Name: measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Мы благодарим д-р Александр Колесников и д-р Владимир Kefalov за предоставление Gnat1- / -мышей, за полезные отзывы и советы и для чтения рукопись.
Эта работа была поддержана, низ EY025269 (ОР), исследовательский центр университета Вашингтона - низ DK020579 диабет (JRM и RR), премии развития карьеры от исследований по предотвращению слепоты (ОР), Фонд Horncrest (ОР), премии развития карьеры с JDRF ( JRM), низ DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) и DK114233 (JRM).

Протоколы ассоциации исследований в видении и офтальмологии заявление для использования животных и были одобрены Университет Вашингтона.
1. животных подготовка
<ol><li>Держите животных в стандартный корпус с 12 часов темного света цикл 12 часов. Начало экспериментов на ста?...

<ol>
	<li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function:+high+cost+of+Na++transport.">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration.">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).</li><li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers.">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li><li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging.">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function.">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival.">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113 (2017).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina.">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li><li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proton+and+electron+leaks.">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina.">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li></ol>

OCR и ECAR легко измеряются в описаны ткани сетчатки, с помощью bioanalyzer, с помощью описанных методов. Этот метод отличается от других групп в нескольких важных шагов. Сетчатки тканей изолированы через большой разрез роговицы без enucleating всему миру, как первоначально описанных Карлом Уинклер<su...

Сетчатка является одним самых требовательных энергии тканей в центральной нервной системе1. Как и большинство тканей он генерирует аденозинтрифосфатом (АТФ) через гликолиз в цитозоль или через окислительного фосфорилирования в митохондриях. Энергичный преимущество Оксидативное фосфорилирование гликолиз производить АТФ из одной молекулы глюкозы ясна: 36 молекулы АТФ генерируется из бывших против 2 молекулы АТФ, созданный из последнего. Соответственно нейроны сетчатки главным образом зависят от митохондриальное дыхание для поставок энергии и это отражено в их высокой плотности митохондрий2. Тем не менее сетчатки также полагается на гликолитических машин даже тогда, когда кислород обильные. Этот процесс аэробного гликолиза первоначально был описан в раковых клетках Отто Варбург3, который однажды отметил, что только после митотическая ткани, способную метаболизма4сетчатки. После этих первоначальных наблюдениях участвовать в той или иной степени гликолиза в дополнение к окислительное фосфорилирование к их требованиям СПС были описаны многие пост митотическая тканей.
Phototransduction, визуальные пигмент рециркуляции, биосинтез наружной сегментов фоторецепторных и синаптической активности являются все энергии требовательных процессов в фоторецепторных клеток, преобладающим нейрональных подкласс в сетчатке. Но на сегодняшний день наиболее энергетически длительный процесс в нейроны1является необходимость активно транспорт ионов против их электрические и градиенты концентрации. Фоторецепторы являются своеобразным нейронов в том смысле, что они являются деполяризованный в отсутствие стимуляции (т.е., в темноте), тогда как легкие стимул вызывает закрытие канала и последующих гиперполяризации. Таким образом в темноте, сетчатки потребляет большое количество АТФ для поддержания ее деполяризации или «Темновой ток», как это обычно называют. С точки зрения адаптации одной из основных проблем в обеспечении этих огромное количество АТФ является необходимость организмов поддерживать четкость через оптической оси. Перевернутый сетчатки архитектура, видели в современном существ является доминирующим решение, как он держит плотной капиллярной сети, поставку фоторецепторы от пути света. Но это чудо природных биоинженерии сетчатки на краю пропасти с точки зрения метаболических резерва. Даже небольшие оскорбления к сетчатке потенциально может нарушить хрупкий баланс поставок энергии для спроса, и визуальный дисфункции или откровенный слепота может наступить быстро.
Учитывая уникальный энергичный требования нейронных сетчатки, в сочетании с ее жесткие ограничения кровоснабжения, точное измерение потребления АТП в сетчатке и его изменения во время болезни может иметь серьезные последствия в понимании и лечении ослепительный условия, такие как пигментный ретинит и диабетической ретинопатии. Традиционно эти измерения требуют дорогостоящей, специально оборудования с большинства исследований, выходящих из несколько лабораторий, полностью посвященный измерений метаболической активности2,5,6, 7,8. Методы включают в себя отдельные анализы для конкретных метаболитов, трассирующими исследования с использованием радио меченых прекурсоров, потребление кислорода, запись с помощью электродов Кларк и Метаболомные профилирования9.
С достижениями в технологии высокой пропускной способности и повышение доступности коммерческих устройств методы для записи обмена веществ сетчатки являются более доступными и дешевыми. Метод, описанный здесь меры как окислительного фосфорилирования и гликолиза в сетчатке с помощью описаны ткани и коммерчески доступные внеклеточного потока анализатор9,10,11,12. Этот анализатор отдельно записи скорости потребления кислорода (OCR) и уровень внеклеточного подкисления (ECAR), выступающей в качестве косвенных показателей окислительного фосфорилирования и гликолиз, соответственно13. Эти измерения выполняются зонд submersed в пределах microchamber, поверх ткани интерес. Эта адаптация ранее опубликованных методов использует захвата плита, первоначально разработанный для островков Лангерганса поджелудочной железы для записи метаболической активности в небольших, циркуляр разделы мыши сетчатки. Несколько фармакологического воздействия может быть доставлен ткани в течение одной записи, потому что система содержит 4 инъекции портов для каждого образца хорошо. С помощью этой системы с отдельными протоколами, оптимизированный для записи ECAR и OCR, ответы сетчатки одичал типа можно сравнить с сетчатки не хватает transducin (Gnat1- / -), причиной врожденной стационарных ночной слепоты в люди14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:777px;" width="778">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td style="width:155px;">Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:337px;">Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>101174-100</td>
			<td style="width:167px;">Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640 Media (Powdered medium)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R1383</td>
			<td style="width:167px;">RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td style="width:167px;">1M D-Glucose filtered, for media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25000CI</td>
			<td style="width:167px;">100 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Antimycin-A</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">FCCP</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Rotenone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">2-deoxyglucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td style="width:167px;">Glycolysis protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">1 mm skin biopsy punches with plunger</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>33-31AA-P/25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Mini-Forceps Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11200-10</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont #7 Forceps - Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td style="width:167px;">Loading normalization assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base (Tris base)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>&#160;Strain 000664</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+&#160;</td>
			<td colspan="2">Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis

Высокая острота зрения представляет собой процесс сильно потребления энергии, и сетчатки разработал несколько уникальных адаптации точно выполнять такие требования при сохранении прозрачности зрительной оси. Возмущений в этот деликатный баланс вызывают ослепительный болезней, таких как диабетическая ретинопатия. Таким образом понимание энергии метаболизма изменения в сетчатке во время болезни необходимо для разработки рациональной терапии для различных причин утраты vison. Недавнее появление коммерчески доступных внеклеточного потока анализаторы сделал исследование сетчатки энергии метаболизма более доступными. Этот протокол описывает использование такого анализатора измерить вклад сетчатки энергоснабжение через два принципа оружие - окислительного фосфорилирования и гликолиза - путем количественной оценки изменений в уровнях потребления кислорода (OCR) и внеклеточной показатели подкисления (ECAR) как прокси для этих путей. Этот метод легко выполняется в описаны ткани сетчатки, облегчения оценки ответов на несколько фармакологических агентов в одном эксперименте. Метаболические подписей в сетчатки от животных, не хватает стержень фоторецепторных сигнализации по сравнению с одичал тип элементов управления, с помощью этого метода. Одним из основных ограничений в этой технике является отсутствие способности различать использования света адаптированных и dark-adapted энергии, важным физиологическим в ткани сетчатки.

С помощью описанных методов (кратко на рис. 1), сетчатки эксплантов от 8 недели старый дикого типа (WT) мышах были по сравнению с соответствием возраста и фон transducin null мышей (Gnat1- / -). Потому что Gnat1- / - животные не хватает техники закр...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux

Этот метод описывает записи в реальном времени потребления кислорода и внеклеточной подкисления ставок описаны мыши сетчатки тканей с использованием анализатора внеклеточного потока.

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, такие как, как метаболизм энергии в тканях сетчатки отличается между биологическими образцами, или после воздействия фармакологических агентов. Основным преимуществом этого метода является то, что он использует эксплантированные органотипические ткани сетчатки для измерения темпов как гликолиза, так и окисленного фосфорилирования и позволяет проводить оценки вмешательств в пробирке в режиме реального времени. Для калибровки приборов для внеклеточного потока анализа сначала добавьте один миллилитр калибровочного раствора к каждой колодец из 24 картриджа датчика хорошо, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в Co2 бесплатно инкубатор на ночь.Загрузите добавки для протокола митохондриального стресса или протокола гликолиза в каждый инжекторный порт на сенсорном картридже, регулируя для изменения громкости в колодец. Предполагая первоначальный объем хорошо 450 микролитров, типичный анализ будет включать в себя 45 микролитров добавки в первый порт инжектора, 49,5 микролитров во второй, 54,5 микролитров в третий, и 60 микролитров в последний. В течение первых нескольких экспериментов, нагрузка базы среды в порт, чтобы оценить, сколько артефакт движения тканей происходит после инъекции порта.Разрешить загруженной сенсорной пластины инкубировать при 37 градусов по Цельсию в не Co2 инкубатор, по крайней мере 60 минут. Начните изоляцию свежей ткани сетчатки мыши с помощью свежеиспеченной мыши. Используйте пару средних изогнутых типсов, чтобы схватить задний глобус на зрительном нерве, и осторожно применять давление вперед, чтобы опора глаза.С чистым лезвием бритвы, создать лимбус лимбус разрез через роговицу с помощью одного, преднамеренного прохода лезвия. Используя тонкий угловой МакФерсон стиле щипцы, щепотку заднего глобуса, чтобы выразить объектив и передние мембраны гилоидов из разреза роговицы. Повторите щипать маневр с щипся, чтобы выразить нервной сетчатки.Затем используйте миппы, как ложка, чтобы поднять сетчатку от разреза роговицы. Поместите сетчатку прямо в теплую среду в трехметровую тарелку, или шести хорошо ткани культуры кластерной пластины. Далее, используйте две пары тонких угловых forceи McPherson, чтобы аккуратно вскрыть оставшиеся стекловидного глаза от сетчатки.Это лучше всего сделать, хватая стекловидное тело на периферии чашки сетчатки, и потянув к центру, с окончательным disinsertion стекловидного тела из центра в целом. Затем удалите любой остаточный пигмент сетчатки эпителия с поверхности фото-рецептора сетчатки. Вырезать P1000 пипетки кончик с лезвием бритвы, чтобы создать приблизительное четырехмиллиметровое отверстие, чтобы предотвратить неоправданную травму деликатной ткани сетчатки во время передачи маневров.Затем используйте наконечник пипетки для переноса изолированной ткани сетчатки в свежую среду. Наконец, используйте один миллиметр биопсии удар оснащен поршень, чтобы сократить удары сетчатки вокруг зрительного нерва. Установите сетчатки ударов в сторону в чистой среде, хранится на 37 градусов по Цельсию блок, или грелка.После того, как нужное количество ударов были собраны, используйте милые P1000 отзыв аспирировать индивидуальный удар в 450 микролитров среды, и передать его в 24 хорошо глаз захвата микро пластины на 37 градусов по Цельсию тепловой панели или теплового блока. Используйте тонкие прямые типсы, чтобы аккуратно манипулировать ударами в центр микро пластины. Держите удары ориентированы в том же направлении.Например, с ганглия ячейки стороне вверх. Для каждого эксперимента выделить три-четыре пустые скважины с 450 микролитров базовой среды, чтобы служить в качестве отрицательного контроля. Избегая пузырьков воздуха или чрезмерного движения, аккуратно распорежьте сетку захвата глаз вставки в каждую колодец, и закрепите вставки металлическим поршенем или с разрезом наконечником пипетки P1000.Хотя микрокамера имеет достаточную глубину для размещения типичной сетчатки мыши, иногда дефекты машины в сетчатых вставок делают причиной ткани, чтобы стать чрезмерно сжаты во время вставки экрана. Если это произойдет, просто сделать к сведению эту измельченную ткань, и исключить этот образец из окончательного анализа. Инкубировать пластины ткани в 37 градусов по Цельсию двуокиси углерода инкубатор, по крайней мере 60 минут.Запрограммируйте дополнительный анализатор клеточного потока, используя команды смешивания, веса, измерения и повторения. Например, типичный эксперимент с ткани сетчатки может включать в себя следующее. Смешайте две минуты, подождите две минуты и измерьте пять минут.Повторите эксперимент с этими тремя шагами от пяти до восьми раз для записи базовой линии, и после инъекции каждого соединения проходит тестирование. Нажмите кнопку запуска программы на экстраклеточном анализаторе потока и следуйте инструкциям на экране, чтобы вставить картридж датчика для калибровки. В конце калибровки следуйте инструкциям на экране, чтобы заменить калибрантную пластину пластиной, содержащей образцы сетчатки, а затем позволить программе работать как запрограммировано.По завершении пробега следуйте инструкциям на экране, чтобы извлечь пластину ткани. Просмотр результатов запуска и хранение файла данных. С согнутыми 20 калибровочных игл и типсов, удалить все сетчатые вставки из колодцев, оставив сетчатки удар позади.Тщательно аспирировать среду из ткани, и мыть ткани в два раза с 0,5 миллилитров холодного фосфата буфера солевого раствора. После аспирации второй PBS мыть, добавить 100 микролитров лиза буфера для каждой стирки, и пипетки вверх и вниз, чтобы гомогенизировать ткани. Наконец, количественные уровни ввода на основе общего двойного содержания ДНК, разбавляя облизанные образцы один к одному, со 100 микролитров буфера Tris-EDTA, и передачи 100 микролитров разбавленного образца на пластину 96 хорошо.Затем добавьте 100 микролитров буфера обнаружения к каждой колодец и перемешайте в течение двух-пяти минут. Наконец, квантитат флуоресценции после возбуждения на 480 нанометров и выбросов на 520 нанометров по сравнению со стандартной кривой. Нормализует внеклеточный поток, отслеживая содержимое ДНК в колодец.На базовой линии, в присутствии пяти милли глюкозы мюллера и в присутствии 10 милли мюллер пируват, нет существенной разницы в скорости кислотного эфлюкса, измеряется внеклеточной скорости подкисления. Между тканями сетчатки от животных типа хитрости, или выбить мышей, которые не имеют механизма, чтобы закрыть циклические нуклеотидные закрытые ионные каналы в ответ на световые раздражители. Аналогичные закономерности наблюдается после добавления 20 милли мюллер глюкозы и гликолитический ингибитор 2DG.Эти данные могут быть математически преобразованы для представления дробных изменений от базового уровня, формата, который может позволить лучше сравнивать различные экспериментальные вмешательства. Абсолютный уровень потребления кислорода на базовом уровне также эквивалентен между контролем и мутантной ткани сетчатки. Добавление 20 милли глюкозы мюллера увеличивает митохондриальное дыхание, но никаких изменений в наблюдаемых между группами с точки зрения абсолютной количественной оценки или с точки зрения изменения от базового уровня.Добавление одного милли мюллера FCCP, развязающий агент, чтобы продемонстрировать максимальные митохондриальные дыхательные ставки не значительно увеличить OCR выше уровня видели с высоким содержанием глюкозы в контроле и мутант ткани сетчатки. Тем не менее, сигналы от обеих мышей резко падают после добавления коктейля RAA. В заключение мы демонстрируем методику количественной оценки показателей окисленного фосфорилирования и гликолиза в органотипических эксплантах сетчатки мыши.При эффективной изоляции тканей сетчатки, техника дает надежные и reproudcable измерений. В режиме реального времени можно оценить воздействие воздействий, таких как размекаемые агенты. В дополнение к этой процедуре, другие методы, такие как количественные RTPCR и западные blotting, могут быть выполнены на излишки ткани изолированы в шаге вскрытия для получения параллельной информации, относящейся к исследованиям метаболизма сетчатки.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo массовой Профилирование (ОЛИМП) из внеклеточных полисахаридов

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Количественное измерение Invadopodia-опосредованного протеолиза внеклеточной матрицы в одно-и многоклеточных контексты

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-параметр измерения проницаемости пор Переход Открытие в изолированном сердце мыши Митохондрии

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Измерение внеклеточного ионных потоков, используя ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Техника

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Измерение и анализ внеклеточной кислоты производства, чтобы определить гликолитических Оценить

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Изоляция, характеристики и высокую пропускную способность внеклеточного Flux анализ мышь первичной почечной трубчатых эпителиальных клеток

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Лазер-Захват Микродиссеция РНК-секвенирования для пространственной и временной ткани-специфический анализ экспрессии генов в растениях

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Оценка клеточной биоэнергетики в гемопоэтических стволовых клетках мыши и примитивных клетках-предшественниках с помощью анализатора внеклеточного потока

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...