Name: measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Agradecemos al Dr. Alexander Kolesnikov y Dr. Vladimir Kefalov para proporcionar Gnat1- / -ratones, información útil y consejos y por leer el manuscrito.
Este trabajo fue financiado por los NIH EY025269 (RR), el centro de investigación de la Diabetes en la Universidad de Washington - NIH DK020579 (JRM y RR), un premio de desarrollo de carrera de la investigación para evitar la ceguera (RR), la Fundación Horncrest (RR), un premio de desarrollo de carrera de JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CSA), DK020579 (CSA), DK056341 (SFC) y DK114233 (JRM).

Protocolos siguieron la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología declaración para el uso de los animales y fueron aprobados por la Universidad de Washington.
1. animal preparación
<ol><li>Mantener animales en vivienda estándar con una 12 horas oscuras al ciclo de luz de 12 horas. Comenzar los experimentos en estandardizado veces para evitar los efectos, normalmente en la mañana poco después de que las luces se encienden.</li>
</ol>2. preparaci?...

<ol>
	<li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function:+high+cost+of+Na++transport.">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration.">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).</li><li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers.">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li><li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging.">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function.">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival.">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113 (2017).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina.">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li><li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proton+and+electron+leaks.">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina.">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li></ol>

OCR y ECAR se miden fácilmente en el tejido retiniano explanted utilizando un equipo bioanalyzer utilizando las técnicas descritas. Este método parte de los de otros grupos en varios pasos críticos. Los tejidos retinianos son aislados a través de una incisión corneal grande sin enucleando el mundo, originalmente descrito por Winkler15. Este método de aislamiento retiniana permite una transferencia rápida del ojo en la placa de captura de tejido (a menudo dentro de 5 minutos). Los tejidos s...

La retina es el tejido más demanda de energía en el sistema nervioso central1. Como la mayoría de los tejidos, genera trifosfato de adenosina (ATP) mediante la glucólisis en el citosol o a través de fosforilación oxidativa en las mitocondrias. La ventaja energética de la fosforilación oxidativa en la glucólisis para producir ATP a partir de una molécula de glucosa es clara: 36 moléculas de ATP generan por ex vs 2 moléculas de ATP que se generan a partir de este último. En consecuencia, las neuronas retinianas principalmente dependen de la respiración mitocondrial para suministro de energía y esto se refleja en su alta densidad de mitocondrias2. Sin embargo, la retina también depende en gran medida maquinaria glicolítica incluso cuando el oxígeno es abundante. Este proceso de glucólisis aeróbica fue descrito originalmente en las células cancerosas por Otto Warburg3, quien una vez observó que la retina el tejido sólo poste-mitotic capaces de esta forma de metabolismo4. Desde las observaciones iniciales, se han descrito muchos tejidos poste-mitotic para participar en diversos grados de glucólisis además de fosforilación oxidativa para atender sus demandas de ATP.
Fototransducción, pigmento visual reciclaje, biosíntesis de los segmentos externos del fotorreceptor y actividad sináptica son todos procesos exigentes de energía en los fotorreceptores, la subclase neuronal predominante en la retina. Pero la necesidad de transportar activamente los iones contra su eléctrico y gradientes de concentración es en gran medida el proceso energéticamente más lento en las neuronas1. Fotorreceptores son neuronas peculiar en el sentido que ellos son despolarizados en ausencia de estímulo (es decir, en la oscuridad), mientras que un ligero estímulo provoca cierre de canal y subsecuente hiperpolarización. Por lo tanto, en la oscuridad, la retina consume grandes cantidades de ATP para mantener su despolarización o "corriente oscura" como comúnmente se le llama. Desde un punto de vista adaptativo, un desafío importante en el suministro de estas grandes cantidades de ATP es la necesidad de los organismos mantener la claridad visual a través del eje óptico. La arquitectura retiniana invertida en criaturas modernas es la solución dominante, ya que mantiene la densa red capilar suministro de fotorreceptores lejos el camino de la luz. Pero esta maravilla de la bioingeniería natural coloca a la retina en un precipicio en términos de reserva metabólica. Incluso los pequeños insultos a retina potencialmente pueden perturbar el delicado equilibrio de la oferta de energía a la demanda, y la disfunción visual o ceguera Franco puede sobrevenir rápidamente.
Dadas las demandas energéticas únicas de la retina neural, junto con su restricción apretado de la fuente vascular, una medición precisa del consumo de ATP en la retina y sus cambios durante la enfermedad podría tener profundas implicaciones en la comprensión y el tratamiento de cegamiento de condiciones tales como retinitis pigmentosa y la retinopatía diabética. Tradicionalmente, estas medidas requieren equipo costoso, diseñado con la mayoría de los estudios de un puñado de laboratorios enteramente dedicado a las mediciones de la actividad metabólica2,5,6, 7,8. Las técnicas incluyen ensayos individuales de metabolitos específicos, estudios tracer usando precursores marcados con radio, grabación usando electrodos de Clark y metabolómicos perfiles9el consumo de oxígeno.
Con los avances en la tecnología de alto rendimiento y mayor disponibilidad de dispositivos comerciales, técnicas de registro del metabolismo retiniano son cada vez más accesibles y asequibles. El método descrito aquí mide tanto la fosforilación oxidativa y glicolisis en retina utilizando explantados tejido y un analizador de flujo extracelular comercialmente disponibles9,10,11,12. Este analizador por separado registra tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR), sirviendo como indicadores indirectos de la fosforilación oxidativa y la glicolisis, respectivamente13. Estas mediciones son realizadas por una sonda sumergida dentro de una microcámara en el tejido de interés. Esta adaptación de los métodos previamente publicados utiliza una placa de captura diseñada originalmente para los islotes pancreáticos de Langerhans para grabar la actividad metabólica en secciones pequeñas, circulares de retina de ratón. Múltiples exposiciones farmacológicas pueden entregarse al tejido durante el curso de una sola grabación porque el sistema contiene 4 puertos de inyección para cada muestra bien. Utilizando este sistema con protocolos aparte optimizados para grabaciones de ECAR y OCR, las respuestas de tipo salvaje retinas se pueden comparar con retinas carentes transducina (Gnat1- / -), una causa de ceguera de noche inmóvil congénita en los seres humanos14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:777px;" width="778">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td style="width:155px;">Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:337px;">Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>101174-100</td>
			<td style="width:167px;">Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640 Media (Powdered medium)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R1383</td>
			<td style="width:167px;">RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td style="width:167px;">1M D-Glucose filtered, for media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25000CI</td>
			<td style="width:167px;">100 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Antimycin-A</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">FCCP</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Rotenone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">2-deoxyglucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td style="width:167px;">Glycolysis protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">1 mm skin biopsy punches with plunger</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>33-31AA-P/25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Mini-Forceps Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11200-10</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont #7 Forceps - Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td style="width:167px;">Loading normalization assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base (Tris base)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>&#160;Strain 000664</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+&#160;</td>
			<td colspan="2">Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis

Alta agudeza de la visión es un proceso altamente consumidor de energía, y la retina ha desarrollado varias adaptaciones únicas para precisamente cubrir tales demandas manteniendo la transparencia del eje visual. Las perturbaciones a este delicado equilibrio causan enfermedades cegadoras, tales como la retinopatía diabética. Por lo tanto, la comprensión de los cambios de metabolismo de energía en la retina durante la enfermedad es imprescindible para el desarrollo de tratamientos racionales para diversas causas de pérdida de visión. La reciente llegada de los analizadores de flujo extracelular comercialmente disponible ha realizado el estudio del metabolismo energético retiniana más accesible. Este protocolo describe el uso de tal un analizador para medir las contribuciones al suministro de energía retiniana a través de sus brazos dos principio - fosforilación oxidativa y glucólisis - mediante la cuantificación de cambios en las tasas de consumo de oxígeno (OCR) y extracelular tipos de acidificación (ECAR) como proxies para estas vías. Esta técnica se realiza fácilmente en el tejido retiniano explanted, facilitar la evaluación de las respuestas a múltiples agentes farmacológicos en un solo experimento. Firma metabólica en las retinas de los animales que carecen de señalización de fotorreceptores de varilla se comparan con controles de tipo salvaje con este método. Una limitación importante en esta técnica es la falta de capacidad de discriminar entre la utilización de la energía luz-adaptado y oscuro-adaptado, una consideración fisiológica importante en el tejido retiniano.

Utilizando las técnicas descritas (resumidas en la figura 1), explantes de retinales de 8 semanas de edad tipo de salvaje (WT) ratones fueron en comparación con pareados por edad y antecedentes transducina null ratones (Gnat1- / -). Porque Gnat1- / - animales carecen de la maquinaria para cerrar nucleótido cíclico cerrado canales iónicos en respuesta a estímulos de luz, los fotorreceptores de la barra per...

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Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

Esta técnica describe la grabación en tiempo real del consumo de oxígeno y los tipos de acidificación extracelular en los tejidos retinianos explanted ratón utilizando un analizador de flujo extracelular.

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave como cómo el metabolismo energético en el tejido de la retina difiere entre las muestras biológicas, o después de la exposición a agentes farmacológicos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza tejido organotípico de la retina explantado para medir las tasas de glucólisis, y fosforilación oxidada y permite evaluaciones de intervenciones en tiempo real in vitro. Para calibrar la instrumentación para un ensayo de flujo extracelular, agregue primero un mililitro de solución de calibración a cada pozo del cartucho del sensor de 24 pozos, e incubar a 37 grados celsius en una incubadora libre de Co2 durante la noche.Aditivos de carga para el protocolo de tensión mitocondrial, o el protocolo de glucólisis en cada puerto del inyector en el cartucho del sensor, ajustando para los cambios de volumen en el pozo. Suponiendo un volumen inicial de 450 microlitros, un ensayo típico incluiría 45 microlitros de un aditivo en el primer puerto del inyector, 49,5 microlitros en el segundo, 54,5 microlitros en el tercero y 60 microlitros hasta el último. Durante los primeros experimentos, cargue el medio base en el puerto A para medir cuánto artefacto de movimiento de tejido se produce después de una inyección de puerto.Deje que la placa del sensor cargada se incuba a 37 grados celsius en una incubadora no co2 durante al menos 60 minutos. Comience el aislamiento del tejido fresco de la retina del ratón con un ratón recién eutanizado. Usa un par de fórceps curvados de tamaño medio para agarrar el globo posterior en el nervio óptico, y aplica suavemente presión hacia adelante para proptizar el ojo.Con una cuchilla de afeitar limpia, crea una incisión de limbo a limbo a través de la córnea usando una sola pasada deliberada de la hoja. Usando fórceps de estilo McPherson en ángulo fino, pellizca el globo posterior para expresar la lente y las membranas hiloide anteriores fuera de la incisión corneal. Repita la maniobra de pellizcar con fórceps para expresar la retina neural.Luego, usa los fórceps como una cuchara para levantar la retina lejos de la incisión corneal. Coloque la retina directamente en el medio caliente en una placa de tres centímetros, o una placa de racimo de cultivo de tejido de seis bien. A continuación, usa dos pares de fórceps de estilo de McPherson en ángulo fino para diseccionar suavemente el vítreo restante de la retina.Esto se hace mejor agarrando el vítreo en la periferia de la copa de la retina, y tirando hacia el centro, con una desinserción final del cuerpo vítreo desde el centro en su conjunto. Luego, retire cualquier epitelio pigmentario de retina residual de la superficie del foto receptor de la retina. Corte una punta de pipeta P1000 con una cuchilla de afeitar para crear una abertura aproximada de cuatro milímetros para evitar traumatismos indebidos en el delicado tejido de la retina durante las maniobras de transferencia.Luego, utilice la punta de la pipeta cortada para transferir el tejido de la retina aislado a un medio fresco. Por último, usa un punzón de biopsia de un milímetro equipado con un émbolo, para cortar punzones de retina alrededor del nervio óptico. Deje los punzones de retina a un lado en medio limpio, mantenido en un bloque Celsius de 37 grados, o almohadilla de calentamiento.Una vez que se haya recogido el número deseado de punzones, utilice la linda punta P1000 para aspirar un golpe individual en 450 microlitros de medio, y transferirlo a una micro placa de captura de ojal de 24 pozos en una almohadilla de calor de 37 grados Celsius o bloque de calor. Utilice fórceps finos y rectos para manipular suavemente los golpes en el centro de la micro placa. Mantenga los golpes orientados en la misma dirección.Por ejemplo, con el lado de la célula ganglionar hacia arriba. Para cada experimento reserva de tres a cuatro pozos en blanco con 450 microlitros de medio base para servir como controles negativos. Mientras evita las burbujas de aire o el movimiento excesivo, coloque suavemente las inserciones de malla de captura del ojal en cada pozo y fije las plaquitas con un émbolo metálico o con una punta de pipeta P1000 cortada.Aunque la microcámara tiene una profundidad adecuada para acomodar la retina típica del ratón, ocasionalmente los defectos de la máquina en las inserciones de malla hacen que los tejidos se comprimen excesivamente durante la inserción de la pantalla. Si esto sucede, simplemente tome nota de este tejido triturado y excluya esa muestra del análisis final. Incubar la placa de tejido en una incubadora libre de dióxido de carbono de 37 grados Celsius durante al menos 60 minutos.Programe el analizador de flujo celular adicional utilizando los comandos mix, weight, measure y repeat. Por ejemplo, un experimento típico con tejido retinal puede incluir lo siguiente. Mezcle dos minutos, espere dos minutos y mida cinco minutos.Repita el experimento con estos tres pasos entre cinco y ocho veces para el registro de la línea base y después de la inyección de cada compuesto que se está probando. Pulse el botón de inicio del programa en el analizador de flujo extracelular y siga las instrucciones de la pantalla para insertar el cartucho del sensor para la calibración. Al final de la calibración, siga las instrucciones de la pantalla para reemplazar la placa calibradora por la placa que contiene las muestras de retina y, a continuación, permita que el programa funcione según lo programado.Al finalizar la carrera, siga las instrucciones de la pantalla para expulsar la placa de tejido. Vea los resultados de la ejecución y almacene el archivo de datos. Con una aguja de calibre 20 doblado y fórceps, retire todas las inserciones de malla de los pozos, dejando el punzón de la retina detrás.Aspirar cuidadosamente el medio del tejido y lavar el tejido dos veces con 0,5 mililitros de solución salina tamponada de fosfato frío. Después de aspirar el segundo lavado PBS, agregue 100 microlitros de tampón de lysis a cada lavado, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar el tejido. Por último, cuantifica los niveles de entrada basados en el contenido total de ADN de doble cadena diluyendo las muestras de un a uno, con 100 microlitros de tampón Tris-EDTA, y transfiriendo 100 microlitros de la muestra diluida a una placa de 96 pozos diluida.A continuación, agregue 100 microlitros de búfer de detección a cada pozo y mezcle durante dos a cinco minutos. Por último, cuantifica la florescencia después de la excitación a 480 nanómetros y la emisión a 520 nanómetros en comparación con una curva estándar. Normalizar el rastreo de flujo extracelular crudo al contenido de ADN dentro del pozo.En la línea base, en presencia de glucosa de cinco mil montantes y en presencia de piruvato de 10 milivas, no hay diferencias significativas en las tasas de eflux ácido, medida por la tasa de acidificación extracelular. Entre los tejidos de la retina de los animales de tipo wile, o noquear a los ratones que carecen de la maquinaria para cerrar los canales de iones cerrados de nucleótidos cíclicos en respuesta a los estímulos de luz. Patrones similares se observan después de la adición de 20 mil muller glucosa y el inhibidor glucolítico 2DG.Estos datos pueden transformarse matemáticamente para representar cambios fraccionarios desde la línea de base, un formato que puede permitir una mejor comparación entre diferentes intervenciones experimentales. La tasa de consumo absoluto de oxígeno al inicio también es equivalente entre el control y el tejido de la retina mutante. La adición de glucosa de 20 mil mil muller aumenta la respiración mitocondrial, pero no hay cambios en los observados entre los grupos en términos de cuantificación absoluta o en términos de cambio desde el inicio.La adición de un mili muller FCCP, un agente de desacoplamiento, para demostrar las tasas respiratorias mitocondriales máximas no aumenta significativamente el OCR por encima del nivel observado con alta glucosa en control y tejido de retina mutante. Sin embargo, las señales de ambos ratones caen drásticamente después de la adición del cóctel RAA. En conclusión, demostramos una técnica para cuantificar las tasas de fosforilación oxidada y glucólisis en explantes organotípicos de la retina del ratón.Con un aislamiento eficiente del tejido de la retina, la técnica produce mediciones fiables y repetibles. Se pueden evaluar los efectos en tiempo real de las exposiciones, como los agentes de desacoplamiento. Además de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el RTPCR cuantitativo y la hinchazón occidental, en el tejido sobrante aislado en el paso de disección para obtener información paralela relevante para estudios del metabolismo de la retina.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

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La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Investigación

Biología

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Medición y Análisis de la producción de ácido extracelular para Determinar glicolítica Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Aislamiento, caracterización y alto rendimiento análisis de flujo extracelular de ratón células epiteliales tubulares renales primarias

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...