Name: cell based assays of sineup non-coding rnas that can specifically enhance mrna translation
Uploaded: 2019-02-01T13:00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation at JoVE.com

هذه الدراسة جزئيا تدعمها منصة برنامج التكنولوجيا والعلوم الأساسية "الطب البيولوجي المبتكرة"، ورقم 17 وأنا 0301014، من وكالة اليابان "البحوث الطبية" والتنمية (AMED)، "منحة بحثية" من يأمرون بمركز الحياة بتبريد تكنولوجيا العلوم ومنحة بحثية من يأمرون بنظام الرصد الدولي بتبريد. ونشكر أعضاء مختبر الكمبيوتر والشبكة سينوب (SISSA وجامعة بيدمونت الشرقية بتبريد) لمناقشات شاحذة للفكر. ونحن نشكر الدكتور ماثيو الحب لتصحيح التجارب المطبعية.

<ol>
	<li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome.">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309 (5740), 1564-1566 (2005).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome.">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li><li>Hon, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+human+long+non-coding+RNAs+with+accurate+5'+ends.">An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5' ends.</a> Nature. 543 (7644), 199-204 (2017).</li><li>Tufarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+antisense+RNA+leading+to+gene+silencing+and+methylation+as+a+novel+cause+of+human+genetic+disease.">Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease.</a> Nature Genetics. 34 (2), 157-165 (2003).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+tumour+suppressor+gene+p15+by+its+antisense+RNA.">Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA.</a> Nature. 451 (7175), 202-206 (2008).</li><li>Carninci, P., Hayashizaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNA+transcription+beyond+annotated+genes.">Noncoding RNA transcription beyond annotated genes.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 139-144 (2007).</li><li>Chu, Y., Yue, X., Younger, S. T., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+argonaute+proteins+in+gene+silencing+and+activation+by+RNAs+complementary+to+a+non-coding+transcript+at+the+progesterone+receptor+promoter.">Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter.</a> Nucleic Acids Research. 38 (21), 7736-7748 (2010).</li><li>Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microRNA+biogenesis.">Regulation of microRNA biogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 509-524 (2014).</li><li>Takahashi, H., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+genome+transcription:+new+possibilities+for+RNA+therapies.">Widespread genome transcription: new possibilities for RNA therapies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (2), 294-301 (2014).</li><li>Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing.">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4, e252 (2015).</li><li>Nishina, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA/RNA+heteroduplex+oligonucleotide+for+highly+efficient+gene+silencing.">DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing.</a> Nature communications. 6, 7969 (2015).</li><li>Carrieri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+antisense+RNA+controls+Uchl1+translation+through+an+embedded+SINEB2+repeat.">Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat.</a> Nature. 491 (7424), 454-457 (2012).</li><li>Schein, A., Zucchelli, S., Kauppinen, S., Gustincich, S., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antisense+long+noncoding+RNAs+that+function+as+SINEUPs+in+human+cells.">Identification of antisense long noncoding RNAs that function as SINEUPs in human cells.</a> Scientific Reports. 6, 33605 (2016).</li><li>Zucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINEUPs+are+modular+antisense+long+non-coding+RNAs+that+increase+synthesis+of+target+proteins+in+cells.">SINEUPs are modular antisense long non-coding RNAs that increase synthesis of target proteins in cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 174 (2015).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+features+of+synthetic+SINEUPs,+antisense+lncRNAs+that+specifically+enhance+protein+translation.">Identification of functional features of synthetic SINEUPs, antisense lncRNAs that specifically enhance protein translation.</a> PLOS ONE. 13 (2), e0183229 (2018).</li><li>Deutschbauer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169 (4), 1915-1925 (2005).</li><li>Indrieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+long+non-coding+RNAs+[SINEUPs]+rescue+defective+gene+expression+in+vivo.">Synthetic long non-coding RNAs [SINEUPs] rescue defective gene expression in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 27315 (2016).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mammalian+cell+factories+with+SINEUP+noncoding+RNAs+to+improve+translation+of+secreted+proteins.">Engineering mammalian cell factories with SINEUP noncoding RNAs to improve translation of secreted proteins.</a> Gene. , (2015).</li><li>Sasso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+non-coding+SINEUP+RNA+boosts+semi-stable+production+of+fully+human+monoclonal+antibodies+in+HEK293E+cells.">A long non-coding SINEUP RNA boosts semi-stable production of fully human monoclonal antibodies in HEK293E cells.</a> MAbs. , 1-8 (2018).</li><li>Dang, V. T., Kassahn, K. S., Marcos, A. E., Ragan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+haploinsufficient+genes+and+their+genomic+proximity+to+segmental+duplications.">Identification of human haploinsufficient genes and their genomic proximity to segmental duplications.</a> European Journal of Human Genetics. 16 (11), 1350-1357 (2008).</li><li>Zucchelli, S., Patrucco, L., Persichetti, F., Gustincich, S., Cotella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Translation+in+Mammalian+Cell+Factories+to+Increase+Protein+Yield:+The+Unexpected+Use+of+Long+Non-Coding+SINEUP+RNAs.">Engineering Translation in Mammalian Cell Factories to Increase Protein Yield: The Unexpected Use of Long Non-Coding SINEUP RNAs.</a> Computational and Struct Biotechnology Journal. 14, 404-410 (2016).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24 (15), 1634-1644 (2010).</li><li>Watts, J. K., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+disease+genes+in+the+laboratory+and+the+clinic.">Silencing disease genes in the laboratory and the clinic.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 365-379 (2012).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells.">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (7), 670-676 (2014).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Liu, X., Harada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+isolation+from+mammalian+samples.">RNA isolation from mammalian samples.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Severin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+visualization+and+analysis+of+large-scale+sequencing+datasets+using+ZENBU.">Interactive visualization and analysis of large-scale sequencing datasets using ZENBU.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 217-219 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAe:+an+effective+method+for+targeted+protein+translation+enhancement+by+artificial+non-coding+RNA+with+SINEB2+repeat.">RNAe: an effective method for targeted protein translation enhancement by artificial non-coding RNA with SINEB2 repeat.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), e58 (2015).</li><li>Savi&#263;, N., Schwank, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapeutic+CRISPR/Cas9+genome+editing.">Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Translational Research. 168, 15-21 (2016).</li><li>Long, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAe+in+a+transgenic+growth+hormone+mouse+model+shows+potential+for+use+in+gene+therapy.">RNAe in a transgenic growth hormone mouse model shows potential for use in gene therapy.</a> Biotechnology Letters. , (2016).</li></ol>

صاحب المقابلة بييرو كارنينسي هو أحد مؤسسي شركة التكنولوجيات ترانسيني الذي يحتفظ بالملكية الفكرية على براءة قدم (EP2691522A4 و JP2017169573A)، ومنح البراءات (US9353370B2) للتكنولوجيا سينوب.

وصفت لنا هنا بروتوكولا لتعزيز إنتاج البروتين على وجه التحديد الهدف مرناً عن طريق المحتوية على شرط غير الترميز الجيش الملكي النيبالي، يسمى سنوبس. وكمثال ممثل، يرد سينيوب الاصطناعية الأمثل-بروتينات فلورية خضراء لمتابعة تنظيم ترجمة مرناً بروتينات فلورية خضراء 2.6-fold كما تقاس بتحليل وصمة عار الغربية.
تصميم دينار بحريني أمثل أمر حاسم لضمان خصوصية سينوب وفاعلية (مدى يصل البروتين-التنظيم). سابقا، ونحن فحص 17 خدمات تنمية الأعمال التجارية من سينوب-التجارة والنقل بالغربية-لطخة تحليل15 ووجد أن دينار بحريني الأمثل يتراكب تسلسل أغسطس-كوزاك مرناً بروتينات فلورية خضراء، على الرغم من أنه قد لا يكون الحال بالنسبة لسائر مرناس وينبغي التحقق من كل حالة. أيضا فحص مجموعة مستقلة أخرى تستخدم طريقة مختلفة31دينار بحريني. كما فحص العديد من خدمات تنمية الأعمال التجارية يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً جداً ومرهقة، قدمنا طريقة كشف سينوب الفائق هنا. هذا الأسلوب يقيس التغيرات النسبية في كثافة التجارة والنقل المتكامل في سينوب transfected-الخلايا مقارنة بمكافحة ناقلات الأمراض transfected-الخلايا. لضمان أن يتم transfected الخلايا في بئر معينة للوحة الثقافة على قدم المساواة وبروتينات فلورية خضراء إشارة لا تتركز على منطقة معينة من البئر، من المهم جداً لتوزيع الخلايا على قدم المساواة في الآبار في الخطوة 2، 1. لهذا الغرض، بلطف يهز لوحة 10 مرات ذهابا وإيابا (↑↓) بعد زرع الخلايا داخل هيئة نظيفة وكرر في الحاضنة2 CO 5% قبل البدء في الحضانة.
خطوة حاسمة أخرى يتم حساب تركيز البروتين في الخطوة 3، 3. الحسابات الخاطئة هنا يمكن أن يؤدي إلى تحميل مبلغ الخاطئة للبروتين أثناء تحليل وصمة عار الغربية، وبالتالي منع الكشف عن التغيرات الصغيرة في التعبير البروتين ببعض سنوبس ضعيفة أو توليد المغلوطة من الحمولة الزائدة. من المستحسن طازجة إعداد المنحنى المعياري البروتين كل مرة، والتأكد من أن يتم قياس كميات متساوية من المعايير وعينات البروتين في خطوة 3.3.3. البروتوكول الموصوفة هنا يركز على سينيوب-التجارة والنقل، ولكن يمكن استخدام التحليل الغربية-وصمة عار لأي استهداف مرناً للفائدة. ينبغي أن يكون الأمثل في وقت الحضانة وتركيز الأجسام المضادة لكل هدف للحصول على أفضل نتيجة لذلك.
واحدة من السمات الفريدة سنوبس أن مستوى التعبير الهدف مرناً وتظل غير متأثرة. من المهم التعامل مع الجيش الملكي النيبالي مع الدناز لتجنب الكشف عن سنوبس ترانسفيكتيد والحمض النووي بواسطة qRT-بكر. الكشف سينيوب والتعبير مرناً الهدف ينبغي أن تقاس قرت-PCR لتأكيد نجاح تعداء والنشاط سينيوب. سنوبس تحتوي على تسلسل جيب، ووفيرة في جميع أنحاء البشرية وجينوم الفأر. لتجنب الكشف غير محددة شرط متواليات، لا ينصح لتصميم كبسولة تفجير qRT-بكر لتسلسل جيب.
في هذا البروتوكول استخدمنا خطوط الخلايا البشرية، ولكن سنوبس الناجعة في عدد من خطوط الخلايا من عدة أنواع مختلفة12،13،14،،من1819. يمكن تعديل شروط الثقافة وتعداء الخلايا وفقا لخطوط الخلايا المختلفة ما دامت هذه المحافظة على كفاءة تعداء موجهات سينوب. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام أساليب بديلة لاستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا، والتحقق من تركيز البروتين، نظراً إلى أن تحافظ على نوعية البروتين والحمض النووي الريبي مطلوب بكر قرة وتحليل وصمة عار الغربية. بينما كنا محددة في سيتوميتير الصغرى، حسنا الفائق، الذي مكن كشف الأسفار التجارة والنقل عبر البئر كامل، سيتوميتيرس الأخرى بالكشف عن مجموعة مماثلة يمكن أن تستخدم31. جدير بأن إذا كان توزيع الخلايا وتعداء متساوون في جميع أنحاء بئر، ثم أنه من غير الضروري تفحص البئر كله للأسفار التجارة والنقل: نصف أو ربع من منطقة بئر قد تكون كافية لتمييز تأثير سينوب اعتماداً على التجربة نادي المهارات.
وضع بروتوكول اكتشاف سينوب الفائق يسمح للفحص المتزامن من خدمات متعددة تستهدف مرناً معين في الخلايا المستزرعة. هذا أمر هام نظراً للقواعد المنظمة لاستهداف الأمثل بدينار بحريني لا يزال غير واضح. هذه متعدد فحص نظام يسمح لاختبار على نطاق واسع من سنوبس كثيرة ضد جينات مختلفة، مفيدة لاستهداف جينات متعددة تشترك في مسار إشارات معينة على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن استخدامها لتوسيع نطاق البحث عن سنوبس فعالة تستهدف مرناس عدة، تصميم "خدمات سينوب" مختلفة حول المنطقة أغسطس-كوزاك (انظر الشكل 1)، شارك ترانسفيكتينج كامل طول الهدف مرناس (UTR UTR-الأقراص المدمجة-3ʹ 5ʹ) تنصهر مع مرناً بروتينات فلورية خضراء في الخلايا المستزرعة للعثور على سنوبس الأمثل، وبعد ذلك اختبار المرشحين دينار بحريني ضد مرناً الذاتية في الخلايا المستزرعة والحيوانات الحية في نموذج، من البشر والفئران إلى غيرها من الأنواع الحيوانية والنباتية.
هذا البروتوكول الفحص بسرعة جداً. نحن لسنا في حاجة إلى إصلاح، وجمع الخلايا، ولكن فقط بحاجة إلى مكان المعيشة الخلية لوحة الثقافة في الصك التصوير. نقترح أن تستخدم هذا البروتوكول الفرز الفائق لتحديد "خدمات تنمية الأعمال التجارية سنوبس" الأمثل، وتقييم المرشحين المحتملين عن طريق تحليل وصمة عار الغربية. وهكذا، يمكن تطبيقها المرشحين المختارين مع الأمثل خدمات تنمية الأعمال التجارية لزيادة جسم إنتاج18،،من1921. حاليا، يتزايد جذريا الميدان العلاجي الجيش الملكي النيبالي. على سبيل المثال، siRNA واسو ومرناً، والعلاجات "كريسبر الجيش الملكي النيبالي"، وتستخدم على نطاق واسع للتحكم في التعبير مرناً أهداف كل منها9،32. وفي هذا السياق، سينيوبس في مراحلها الأولى، ولكن حتى الآن أيا من سينيوبس درس تغيير التعبير عن مرناس المستهدفة. وبالإضافة إلى ذلك، لا تحرير سينيوبس استهداف مرناً، ولكن فقط حتى تنظيم ترجمة مرناً. وعلاوة على ذلك، يمكن استهداف خسارة للدالة الأمراض الناتجة عن هابلوينسوفيسينسي بالعلاج سينوب، تحقيق إضعاف التعريفي17،نقص البروتين33. على الرغم من أن الآثار خارج الهدف تحتاج إلى مزيد من الدراسة، سينيوبس المحتملة، وعلى وجه التحديد استهداف مرناً واحد، أعرب مع تسلسل مكملة لدينار بحريني.
حد لهذا البروتوكول الفائق أنها ليست مناسبة "خدمات تنمية الأعمال التجارية سنوبس" الشاشة في الماوس المجراة في نماذج لتدابير البروتوكول التجارة والنقل المتكاملة لكثافة فقط. كما سنوبس لنكرناس العقاقير الطبيعية التي تعمل بوستترانسكريبتيونالي، لا يمكن تطبيقها عند الهدف مرناً مفقود في الخلايا أو عينات الأنسجة.
ومع ذلك، يمكن تطبيق سنوبس لدراسات مكسب للدالة، لتعزيز إنتاج الأجسام المضادة، و كعلاج الحمض النووي الريبي لمتابعة تنظيم التعبير عن نقص البروتينات داخل نطاق 1.5-3.0-إضعاف. الأساليب الموصوفة هنا يقدم دليلاً مفيداً لاستهداف والكشف عن الترجمة التي يسببها سينيوب تعزيز مرناً المنشودة وتوفير أداة جديدة لتنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال.

في حقبة ما بعد الجينوم، اكتسبت العديد من الأفكار إلى أدوار تنظيمية الجينات غير ترميز النصوص العقاقير نظراً لتطوير الجيل التالي تسلسل التكنولوجيات1،،من23 و أدوات تحرير الجينات. هذه الفئة من النصوص، التي كانت تعتبر سابقا أن يكون "سلة المهملات النسخي"، ثبت الآن كلاعب رئيسي من المادة الوراثية. محاضر العقاقير أفيد بأن تعدل الكروماتين والاستقرار التحكم والتعبير عن تلك المشابهة ترميز البروتين معنى مرناً4،5. في معظم الحالات، هذا النمط من التنظيم سلبي والمستنسخات العقاقير إسكات نظرائهم الإحساس عن طريق الحمض النووي الريبي الريبي التفاعلات6،7. هذه سمة النصوص العقاقير الطبيعية قد استخدمت للجينات دوونريجولاتي المطلوب في شكل الاصطناعية الصغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، ميكرورنا (ميرنا)، والعقاقير أوليجوس (أسو)8،9،10 ،11 ترك فراغاً تكنولوجية لاستهداف أعلى-تنظيم الجينات.
دراسة مثيرة للاهتمام واحد تغيير منظور مجال الحمض النووي الريبي العقاقير بإثبات أن antisense طويلة غير الترميز الكشف (مثل لنكرناس) من الجينات Uchl1 (هيدرولاز ubiquitin الطرفية ج L1) أوكست (أوبيكويتوسلي-أعرب عن نسخة) تنظيم إيجابي ترجمة بهم قرابة بمعنى مرناً على مستوى بوستترانسكريبشونال في الفئران12. نهاية 5ʹ من هذه لنكرناس يتداخل مع عدة قواعد في المنطقة غير مترجمة 5ʹ (5ʹ UTR) هذه النصوص معنى المقابلة، ويحتوي على نهاية 3ʹ غير متداخلة تكرار مقلوب ريتروترانسبوسون المنتمين إلى القصير ويتخلل النووية الأسرة عنصر (شرط). من المثير للاهتمام، وجدنا أن القوة الدافعة الرئيسية وراء هذا التنظيم يصل متعدية كرر جيب جزءا لا يتجزأ، وأنه لا يقتصر على الماوس جيب يكرر فقط. الإنسان الو تكرار المحتوية على لنكرناس أيضا تعزيز ترجمة مرناس الإحساس بالهدف، يعزز فكرة فئة جديدة من antisense التنظيمية يحركها شرط الكشف، غير الترميز المسمى سنوبس13. وأظهرت الدراسات الأخيرة أن إمكانات طبيعية سينيوبس يتم الاحتفاظ بها في سينيوبس الاصطناعية يستهدف على وجه التحديد الهدف الجينات داخلية وخارجية مختلفة14،15. سينيوبس أن اثنين من السمات الهامة: الأولى "المجال ملزمة" (دينار بحريني) عموما وهي منطقة نهاية 5ʹ مكملة للتسلسل الذي يشمل المرحلة الابتدائية تبدأ كودون مرناً ترميز البروتين، والثانية "المجال المستجيب" (ED) كما أنه يشتمل مقلوب تكرار للشرط الذي شرط مسبق ل الدالة سينوب14 (الشكل 1). يمكن تخصيص سنوبس لتصميم دينار بحريني على وجه التحديد استهداف جين للاختيار. ثم هذا يمكن تسخيرها لتشريح وظيفة الجينات خاصة تشارك في مسار بيولوجية، كبديل أفضل لاستراتيجية overexpression مرناً تقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه الأداة تنوعاً لزيادة إنتاج الأجسام المضادة، و كدواء لعلاج الأمراض هابلوينسوفيسينت التي تسببها جرعات غير كافية من البروتينات الوظيفية16،،من1718، 19،،من2021.
وتتعدد مزايا التكنولوجيا سينوب. فإنه لا يغير من التعبير عن الهدف على المستوى النسخي. أطول خدمات تنمية الأعمال التجارية توفر المزيد من الخصوصية سنوبس، بينما لا يحفز استجابة إجهاد دسرنا-تعتمد على15. يتم الحفاظ على استحثاث البروتين داخل مجموعة الفسيولوجية العادية للخلية، والحيلولة دون أي تأثير ضار بسبب التعبير البروتين شاذة أو مفرطة. سينيوبس متوافقة مع مجموعة متنوعة واسعة من الماوس، والبشرية، ومثقف الهامستر خطوط الخلايا، على سبيل المثال، HEK293T/17، HepG2، هيلا، شو، MN9D، والعديد من أكثر12،13،،من1415،18 ،19. يمكنك استهداف سنوبس الكفاءة الذاتية الجينات والجينات overexpressed عابر ومعلم العلم أو لوسيفراس-الانصهار الجينات، مما يلغي الحاجة للأجسام المضادة الخاصة بالجينات14،18. تحليل سينيوب الأساسية يتطلب ثقافة الخلية الروتينية وتعداء والصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، الوقت الحقيقي النسخ العكسي الكمية-بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرت-PCR) الصكوك والإعدادات، و يمكن اكتساب الخبرة في فترة زمنية قصيرة.
وهنا يصف لنا أسلوباً لاستهداف الجينات مع سنوبس الاصطناعية لمتابعة تنظيم الترجمة، تأثير خلافا لغيرها من التكنولوجيات مثل الحمض النووي الريبي التدخل9 واسو جابميرس11،،من2223. أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتنشيط الجينات الموجهة بالجيش الملكي النيبالي هو متفاوت المسافات بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب المستندة إلى تكرار التنشيط (كريسبرا)، حيث يتم تشغيل تعبير الجينات في المستوى النسخي24. يتطلب هذا الأسلوب، بسيطة وسريعة، على الرغم من عدة دليل واحد الكشف (سجرناس) استهداف الجين نفسه لكفاءة أعلى، مما يزيد من فرص ربط خارج الهدف25. وبالإضافة إلى ذلك، قد الإنزيم الرئيسية للنظام كريسبرا، البروتين حفازة الميت المرتبطة كريسبر 9 (dCas9) خصوصية ملزمة منخفضة واستهداف سجرناس مناطق المروج ثنائي الاتجاه يمكن غير-متابعة-تنظم تحديداً القريبة الجينات25. على العكس من ذلك، سينيوبس ربط لاستهداف مرناً في منطقة ملزم واحد مع خصوصية عالية، ولا تؤثر على الجينات القريبة. ونحن نناقش الخطوات الأساسية المتبعة في تصميم سينوب تعداء والبروتين والحمض النووي الريبي تعبير تحاليل. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم شبه الآلي، الفائق تصوير نظام الشاشة سنوبس متعددة في وقت واحد، ومفيد للكشف عن سنوبس الأمثل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Synthetic SINEUP</td>
			<td>Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan</td>
			<td>https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320</td>
			<td>Step 1.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/17</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-11268</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6902A01</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-124</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C2</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6083-1</td>
			<td>Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#9803S</td>
			<td>Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8553S</td>
			<td>Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>#5000112JA</td>
			<td>Step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 &#181;l</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>#4561035</td>
			<td>Step 4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm&#215;4 m)</td>
			<td>Amasham</td>
			<td>10600013</td>
			<td>Step 4.3., This is a 0.45 &#181;m nitrocellulose membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#9999S</td>
			<td>Step 4.4. A component of the blocking solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Tag Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-6455</td>
			<td>Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-Actin antibody produced in mouse</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A5441</td>
			<td>Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0448</td>
			<td>Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0447</td>
			<td>Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti &#946;-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Detection Reagents</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN2109</td>
			<td>Step 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AS4500</td>
			<td>Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AS1390</td>
			<td>Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ambion</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>6110A</td>
			<td>Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>Step 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst3342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Step 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>200-BFFL-S</td>
			<td>Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell based assays of sineup non-coding rnas that can specifically enhance mrna translation

بروتين يستهدف تعزيز أهمية ليس فقط لدراسة العمليات البيولوجية وإنما أيضا لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية والعلاجية. وهنا، نقدم أسلوباً انتقائيا حتى-تنظيم التعبير البروتين المطلوب الجينات في الخلايا المستزرعة عن طريق antisense الاصطناعية غير الترميز الكشف المعروفة باسم سينيوبس. عنصر التحكم هذا إيجابيا للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال وتمارسها مقلوب قصيرة اينتيرسبيرسيد النووي عنصرا (شرط) كرر في نهاية 3ʹ سينيوبس التي تضم المجال المستجيب (ED). يمكن ربط سنوبس على وجه التحديد أي مرناً ترميز البروتين من الاختيار من خلال المجال ملزم به (دينار بحريني)، منطقة مصممة لتكملة التسلسل داخل المنطقة غير مترجمة 5ʹ (5ʹ UTR) وما حولها كودون بداية من مرناً. سنوبس محددة الهدف المصممة بهذه الطريقة هي transfected الخلايا المستزرعة، ويتم استخراج البروتين والحمض النووي الريبي المصب التحليلات، عموما تعداء بعد ح 24-48. الكشف عن البروتينات المستحثة سينوب أعلى-التنظيم بواسطة تحليل وصمة عار الغربية والتعبير الحمض النووي الريبي يقاس باستخدام النسخ في الوقت الحقيقي عكس الكمي PCR. وقد لاحظنا أن تصميم دينار بحريني أمر حاسم لتحقيق أمثل سينوب النشاط وأن اختبار مختلفة الأحجام دينار بحريني والمواقف فيما يخص كودون ابدأ الهدف مرناً ويوصي. ولذلك نحن هنا وصف أسلوب تصوير الفائق شبه إليه يقوم على الكشف عن الأسفار التي يمكن تنفيذها للهدف مرناً تنصهر مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). سنوبس على وجه التحديد تعزيز الترجمة ضمن مجموعة الفسيولوجية العادية للخلية، دون تغيير مستوى نص الهدف. وقد استخدمت هذا الأسلوب بنجاح ضد مجموعة من الأهداف الداخلية والخارجية، في مجموعة متنوعة واسعة من البشرية، والماوس، وخطوط الخلية الحشرات جنبا إلى جنب مع نظم المجراة. وعلاوة على ذلك، أبلغ سنوبس على زيادة إنتاج الأجسام المضادة والعمل كالحمض النووي الريبي علاجية ضد الجينات هابلوينسوفيسينت. طبيعة تنوعاً ووحدات سنوبس يجعل منها أداة مناسبة لمراقبة المتعدية الجينات على حدة.

سينوب-التجارة والنقل هو سينوب اصطناعية التي تحتوي على كل دينار بحريني أمثل (-28/+ 4 تتداخل مرناً التجارة والنقل) واد (معكوس جيب B2 من AS-Uchl1) التي يمكن أن تصل-تنظيم الترجمة مرناً التجارة والنقل (الشكل 3 ألف و 3 باء) دون تغيير على التعبير عن التجارة والنقل مرناً (الشكل 3 و 3D). إلى الشاشة الأمثل خدمات تنمية الأعمال التجارية وبطولة العالم سنوبس، قمنا بتطوير بروتوكول تحليل الصور شبه الآلية التي تحسن الكشف عن الوقت وزيادة عدد العينات التي يجري فحصها في وقت واحد مقارنة مع تحليل وصمة عار الغربية تقليدية15. كما هو موضح في الشكل 4، استغرق هذا نظام التصوير الفائق 3 أيام (تحليل وصمة عار الغربية استغرق أسبوعين سنوبس 48). بعد أن أثبتت أن سينوب-التجارة والنقل يزيد الترجمة التجارة والنقل، ونحن بالكشف عن كثافة التجارة والنقل المتكاملة سيتوميتير الصورة. أمثل دينار بحريني من سينوب-التجارة والنقل الناجمة عن زيادة بنسبة 1.4-fold في التعبير البروتين بروتينات فلورية خضراء. على الرغم من أننا لاحظنا ضغط الإشارات الصادرة من 2.6-fold (تحليل وصمة عار الغربية، انظر الشكل 3 ألف) إلى 1.4-fold (التصوير التحليل، انظر الشكل 5)، قد يكون الفرق بسبب معايرة برامج أداة التصوير. ومع ذلك، نحن في الكشف عن مستويات أعلى بكثير من الأسفار التجارة والنقل بالمقارنة مع عنصر التحكم (الشكل 5A و 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig1.jpg"> رقم 1: التصميم الأساسي سنوبس الاصطناعية. دينار بحريني = المجال ملزمة لاستهداف مرناً، اد = المستجيب المجال الذي يحتوي على تسلسل جيب مقلوب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig2.jpg"> الشكل 2: النسخ ابتداء من مواقع (تحديد) من البروتين مرض باركنسون البشرية 7 (PARK7) مرناً في أنسجة محددة والخلايا كما الكشف عنها بواسطة تحليل القفص. تظهر نتيجة بحث في خدمات الدعم التقني للبشرية مرناً PARK7 استخدام تكامل البيانات اوميكس والتصور التفاعلية نظام30لقطة (A) A. السهم الأخضر الأفقي في المسار hg19 الجينات Entrez يشير إلى موضع الجينوم الإشارة البشرية PARK7 مرناً والأشرطة الرأسية الخضراء في 1 القفص FANTOM5 ومسارات 2 تشير إلى مجموع تحديد (قياس كمحاضر كل مليون (tpm)) من 1,829 أنواع من الأنسجة والخلايا. (ب) تكبير المنطقة ملحوظ لخدمات الدعم التقني في الفريق A (مقياس 1/354: 35.4 كيلو بايت إلى 100 شركة بريتيش بتروليوم). رمادي المظللة منطقة في قفص FANTOM5 المرحلة المسارات 1 و 2 يشير إلى خدمات الدعم التقني من 6 خلايا معينة من أصل مجموع 1,829، وهي مدرجة في الجزء السفلي من الشكل. الأرقام (11.369، 4.998، 4.304، 3.509، 3.477 و 3.055) المقابلة لهذه الخلايا المذكورة تشير إلى نصوص كل مليون لكل خلية محددة في الرمادية مظللة المواقف لخدمات الدعم التقني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig3.jpg"> رقم 3: تحليل وصمة عار الغربية تؤكد اللائحة حتى للترجمة التي سينوب-التجارة والنقل- (A) سينوب-التجارة والنقل بوصمة عار الغربية دراسة مع الأجسام المضادة-التجارة والنقل. (ب) نتائج تم تطبيع لشدة الفرقة البروتين β-أكتين. (ج) التجارة والنقل مرناً والتعبير "الكشف سينوب" (د) تم الكشف عن طريق قرة-بكر. ف < 0.0005، n = 3، اختبار t-التائي، أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكاهاشي et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig4.jpg"> الشكل 4: التخطيطي لتحليل الصور شبه الآلي سينيوب. يوم 1: خلايا البذور من الفائدة في صفيحة جيدا 24. يوم 2: ترانسفيكت التجارة والنقل وسينوب-التجارة والنقل. يوم 3: تحليل تأثير سينيوبس بقياس كثافة التجارة والنقل المتكاملة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig5.jpg"> الرقم 5: تحليل الفائق للترجمة الأعلى-التنظيم من جانب سينوب-التجارة والنقل- (أ) مقارنة بين الأسفار التجارة والنقل بين التحكم وسينيوب-بروتينات فلورية خضراء transfected الخلايا15. شريط المقياس = 2-(ب) التجارة والنقل تم تطبيع كثافة المتكاملة لعدد الخلايا مجموع حسابها عن طريق تلطيخ النووية مع هويشت 33342. ف < 0.0005، n = 3، اختبار t-التائي، أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري. فوف: مجال الرؤية. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكاهاشي et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation at JoVE.com

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

الخلية على أساس فحوصات للكشف التي يمكن أن تعزز على وجه التحديد مرناً الترجمة غير الترميز سينيوب

سنوبس هي الاصطناعية العقاقير غير الترميز الكشف، التي تحتوي على مجال ملزمة (دينار بحريني) ومجال المستجيب (اد) ومتابعة تنظيم الترجمة من استهداف مرناً. هنا، نحن تصف أساليب الكشف سنوبس في خطوط الخلايا المستزرعة، تحليل لنشاطهم تشجيع الترجمة بوصمة عار الغربية وإنتاجية عالية شبه الآلي نظام التصوير.

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية، مثل كيفية تخفيف نشاط الجين بشكل إيجابي، من خلال الاستفادة من الـ mRNAs الموجودة في الخلايا والأنسجة. كيفية التعويض عن أوجه القصور في النشاط، وكيفية تحقيق ترجمة عالية من mRNAs في المختبر وفي الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا على مستوى العالم فحص الجينات المستهدفة SINEUP في الخلايا الحية ، عن طريق التصوير دون تثبيت وجمع.وبالتالي فإن الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى العلاج لدينا من حالات haploinsufficient، لأن SINEUPs يمكن أن تحفز زيادة ضعفي في البروتين الناقص، مثل frataxin في حالات ترنح فريدريش. للبدء، افتح متصفح Zenbu، وانقر على قاعدة بيانات مشروع فانتوم ذات الاهتمام. البحث في الجين الهدف، والتحقق من موقع بدء النسخ، أو TSS، ومستوى التعبير في الخلايا والأنسجة المطلوبة.لتحديد TSS، راجع مثال تحليل بروتين مرض باركنسون سبعة، أو PARK7 مرنا. تحقق TSS حسب منطقة ذروة القفص. لتحديد مستويات التعبير النسخية الخاصة بالخلايا والأنسجة، حدد منطقة ذروة القفص وانقر على تكبير منطقة الجينوم للتحديد.تحقق من التعبير PARK7 في نوع الخلية والأنسجة من الفائدة، من خلال استكشاف قائمة التعبير النص في الجزء السفلي من الصفحة. ثم، تصميم تسلسل المجال ملزمة من عدة أطوال مختلفة المقابلة 40 قواعد المنبع، و 32 قواعد المصب من الميثيونين الأول أو أغسطس. قبل نقل الدم مع SINEUPs، خلايا البذور ذات الأهمية على اثنين من بولي دي ليسين المغلفة 24 لوحات جيدا، كما هو موضح في المخطوطة.احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 خمسة في المئة لتحقيق التقاء 70 في المئة. من المهم جدا لتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار، لهذا الغرض يهز بلطف لوحة 10 مرات ذهابا وإيابا بعد بذر الخلايا داخل مقعد نظيفة، وتكرار في حاضنة CO2 خمسة في المئة. بعد الحضانة، تغيير المتوسطة إلى 0.4mL من المتوسطة الطازجة.لتحليل SINEUP-GFP جعل عدة أنابيب 1.5mL مع 0.1mL من حل مختلط، مع pEGFP-C2، SINEUP-GFP، الكواشف transfection و OptiMEM في كل أنبوب، ومن ثم احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة 0.1mL من هذا الحل المختلط من كل أنبوب إلى بئر منفصلة من 24 لوحة بئر، وتسمية هذه الآبار مع SINEUP-GFP واحد، اثنين، ثلاثة، أربعة، وخمسة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 خمسة في المئة لمدة 24 ساعة.بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مع 0.5mL من برنامج تلفزيوني. إضافة 25uL من 0.05 في المئة الوزن لكل حجم التربسين، واحتضان في حاضنة CO2 خمسة في المئة لمدة خمس دقائق. إضافة 275uL من خلية المتوسطة في البئر.لاستخراج البروتين، واتخاذ واحدة من اثنين من لوحات، وحصاد 225uL أو ثلاثة أرباع الخلايا من بئر واحد، و 75uL أو ربع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، كل في أنبوب 1.5 مل منفصلة. جهاز طرد مركزي عند 6000xg لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة المابير من الأنبوب المسمى عزل البروتين.إضافة 60uL من محلول التحلل إلى الخلايا ومزيج عن طريق المزج الأنابيب بدقة عن طريق تدوير بسرعة بطيئة لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. الطرد المركزي الأنبوب في 14، 000xg لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية لجمع البروتين الفائق. لتحديد تركيز البروتين، قم أولاً بإعداد خمس إلى ست مرات من تخفيف بروتين مصل البقر الطازجة في الماء النقي جداً، مع تركيزات تتراوح بين 0.2 إلى 1.5 ملغ/مل بروتين.لإعداد عامل الكاشف مزيج داش إضافة 20uL من الكاشف S إلى مل واحد من الكاشف A في أنبوب مل اثنين. إضافة خمسة uL من الماء كتحكم سلبي. وبعد ذلك، BSA معيار أو عينة البروتين في كل بئر.إضافة 25uL من الكاشف A داش، ثم قم بإضافة بعناية 200uL من الكاشف B في بئر، وتجنب أي تشكيل فقاعة. غطي الطبق برقائق الألومنيوم لاحتضانه في درجة حرارة الغرفة، لمدة خمس إلى ثماني دقائق. قياس امتصاص البروتين في 750nm مع مطياف.إعداد منحنى قياسي عن طريق رسم تركيزات البروتين القياسية BSA على المحور س، وامتصاص كل منها على محور y. تطبيق معادلة منحنى قياسي لحساب تركيز البروتين العينة. لبدء فصل البروتين، إضافة حجم واحد من صبغة التحميل 2x إلى كل حجم من عينة البروتين.سخني 90 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، وبرد على الجليد على الفور لمدة دقيقة واحدة. تحميل 10 إلى 20 ميكروغرام من عينات البروتين إلى 10 في المئة SDS هلام polyacrylamide وفصل في 100 إلى 150V. نقل البروتين من هلام، إلى 0.5 ميكرومتر النيتروسليلوز الغشاء، عن طريق أداة نقل شبه الجافة.تعبئة مع المخزن المؤقت نقل في 25V لمدة 30 دقيقة. بعد النقل ، ضع الغشاء في وعاء ، وأضف محلول الحجب حتى يتم نقع الغشاء تمامًا ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز. إضافة الأجسام المضادة المناسبة إلى حل حجب، وصب على الغشاء.التهجين عن طريق احتضان الغشاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في حين تهتز. بعد التهجين، وغسل الغشاء بإضافة 1X TBST العازلة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكرر مرتين أكثر. تنفيذ التهجين المقبل مع جسم مضاد الثانوية المخفف في محلول منع على الغشاء، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الاهتزاز.ثم غسل الغشاء بإضافة 1X TBST العازلة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكرر مرتين أكثر. نقل الغشاء إلى مربع مليئة اثنين مل من هكهى الموارد البشرية تعزيز مزيج الكاشف ECL. غطي الصندوق بورق الألومنيوم، وينضّب لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.قم بإزالة الغشاء بعناية من مزيج كاشف ECL، وفضحه باستخدام أداة تصوير الإنارة. لتحليل تأثير SINEUP-GFP في الخلايا عن طريق التصوير، قم بغسل pEGFP-C2، وخلايا SINEUP-GFP من ثاني 24 بئراً مع 0.5 مل من PBS لكل بئر. لطخة النواة، إضافة 2 ميكروغرام من Hoechst-33342 إلى كل بئر، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، لمدة 20 دقيقة.استخدام مقياس خلايا الصورة microwell microwell عالية الإنتاجية لقياس خلايا هويشست الملون، لحساب العدد الإجمالي للخلايا. قياس شدة الفلورس الأخضر لحساب عدد الخلايا الإيجابية GFP. لتحليل تأثير التراكم البروتيني للـ SINEUPs، استخدم برنامج التصوير لتحديد كثافة GFP المتكاملة حسابها كمجموع كل كثافة بكسل عرض إشارات في الكائنات المجزأة التي تم الحصول عليها لكل قناة.بعد عملية نقل ناجحة مع SINEUP-GFP، وهو SINEUP الاصطناعية التي تحتوي على كل من مجال الربط الأمثل ومجال الأثر GFP، تم رفع ترجمة MRNA دون تغيير التعبير من الحمض النووي العام. وقد أدى بروتوكول تحليل الصور شبه الآلي إلى تحسين وقت الكشف وزيادة عدد العينات التي يتم فحصها في وقت واحد مقارنة بتحليل البقعة الغربية التقليدية. على الرغم من وجود فرق في كثافة الإشارة، من 2.6 ضعف في تحليل البقعة الغربية إلى 1.4 ضعف في تحليل التصوير، تم الكشف عن مستويات أعلى بكثير من الفلوريسينس GFP مقارنة بالسيطرة.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر لتحديد التسلسل الصحيح من mRNAs الهدف لتصميم مجال الربط الصحيح. وغالبا ما يتم نسخ الجينات من المروجين، ويمكن استخدام موقع بدء الترجمة المختلفة. متصفح Zenbu هو أداة مفيدة جدا لاستكشاف هذا التباين مرنا.نقترح أيضا تصميم SINEUPs مختلفة مع مواقع الربط المتغير. وإجمالا، نعتقد أن التكيف السريع مع أهداف سينويب مع عدد كبير من الأهداف سينشئ مجالا جديدا يتمثل في ترجمة منظمة بشكل إيجابي للرناب الرنا الحالية، وهو مجال تبادلي ومجامٍ لحقل الرنا. جزء من تلك الوظيفة ونحن نتصور أن هذه التكنولوجيا سوف تكون مفيدة لإنتاج كميات أكبر من البروتينات في المختبر، مثل المفاعلات الحيوية، وكذلك في الجسم الحي لتصحيح الجرعة الجينية بشكل طبيعي.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

وسم الأيضية والتنميط لنقل الكشف باستخدام ماكروارايس

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

الاعتداء على أساس البيوتين المنسدلة للتحقق من صحة مرناً ميرناس "الأهداف الخلوية"

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

الهندسة الوراثية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "الخلايا استناداً إلى" التحديد والنمو في البكتيريا

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing الكشف فضله منذ فترة طويلة باستخدام الجينات-تفعيل كريسبر

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...