Name: measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

우리 박사 알렉산더 Kolesnikov와 박사 블라디미르 Kefalov 제공에 감사 Gnat1/-마우스, 유용한 피드백과 조언, 그리고 원고를 읽고.
이 작품에서 NIH EY025269 (RR), 워싱턴 대학-NIH DK020579에서 당뇨병 연구 센터를 지원 했다 (JRM 및 RR), 실명 방지 (RR), Horncrest 재단 (RR), JDRF (에서 경력 개발 상 연구에서 경력 개발 수상 JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS), 및 DK114233 (JRM).

프로토콜 비전에서 연구를 위한 협회와 동물의 사용에 대 한 안과 문을 고 워싱턴 대학에 의해 승인 했다.
1. 동물 준비
<ol><li>동물에에서 계속 12 시간으로 표준 주택 어두운 12 시간 빛 주기. 시작에서 실험 시간을 잠시 후 조명이 켜져 아침에 일반적으로 circadian 효과 피하기 위해 표준화.</li>
</ol>2. 솔루션 준비
<ol><li>8.4 mg 더블 소 주 H2O 가루 미디?...

<ol>
	<li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function:+high+cost+of+Na++transport.">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration.">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).</li><li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers.">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li><li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging.">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function.">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival.">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113 (2017).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina.">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li><li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proton+and+electron+leaks.">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina.">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li></ol>

OCR과 ECAR explanted 망막 조직 설명 된 기술을 사용 하 여 bioanalyzer를 사용 하 여 쉽게 측정 됩니다. 이 메서드는 몇 가지 중요 한 단계에서 다른 그룹의 출발. 망막 조직 윈 클 러15에 의해 원래 기술 세계를 enucleating 없이 큰 각 막 절 개를 통해 격리 됩니다. 망막 분리의이 방법 (5 분) 안에 종종 조직 캡처 접시에 살아있는 눈에서 빠른 전송에 대 한 수 있습니다. 조직 세포 호흡을 얼음...

망막은 중추1에서 가장 에너지 요구 하는 조직 중 하나입니다. 대부분 조직 같이 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 통해 분해 cytosol 또는 통해 산화 인 산화에서 미토 콘 드리 아에서 생성합니다. 포도 당 한 분자에서 ATP를 생산 하기 위해 분해 산화 인 산화의 활기찬 장점은 분명 하다: 후자에서 생성 된 ATP의 2 분자는 전 대 에서 생성 된 atp 36 분자. 따라서, 망막 신경 세포는 주로 에너지 공급에 대 한 미토 콘 드리 아 호흡에 따라,이 미토 콘 드리 아2의 그들의 높은 밀도 의해 반영 됩니다. 그러나, 망막 또한 무 겁 게에 의존 glycolytic 기계 산소 풍부한 경우에 합니다. 이 과정은 호 기성 분해 원래 오토 바르 부르 크3, 한 번 망막이이 형태의 대사4수만 포스트 mitotic 조직 이었다고 언급 하 여 암 세포에 설명 했다. 그 초기 관측 이후 많은 포스트 mitotic 조직 그들의 ATP 요구를 충족 시킬 뿐만 아니라 산화 인 산화 분해의 다양 한 각도에 종사 하 설명 했습니다.
Phototransduction, 시각적인 안료 재활용, 포토 리셉터 외부 세그먼트, 및 시 냅 시스 활동의 생 합성 하는 대뇌, 망막의 우세 신경 하위 클래스에서에서 모든 에너지 요구 프로세스. 하지만 적극적으로 그들의 전기에 대 한 이온 농도 기온 변화도 수송 하는 필요 지금까지 신경1에서 가장 정력적으로 소모 되는 과정입니다. 대뇌는 가벼운 자극 유발 채널 폐쇄 및 후속 hyperpolarization 반면 그들은 (즉, 어둠 속에서), 자극의 부재에서 depolarized는 의미에서 독특한 신경. 따라서, 어둠, 망막 대량의 ATP의 도발은 또는 "전류"로 일반적으로 불리는를 유지 하기 위해 사용 합니다. 적응의 관점에서 이러한 방대한 양의 ATP 공급 하는 주요 과제 광 축 통해 시각적 선명도 유지 하기 위해 유기 체를 위한 필요 이다. 현대 생물에서 거꾸로 망막 아키텍처는 지배적인 솔루션 공급 하는 빛의 경로에서 대뇌 조밀한 모 세관 네트워크 유지. 하지만 자연 생명 공학의이 놀라운 변화 준비에서 절벽에 망막 장소. 망막에도 작은 모욕 잠재적 수요, 에너지 공급의 섬세 한 균형을 혼란 시킬 수 있다 그리고 시각 장애 또는 솔직 실명 빠르게 ensue 수 있습니다.
혈관 공급의 그것의 단단한 제한 함께 신경 망막의 독특한 에너지 수요를 감안할 때 질병 동안 망막 및 그것의 변화에서 ATP 소비의 정확한 측정 이해 하 고 치료에 깊은 의미를 가질 수 있습니다. 당뇨병 성 망막 증 망막 화 등 눈부신 조건. 전통적으로, 이러한 측정 신진 대사 활동2,5,6,의 측정에 전적으로 헌신 하는 실험실의 소수에서 나오는 대부분의 연구 비용이 많이 드는, 맞춤형 장비를 필요로 7,8. 기술은 특정 대사 산물, 라디오 라는 선구자, 클라크 전극, 및9를 프로 파일링 하는 metabolomic를 사용 하 여 녹음 하는 산소 소비를 사용 하 여 추적 연구에 대 한 개별 분석을 포함 한다.
진보와 함께 높은 처리 기술 및 상용 장치의 증가 가용성, 기술 기록 망막 물질 대사에 점점 접근 가능 하 고 저렴 한 있습니다. 여기 설명 하는 방법을 모두 산화 인 산화 하 고 망막을 사용 하 여 분해 explanted 조직 및 상용 세포 외 유출 분석기9,10,,1112. 이 분석기는 별도로 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR), 산화 인 산화 및 분해, 각각13의 간접 지표 역할을 기록 합니다. 이러한 측정은 관심의 조직에 만든 microchamber 내 submersed 프로브에 의해 수행 됩니다. 이전에 게시 방법의이 적응이 원래 췌 장 독도 Langerhans 위한 캡처 플레이트를 사용 하 여 마우스 망막의 작은, 원형 섹션에서 신진 대사 활동을 기록. 다중 pharmacologic 노출 시스템 각 샘플에 대 한 4 주입 포트를 잘 포함 되어 있기 때문에 단일 기록의 과정에서 조직에 전달할 수 있습니다. 별도 프로토콜 ECAR 및 OCR 녹음/녹화에 대 한 최적화 된이 시스템을 사용 하 여, 야생-타입 망막의 반응을 비교 될 수 있다 망막 (Gnat1-/-), transducin 부족에 선 천 성 고정 야 맹 증의 원인 인간14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:777px;" width="778">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td style="width:155px;">Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:337px;">Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>101174-100</td>
			<td style="width:167px;">Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640 Media (Powdered medium)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R1383</td>
			<td style="width:167px;">RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td style="width:167px;">1M D-Glucose filtered, for media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25000CI</td>
			<td style="width:167px;">100 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Antimycin-A</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">FCCP</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Rotenone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">2-deoxyglucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td style="width:167px;">Glycolysis protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">1 mm skin biopsy punches with plunger</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>33-31AA-P/25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Mini-Forceps Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11200-10</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont #7 Forceps - Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td style="width:167px;">Loading normalization assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base (Tris base)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>&#160;Strain 000664</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+&#160;</td>
			<td colspan="2">Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis

높은 시력 비전 무 겁 게 에너지 소모 하는 프로세스 이며 망막 정확 하 게 시각적 축의 투명성을 유지 하면서 이러한 요구를 충족 하기 위해 여러 가지 독특한 적응을 개발 했다. 이 섬세 한 균형에 섭 눈부신 질병, 당뇨병 성 망막 증 등 원인. 따라서, 질병 중 에너지 대사 변화는 망막에 이해 vison 손실의 다양 한 원인에 대 한 합리적인 치료의 발전에 필수적입니다. 상용 세포 외 유출 분석기의 최근 출현은 망막 에너지 대사의 연구를 더 접근 했다. 이 프로토콜은 산소 소비 속도 (OCR)에 변화를 측정 하 여 측정 하는 그것의 2 개의 원리 팔-산화 인 산화 및 분해-통해 망막 에너지 공급에 기여 하는 등 분석기의 사용을 설명 합니다 및 세포 외 산성화 요금 (ECAR)이이 경로 대 한 프록시. 이 기술은 단일 실험에서 여러 pharmacologic 에이전트에 대 한 응답의 평가 촉진 explanted 망막 조직에 쉽게 수행 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 야생-타입 컨트롤 막대 포토 리셉터 신호 부족 한 동물에서 망막에서 대사 서명은 비교 됩니다. 이 기술은 주요 한계 빛 적응 하 고 dark-adapted 에너지 이용, 망막 조직에 중요 한 생리 적인 고려 사항 사이 구별할 수 있는 능력의 부족 이다.

( 그림1에서) 요약 설명한 기법을 사용 하 여, 8 주 된 야생 타입 (WT) 마우스에서 망막 explants는 나이 및 배경 일치 transducin null 쥐 (Gnat1-/-)에 비교 되었다. Gnat1-/- 동물을 기계 부족 하기 때문에 주기적인 뉴클레오티드 문이 빛 자극에 대 한 응답에서 이온 채널, 그들의 막대 대뇌 남아 빛14에 depolarize...

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Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

이 기술은 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 explanted 마우스 망막 조직 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 실시간으로 녹음을 설명 합니다.

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

이 방법은 망막 조직에 있는 에너지 물질 대사가 생물학 견본 사이 또는 약리학 에이전트에 노출 후에 어떻게 다른지와 같은 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 글리코리시스와 산화 된 인산화의 비율을 측정하기 위해 이식 된 organotypic 망막 조직을 활용하고 체외에서 실시간 개입의 평가를 허용한다는 것입니다. 세포외 플럭스 분석에 대한 계측을 보정하려면 먼저 24개의 웰 센서 카트리지의 각 웰에 1밀리리터의 교정 솔루션을 추가하고 하룻밤 동안 Co2 무료 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다.미토콘드리아 응력 프로토콜또는 글리코리시스 프로토콜을 센서 카트리지의 각 인젝터 포트에 적재하여 우물의 부피 변화를 조정합니다. 450 마이크로리터의 초기 음부피를 가정하면, 일반적인 분석에는 제1 인젝터 포트에 첨가제 45 마이크로리터, 두 번째 삽입기 포트에 49.5 마이크로리터, 세 번째마이크로리터54.5 마이크로리터, 마지막까지 60 마이크로리터가 포함됩니다. 처음 몇 가지 실험 동안, 포트 A에 기본 배지를 로드하여 포트 주입 후 발생하는 조직 이동 아티팩트의 양을 측정합니다.로드된 센서 플레이트가 비 Co2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 최소 60분 동안 배양할 수 있도록 허용합니다. 갓 안락사 된 마우스로 신선한 마우스 망막 조직의 격리를 시작합니다. 중간 크기의 곡면 포셉을 사용하여 시신경에서 후방 전세계를 파악하고 전방 압력을 부드럽게 적용하여 눈을 전파합니다.깨끗한 면도날로 블레이드의 의도적인 단일 패스를 사용하여 각막을 가로지르는 림푸스 절개를 만듭니다. 미세 각진 McPherson 스타일 포셉을 사용하여 후면 글로브를 꼬집어 각막 절개에서 렌즈와 전방 hyloid 멤브레인을 표현합니다. 신경 망막을 표현하기 위해 집게로 꼬집기 기동을 반복합니다.그런 다음 숟가락처럼 집게를 사용하여 각막 절개에서 망막을 들어 올립니다. 망막을 3센티미터 접시 또는 6개의 잘 조직 배양 클러스터 플레이트에 직접 넣습니다. 다음으로, 두 쌍의 미세각 맥퍼슨 스타일 포셉을 사용하여 망막에서 남은 유리체를 부드럽게 해부합니다.이것은 망막 컵의 주변에서 유리체를 잡고 중앙으로 당겨중앙을 향해 당겨서 중앙에서 유리체의 최종 분리와 함께 하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음, 망막의 사진 수용체 표면에서 잔류 잔류 안료 상피를 제거한다. P1000 파이펫 팁을 면도날로 잘라 서 약 4밀리미터 개구부를 만들어 이송 기동 중 섬세한 망막 조직에 대한 과도한 외상을 방지합니다.그런 다음 절단 파이펫 팁을 사용하여 격리된 망막 조직을 신선한 배지로 옮길 수 있습니다. 마지막으로 플런저를 장착한 1mm 생검 펀치를 사용하여 시신경 주위의 망막 펀치를 잘라냅니다. 망막 펀치를 깨끗한 매체에 따로 놓고 섭씨 37도 블록 또는 가열 패드에 보관하십시오.원하는 수의 펀치가 수집되면 귀여운 P1000 팁을 사용하여 중간 크기의 450 마이크로 리터에 개별 펀치를 흡입하고 37도 의 섭씨 열 패드 또는 히트 블록에 24 웰 아일렛 캡처 마이크로 플레이트로 전송하십시오. 미세하고 직선적인 집게를 사용하여 마이크로 플레이트의 중앙으로 펀치를 부드럽게 조작합니다. 펀치를 같은 방향으로 유지합니다.예를 들어, 신경절 세포 측을 위쪽으로 합니다. 각 실험에 대해 450 마이크로리터의 베이스 배지가 있는 3~4개의 빈 우물을 따로 따로 두어 음의 대조군역할을 한다. 기포 나 과도한 움직임을 피하면서, 아일렛 캡처 메쉬 인서트를 각 우물에 부드럽게 배치하고 금속 플런저 또는 절단 P1000 파이펫 팁으로 인서트를 고정합니다.마이크로 챔버는 일반적인 마우스 망막을 수용하기에 충분한 깊이를 가지고 있지만, 때때로 메쉬 인서트의 기계 결함은 화면 삽입 중에 조직이 지나치게 압축되는 원인이됩니다. 이 경우, 단순히이 분쇄 된 조직의 메모를하고 최종 분석에서 그 샘플을 제외합니다. 티슈 플레이트를 37도 의 이산화탄소 무료 인큐베이터에서 적어도 60분 동안 배양합니다.혼합, 무게, 측정 및 반복 명령을 사용하여 여분의 셀룰러 플럭스 분석기를 프로그래밍합니다. 예를 들어, 망막 조직을 가진 전형적인 실험은 다음을 포함할 수 있다. 2분간 섞고 2분간 기다린 후 5분간 기다립니다.기저선 레코딩을 위해 5~8회 사이의 이 세 가지 단계로 실험을 반복하고, 각 화합물의 주입 후 시험한다. 외세포 플럭스 분석기의 프로그램 시작 버튼을 누르고 화면의 지침을 따라 보정을 위해 센서 카트리지를 삽입합니다. 교정의 끝에서 교정을 통해 교정판을 망막 샘플이 포함된 플레이트로 교체한 다음 프로그램이 프로그래밍된 대로 실행할 수 있도록 합니다.실행이 완료되면 화면의 지침을 따라 티슈 플레이트를 배출합니다. 실행 결과를 보고 데이터 파일을 저장합니다. 구부러진 20 게이지 바늘과 집게로 우물에서 모든 메쉬 인서트를 제거하고 망막 펀치를 뒤로 합니다.조심스럽게 조직에서 배지를 흡인하고, 차가운 인산염 완충식염의 0.5 밀리리터로 조직을 두 번 씻는다. 두 번째 PBS 세척을 심은 후, 각 세척에 100 마이크로리터의 용해 완충제를 추가하고 조직을 균질화하기 위해 피펫을 위아래로 넣습니다. 마지막으로, 트리스-EDTA 버퍼100마이크로리터를 1-1로 희석하고 희석된 시료의 100마이크로리터를 96개의 웰 플레이트로 전송하여 총 이중 좌초 된 DNA 함량을 기반으로 입력 수준을 양으로 전달합니다.그런 다음 각 웰에 100 마이크로리터의 검출 버퍼를 추가하고 2~5분 동안 혼합합니다. 마지막으로, 표준 곡선과 비교하여 480 나노미터에서 발광 및 520 나노미터에서 배출한 후 수량으로 플로레시엔션을 수량화한다. 우물 내의 DNA 함량에 원시 세포 외 플럭스 추적을 정규화합니다.기본 라인에서, 5 밀리 뮬러 포도당의 존재와 존재 10 밀리 뮬러 피루바테, 산성 유출의 비율에 유의한 차이가 없다, 세포 외 산성화 속도에 의해 측정. wile 형 동물에서 망막 조직 사이, 또는 빛 자극에 대 한 응답으로 순환 뉴클레오티드 게이트 이온 채널을 닫기 위해 기계가 부족 마우스를 노크. 유사한 패턴은 20 밀리 뮬러 포도당과 글리코리스틱 억제제 2DG를 첨가한 후에 보입니다.이러한 데이터는 다른 실험 적 개입 간의 더 나은 비교를 허용할 수 있는 형식인 기준선에서 분수 변화를 나타내기 위해 수학적으로 변형될 수 있습니다. 기준선에서 절대 산소 소비 속도는 또한 제어 및 돌연변이 망막 조직 사이 동일합니다. 20 밀리 뮬러 포도당의 첨가는 미토콘드리아 호흡을 증가, 하지만 절대 정량화의 측면에서 또는 기준선에서 변화의 관점에서 그룹 사이에 관찰에 변화가 없습니다.1 밀리 뮬러 FCCP의 추가, 분리 에이전트, 최대 미토콘드리아 호흡 속도를 입증하기 위해 크게 제어 및 돌연변이 망막 조직에서 높은 포도당으로 본 수준 이상의 OCR을 증가하지 않습니다. 그러나 RAA 칵테일을 첨가한 후 두 마우스의 신호가 크게 떨어집니다. 결론적으로, 우리는 마우스 망막의 organotypic 파종의 산화 인산화 및 글리코립시스의 양을 양화하기위한 기술을 보여줍니다.망막 조직의 효율적인 격리로 이 기술은 신뢰할 수 있고 자랑스러운 측정을 생성합니다. 분리 제와 같은 노출의 실시간 효과를 평가할 수 있습니다. 이 절차 이외에, 정량적 RTPCR 및 서부 블로팅과 같은 다른 방법은 방부 단계에서 분리된 잉여 조직에서 수행되어 망막 대사의 연구와 관련된 병렬 정보를 얻을 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

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에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

연구

생물학

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

레이저 캡처 미세 절 RNA-시퀀싱 용 공간 및 측두 조직 -특정 유전자 발현 분석

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...