Name: measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Vi tackar Dr. Alexander Kolesnikov och Dr. Vladimir Kefalov för att ge Gnat1- / -möss, för bra feedback och råd och läsa manuskriptet.
Detta arbete fick stöd av NIH EY025269 (RR), Diabetes Research Center vid Washington University - NIH DK020579 (JRM och RR), en karriär Development Award från forskning till förhindra blindhet (RR), Horncrest Foundation (RR), en karriär Development Award från JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) och DK114233 (JRM).

Protokoll följt förbundet för forskning i Vision och oftalmologi uttalande om användning av djur och godkändes av Washington University.
1. animaliskt förberedelse
<ol><li>Hålla djur boendestandard med en 12 timmar mörkt till 12 timmar ljus cykel. BEGIN experiment på standardiserade tiden för att undvika dygnsrytm effekter, vanligtvis på morgonen strax efter tänds.</li>
</ol>2. lösning förberedelse
<ol><li>Förbered bas genom upplösning 8,4 mg pulveri...

<ol>
	<li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function:+high+cost+of+Na++transport.">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li><li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration.">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).</li><li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers.">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li><li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging.">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function.">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li><li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria.">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival.">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113 (2017).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina.">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li><li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proton+and+electron+leaks.">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li><li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data.">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina.">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li></ol>

OCR och ECAR mäts lätt i explanterad retinala vävnaden med hjälp av en bioanalyzer med de beskrivna teknikerna. Denna metod avviker från dem i andra grupper i flera kritiska steg. Näthinnans vävnader isoleras genom en stor hornhinnan snitt utan enucleating i världen, som ursprungligen beskrevs av Winkler15. Denna metod av retinal isolering möjliggör en snabb överföring från levande ögat i vävnad fånga plattan (ofta inom 5 minuter). Vävnaderna hålls vid 37 ° C under hela den proc...

Näthinnan är bland de mest energi-krävande vävnaderna i centrala nervsystemet1. Som de flesta vävnader genererar det adenosintrifosfat (ATP) via glykolys i den cytosol eller via oxidativ fosforyleringen i mitokondrier. Energisk fördelen av oxidativ fosforylering över glykolys att producera ATP från en molekyl av glukos är tydlig: 36 molekyler ATP genereras från den tidigare vs. 2 molekyler av ATP som genereras från den senare. Följaktligen, retinala nervceller är främst beroende av mitokondriell respiration för energiförsörjning och detta avspeglas i deras hög täthet av mitokondrier2. Ännu, näthinnan också starkt beroende glycolytic maskiner även när syre är riklig. Denna process av aerob glykolys ursprungligen beskrevs i cancerceller av Otto Warburg3, som en gång konstaterade att näthinnan var endast efter mitotiska vävnaden kan denna form av metabolism4. Sedan de inledande observationerna, har många efter mitotiska vävnader beskrivits för att engagera sig i varierande grad av glykolys förutom oxidativ fosforylering sin ATP-krav.
Phototransduction, visual pigment återvinning, biosyntesen av ljusmätare yttre segment och synaptisk aktivitet är alla energi krävande processer i fotoreceptorer, dominerande neuronala underklassen i näthinnan. Men behovet av att aktivt transportera joner mot deras elektriska och koncentration lutningar är överlägset mest energiskt tidskrävande processen i nervceller1. Fotoreceptorer är säregna nervceller i den meningen att de är Aricebo i avsaknad av stimulans (dvs. i mörkret), medan en ljus stimulans utlöser kanal stängning och efterföljande hyperpolarisering. Därför, i mörkret, näthinnan förbrukar stora mängder ATP att bibehålla dess depolarisation eller ”mörk ström” som det vanligen kallas. Från en adaptiv synvinkel är en stor utmaning i att leverera dessa enorma mängder ATP behovet av organismer att upprätthålla visuell tydlighet genom den optiska axeln. Inverterad retinal arkitekturen sett i moderna varelser är den dominerande lösningen, eftersom det håller tät välutbyggt nät levererar fotoreceptorer från vägen av ljus. Men detta underverk av naturliga bioengineering platser näthinnan vid en avgrund i form av metabolisk reserv. Även små förolämpningar mot näthinnan kan potentiellt störa den känsliga balansen i energiförsörjningen till efterfrågan och visuell dysfunktion eller frank blindhet kan uppstå snabbt.
Ges unika energisk krav av neurala näthinnan, tillsammans med dess snäva begränsningen av kärlen, kan exakt mätning av ATP förbrukningen i näthinnan och dess förändringar under sjukdomen få djupgående konsekvenser i förståelse och behandling av bländande villkor såsom retinitis pigmentosa och diabetesretinopati. Traditionellt har kräver dessa mätningar kostsamma, anpassade utformade utrustning med de flesta studier framväxande från en handfull laboratorier helt tillägnad mätningar av metabolisk aktivitet2,5,6, 7,8. Tekniker inkluderar enskilda analyser för specifika metaboliter, tracer studier med radioaktivt märkt prekursorer, syreförbrukning inspelning med Clark elektroder och metabolomiska profilering9.
Framstegen inom hög genomströmning teknik och ökad tillgänglighet till kommersiella enheter är tekniker till rekord retinal metabolism allt mer tillgängliga och ekonomiskt överkomliga. Den metod som beskrivs här mäter både oxidativ fosforylering och glykolys i näthinnan med explanterad vävnad och ett kommersiellt tillgängliga extracellulära flux analyzer9,10,11,12. Denna analysator registreras separat syre förbrukning (OCR) och den extracellulära försurning skattesats (ECAR), som serverar som indirekta indikatorer på oxidativ fosforylering och glykolys, respektive13. Dessa mätningar görs av en sond dränka inom en microchamber som skapade över vävnaden av intresse. Denna anpassning av tidigare publicerade metoder använder en capture tallrik ursprungligen för bukspottkörtelns Langerhanska öar för att registrera metabolisk aktivitet i små, cirkulära sektioner av mus näthinnan. Flera farmakologiska exponeringar kan levereras till vävnaden under loppet av en enda inspelning eftersom systemet innehåller 4 injektion portar för varje prov väl. Med detta system med separata protokoll optimerad för ECAR och OCR-inspelningar, svaren från vildtyp näthinnor kan jämföras näthinnor saknar transducin (Gnat1- / -), en orsak till medfödd stationära nattblindhet i människor14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:777px;" width="778">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td style="width:155px;">Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:337px;">Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA</td>
			<td>101174-100</td>
			<td style="width:167px;">Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI 1640 Media (Powdered medium)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R1383</td>
			<td style="width:167px;">RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td style="width:167px;">1M D-Glucose filtered, for media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25000CI</td>
			<td style="width:167px;">100 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Antimycin-A</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">FCCP</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Rotenone</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td style="width:167px;">Mitochondrial stress protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">2-deoxyglucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td style="width:167px;">Glycolysis protocol component</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">1 mm skin biopsy punches with plunger</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>33-31AA-P/25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Mini-Forceps Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11200-10</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-25</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Dumont #7 Forceps - Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td style="width:167px;">Explanting retinal tissue tool</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7589</td>
			<td style="width:167px;">Loading normalization assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base (Tris base)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9262</td>
			<td style="width:167px;">Component of lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>&#160;Strain 000664</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+&#160;</td>
			<td colspan="2">Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine</td>
			<td style="width:167px;">Animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of energy metabolism in explanted retinal tissue using extracellular flux analysis

Hög skärpa vision är en mycket energikrävande process och näthinnan har utvecklat flera unika anpassningar för att exakt uppfylla sådana krav bibehållen insyn i den visuella axeln. Störningar till denna ömtåliga jämvikt orsaka förblindande sjukdomar, såsom diabetesretinopati. Förståelsen av energi metabolism förändringar i näthinnan under sjukdom är därför absolut nödvändigt att utvecklingen av rationella terapier för olika skadeorsaker vison. Senaste tillkomsten av kommersiellt tillgängliga extracellulära flux analysatorer har gjort studien av retinal energiomsättningen mer tillgänglig. Det här protokollet beskriver användningen av sådan en analysator att mäta bidrag till retinal energiförsörjning genom sina två princip vapen - oxidativ fosforylering och glykolys - genom att kvantifiera förändringar i syre förbrukning (OCR) och extracellulära försurning priser (ECAR) som proxyservrar för dessa vägar. Denna teknik utförs lätt i explanterad retinala vävnaden, underlättar bedömning av Svaren till flera farmakologiska agenter i en enstaka experiment. Metaboliska signaturer i näthinnor från djur saknar rod ljusmätare signalering jämförs vildtyps-kontroller med denna metod. En stor begränsning i denna teknik är bristen på förmåga att diskriminera mellan ljus-anpassat och stjärnkartsschema energiutnyttjande, en viktig fysiologisk faktor i retinala vävnaden.

Retinal bladsticklingar från 8 veckor gamla vildtyp (WT) möss jämfördes med de beskrivna tekniker (sammanfattas i figur 1), och bakgrunden-åldersmatchade transducin null möss (Gnat1- / -). Eftersom Gnat1- / - djur saknar maskinen att stänga cykliska-nukleotid gated jonkanaler som svar på ljus stimuli, sin rod fotoreceptorer förblir Aricebo även i ljus14. Den efterföljande beh?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Mätning av energimetabolism i explanterad retinala vävnaden med hjälp av extracellulära Flux analys

Denna teknik beskriver realtid inspelning av syreförbrukning och extracellulära försurning priser i explanterad mus näthinnans vävnader med hjälp av en extracellulär flux analysator.

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor som hur energimetabolism i näthinnevävnad skiljer sig mellan biologiska prover, eller efter exponering för farmakologiska medel. Den största fördelen med denna teknik är att den utnyttjar explanted organotypic retinal vävnad för att mäta priser av både glykolys, och oxiderad fosforylering och möjliggör bedömningar av realtidsinterventioner in vitro. För att kalibrera instrumenteringen för en extracellulär fluxanalys först lägga till en milliliter kalibreringslösning till varje brunn av 24 väl sensor patron, och inkubera på 37 grader Celsius i en Co2 fri inkubator över natten.Ladda tillsatser för mitokondriellt stressprotokoll, eller glykolysprotokollet i varje injektorport på sensorpatronen, justera för volymförändringar i brunnen. Förutsatt att en inledande brunnsvolym på 450 mikroliter, en typisk analys skulle omfatta 45 mikroliter av en tillsats i den första injektorporten, 49,5 mikroliter in till den andra, 54,5 mikroliter i den tredje, och 60 mikroliter in till den sista. Under de första flera experiment, belastning bas medium i port A för att mäta hur mycket vävnad rörelse artefakt uppstår efter en port injektion.Låt den belastade sensorplattan inkubera i 37 grader Celsius i en icke Co2-inkubator i minst 60 minuter. Börja isolering av färsk mus retinal vävnad med en nyligen avlivas musen. Använd ett par medelstora böjda tivnare för att greppa den bakre globen vid synnerven, och försiktigt tillämpa framåt tryck för att proptose ögat.Med ett rent rakblad, skapa en limbus till limbus snitt över hornhinnan med hjälp av en enda, avsiktlig pass av bladet. Använda fina vinklad McPherson stil tlyck, nypa den bakre globen för att uttrycka linsen och främre hyloid membran ur hornhinnans snitt. Upprepa den nypa manöver med tövingar för att uttrycka neurala näthinnan.Använd sedan kraftknleverna som en sked för att lyfta näthinnan bort från hornhinnans snitt. Placera näthinnan direkt i det varma mediet i en tre centimeter skål, eller en sex väl vävnad kultur klusterplatta. Använd sedan två par fina vinklade McPhersons stiltenps för att försiktigt dissekera återstående glaskropp från näthinnan.Detta görs bäst genom att gripa glaskroppen vid periferin av näthinnan koppen, och dra mot mitten, med en slutlig disinsertion av glaskroppen från centrum som helhet. Sedan, ta bort eventuella kvarvarande näthinnepigment epitel från fotoreceptorytan av näthinnan. Skär en P1000 pipettspets med ett rakblad för att skapa en ungefärlig fyra millimeters öppning för att förhindra otillbörligt trauma till den känsliga näthinnevävnaden under överföringsmanövrer.Använd sedan den skurna pipettspetsen för att överföra den isolerade näthinnevävnaden till färskt medium. Slutligen, använd en en millimeter biopsi punch utrustad med en kolv, att skära slag av näthinnan runt synnerven. Ställ retinal stansar åt sidan i rent medium, hålls på en 37 graders Celsius block, eller värmedyna.När önskat antal slag har samlats in, använd söta P1000 spets för att aspirera en individuell punch i 450 mikroliter medium, och överföra den till en 24 väl ögla fånga mikro plattan på en 37 grader Celsius värmedyna eller värmeblock. Använd fina, raka tång för att försiktigt manipulera slag i mitten av mikroplattan. Håll slag orienterade i samma riktning.Till exempel med ganglioncellsidan uppåt. För varje experiment som avsatts tre till fyra tomma brunnar med 450 mikroliter bas medium för att fungera som negativa kontroller. Samtidigt som du undviker luftbubblor eller överdriven rörelse, placera försiktigt in ögonkastet fånga mesh-skär i varje brunn, och säkra skären med en metallkolv eller med en avskuren P1000 pipettspets.Även om mikrokammaren har tillräckligt djup för att rymma typisk mus näthinna, ibland maskin defekter i mesh skär göra orsaka vävnader att bli alltför komprimerad under skärmen insättning. Om detta händer, helt enkelt göra en anteckning om denna krossade vävnad, och utesluta att provet från den slutliga analysen. Inkubera vävnadsplattan i en 37 grader Celsius koldioxidfri inkubator i minst 60 minuter.Programmera den extra cellulära fluxanalysatorn med hjälp av kommandon för blandning, vikt, mått och upprepa. Som ett exempel, ett typiskt experiment med näthinnevävnad kan omfatta följande. Blanda två minuter, vänta två minuter och mät fem minuter.Upprepa experimentet med dessa tre steg mellan fem till åtta gånger för baslinjens inspelning, och efter injektion av varje förening som testas. Tryck på programstartknappen på analysatorn för extracellulär fluss, och följ anvisningarna på skärmen för att sätta in sensorkassetten för kalibrering. I slutet av kalibreringen, följ instruktioner på skärmen för att ersätta calibrant plattan med plattan som innehåller näthinnan prover, sedan låta programmet att köras som programmerad.Vid avslutningen av körningen följer du instruktioner på skärmen för att mata ut vävnadsplattan. Visa resultatet av körningen och lagra datafilen. Med en böjd 20 gauge nål och tämpningar, ta bort alla mesh skär från brunnarna, lämnar näthinnestans bakom.Aspirera försiktigt mediet från vävnaden, och tvätta vävnaden två gånger med 0,5 milliliter kallfosfatbuffrad koksaltlösning. Efter aspirating den andra PBS tvätta, tillsätt 100 mikroliter av lys buffert till varje tvätt, och pipetten upp och ner för att homogenisera vävnad. Slutligen kvanttera ingångsnivåer baserat på totalt dubbelsträngt DNA-innehåll genom att späda ut lyst prov ett till ett, med 100 mikroliter av Tris-EDTA-buffert, och överföra 100 mikroliter av det utspädda provet till en 96 brunnsplatta.Sedan, lägga till 100 mikroliter av detektionsbuffert till varje brunn och blanda i två till fem minuter. Slutligen kvantifiera florescence efter excitation vid 480 nanometer och utsläpp vid 520 nanometer genom att jämföra med en standard kurva. Normalisera den råa extracellulära flux spårning till DNA-innehåll i brunnen.Vid baslinjen, i närvaro av fem milli muller glukos och i närvaro av 10 milli muller pyruvat, det finns ingen signifikant skillnad i andelen sura eflux, mätt med extracellulär försurningshastighet. Mellan näthinnevävnader från wile typ djur, eller slå ut möss som saknar maskiner för att stänga cykliska nukleotid gated jonkanaler som svar på ljus stimuli. Liknande mönster ses efter tillsats av 20 milli muller glukos och den glykolytiska hämmaren 2DG.Dessa data kan matematiskt omvandlas för att representera bråkändringar från baslinjen, ett format som kan möjliggöra bättre jämförelse mellan olika experimentella interventioner. Absolut syreförbrukningshastighet vid baslinjen är också likvärdig mellan kontroll och mutant näthinnevävnad. Tillsats av 20 milli muller glukos ökar mitokondriell andning, men ingen förändring i observerats mellan grupper i termer av absolut kvantifiering eller i fråga om förändring från baslinjen.Tillägg av en milli muller FCCP, en uncoupling agent, att visa maximal mitokondriellt luftvägarna priser inte avsevärt öka OCR över nivån sett med hög glukos i kontroll och mutanta retinal vävnad. Men signaler från båda mössen sjunker drastiskt efter tillsats av RAA cocktail. Sammanfattningsvis visar vi en teknik för quantitating satser av oxiderad fosforylering och glykolys i organotypic explants av mus näthinnan.Med effektiv isolering av näthinnevävnad ger tekniken tillförlitliga och omarbara mätningar. Realtidseffekter av exponeringar, såsom frikopplingsmedel, kan bedömas. Utöver detta förfarande kan andra metoder, som kvantitativa RTPCR och västra blotting, utföras på överskottet vävnad isoleras i dissekering steg för att få parallell information som är relevant för studier av retinal metabolism.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Undersöka Tissue-och orgel-specifika Phytochrome Svar med FACS-assisterad Cell-typspecifika expression profiling i Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Oligo Mass profilering (OLIMP) av Extracellulär Polysackarider

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Kvantitativ mätning av Invadopodia-medierad extracellulär matrix proteolys i enkel-och flercelliga kontexter

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Flera parametrar Mätning av permeabiliteten Transition poröppning i isolerade mus hjärta mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Mätning av extracellulärt jonflöden Använda Jonselektiv självrefererande mikroelektrod Teknik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Mätning och analys av extracellulärt Acid Production att bestämma glykolytisk Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolering, karakterisering och hög genomströmning extracellulära Flux analys av mus primära renala tubulära epitelceller

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

Laser-Capture Microdissection RNA-sekvensering för rumsliga och temporala vävnadsspecifika genuttryck analys i växter

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Bedömning av cellulär bioenergetik i mus hematopoetisk stam och primitiva stamceller med hjälp av extracellulär flödesanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...