת 96 היטב.לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של מאגר זיהוי לכל באר ומערבבים במשך שתיים עד חמש דקות. לבסוף, לכמת את הצמחייה לאחר גירוש ב 480 ננומטר ו פליטה ב 520 ננומטר על ידי השוואה עקומה סטנדרטית. לנרמל את מעקב שטף חוץ תאי גלם לתוכן ה-DNA בתוך באר.בקו הבסיס, בנוכחות חמישה מילי סוכר מולר בנוכחות 10 מילי מולר פירובט, אין הבדל משמעותי בשיעורי eflux חומצה, נמדד על ידי קצב חומציות חוץ תאית. בין רקמות רשתית מבעלי חיים מסוג wile, או לדפוק את העכברים כי חסרים את המכונות כדי לסגור תעלות יון מגודר נוקלאוטידים מחזוריים בתגובה לגירויים אור. דפוסים דומים נראים לאחר תוספת של 20 מילי סוכר מולר מעכבי גליקוליטי 2DG.נתונים אלה עשויים להשתנות מתמטית כדי לייצג שינויים חלקיים מקו הבסיס, תבנית שעשויה לאפשר השוואה טובה יותר בין התערבויות ניסיוניות שונות. קצב צריכת חמצן מוחלט בבסיס גם שווה ערך בין שליטה לרקמת רשתית מוטנטית. תוספת של 20 מילי מולר גלוקוז מגביר את הנשימה המיטוכונדריאלית, אבל אין שינוי שנצפה בין קבוצות במונחים של כימות מוחלט או במונחים של שינוי מקו הבסיס.התוספת של אחד מילי מולר FCCP, סוכן ניתוק, כדי להדגים שיעורי נשימה מיטוכונדריאליים מקסימלית אינה להגדיל באופן משמעותי OCR מעל לרמה לראות עם גלוקוז גבוה בשליטה רקמת רשתית מוטציה. עם זאת, אותות משני העכברים לרדת באופן דרסטי לאחר תוספת של קוקטייל RAA. לסיכום, אנו מדגימים טכניקה לכימות שיעורים של זרחון מחומצן וגליקוליזה במתפוצצים אורגנוטיים של רשתית העכבר.עם בידוד יעיל של רקמת הרשתית, הטכניקה מניבה מדידות אמינות הניתנות לניתוב מחדש. השפעות בזמן אמת של חשיפות, כגון סוכנים בלתי מפרידים, ניתן להעריך. בנוסף להליך זה, שיטות אחרות, כמו RTPCR כמותי סופג המערבי, ניתן לבצע על הרקמה העודפת מבודד בשלב הניתוח כדי לקבל מידע מקביל רלוונטי למחקרים של חילוף החומרים ברשתית.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

אוליגו פרופיל המוניים (OLIMP) של סוכרים תאית

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

מדידה וניתוח של תאי ייצור חומצה לקביעת glycolytic דרג

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...