Name: cell based assays of sineup non-coding rnas that can specifically enhance mrna translation
Uploaded: 2019-02-01T13:00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation at JoVE.com

这项研究得到了日本医学研究和发展署 (amed) 第17am0301014 号《创新生物医学基础科学和平台技术计划》、mext 向 riken 生命中心提供的研究补助金的部分支持。从 mext 到 riken ims 的科学技术和研究资助。我们感谢 pc 实验室和 sineup 网络 (sissa、东皮埃蒙特大学和 riken) 的成员进行了发人深省的讨论。我们感谢马修·瓦伦丁博士的校对。

1. 目标 mrna 的 sineup 结构 bd 设计
<ol><li>检查目标 mrna 在感兴趣的细胞中的转录起始点 (tss) 和翻译起始点。从 encode 和 fonom 项目中获取 tss 数据 (基因表达上限分析, cage) (zenbu: http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/)。</li>
	<li>打开浏览器, 搜索感兴趣的基因, 并通过 cage 峰值检查 tss。</li>
	<li>请参考图 2所示帕金森病蛋白 7 (park7) mrna 的细胞和组织特异性 tss 的实例分析。</li>
	<li>设计几个不同长度的 bd 序列, 对应于第一个蛋氨酸 (aug) 上游的40个碱基和下游的32个碱基, 共72子。</li>
	<li>在 sineup 表达式向量中自定义设计的 bd (请参见材料表)。 请注意:通过基本局部对齐搜索工具 (blast) 检查序列特异性, 以避免目标外的影响26。</li>
</ol>2. 细胞培养与 sineup 转染
<ol><li>在 sineup 转染前, 6个井板或24个井板中感兴趣的种子细胞, 24小时。就人类胚胎肾细胞系 (hek29t17) 而言 (见材料表), 种子 0.5 x10 6 个细胞每井6个井板或 1.5 x 10 5 细胞, 每口井的多 d-赖氨酸涂层24良好的板 (见材料表)。它在24小时后成为70% 的融合。</li>
	<li>24小时后, 将培养基改为 1.5 ml 的新鲜介质, 为6个井板或0.4 毫升的新鲜介质, 为24个井板。在 sineup-gfp 的情况下, 转染0.6 微克的 pEGFP-(见材料表) 和3.4 微克的 sineup-gfp, 在6孔板或130纳克的井中经货试剂在24个井板的一个井内的 egfp-c2 和 670 ng (6个井板和3μ为10μll 在24井板) 按照制造商的指示 (见材料表), 并在37°c 孵育在 5% co2 孵化器24小时。</li>
	<li>用2毫升磷酸盐缓冲盐 (pbs) 清洗细胞 (37 mm 氯化钠、8 mL na2hpo4、2.6 mm kcl 和 1.5 mm kh 2 po 4), 在24个井板的每口井中的6个井板或 0.5 ml pbs井中清洗细胞。仅适用于聚 d-赖氨酸涂层24孔板, 每卷添加 25μl, 重量为 0.05% trypsin, 在 5% co 2 孵化器中孵育 5分钟, 每口培养75μl 的细胞培养基。在6个井板的情况下, 在每口井中加入2毫升的 pbs。向上和向下移液以收获的细胞 (1.5 ml 为6孔板或225μl 为24井板) 从1井进行蛋白质提取 (转到协议3用于蛋白质提取) 和细胞 (0.5 ml 为6孔板或75μl 为24井板)rna 提取和离心剂在 6, 000 x 克的4°c 下 5分钟 (转到第5步进行 rna 提取)。 请注意:用成像技术分析了 sineup-gfp 在多 d-赖氨酸涂层24井板中的作用。转到步骤 7 (成像分析)。</li>
</ol>3. 蛋白质提取
<ol><li>小心吸气1.5 毫升的 pbs, 并添加140μl 的裂解溶液 (20 mm tris-hcl (ph 7.5), 150 mm nacl, 1 mm na 2 edta, 1 mmegta, 1% (w/v) triton, 2.5 mm 焦磷酸钠, 1 mm β-甘油磷酸盐, 1 mm na3vo 41 ml 利肽和 0.005% (w/v) 苯基甲基磺酰氟 (pmsf) (见材料表) 为6个井板或60μl 为24井板到细胞颗粒。</li>
	<li>通过移液混合, 然后在4°c 下以慢速旋转1小时彻底混合。在4°c 下, 以 14, 000 x克离心10分钟收集上清液。</li>
	<li>
用比色法检查蛋白质浓度 (见材料表)。在室温下准备所有的反应。
	<ol>
<li>在超纯水中制备5-6 倍稀释牛血清白蛋白 (bsa) 蛋白标准, 浓度从 0.2-1.5 mg/ml 蛋白不等。每次准备新的标准。</li>
		<li>将试剂 a (碱性铜酸铜溶液) 与20μl 试剂 s (表面活性剂溶液) 混合1毫升, 制备加工试剂--。</li>
		<li>在96孔板的每口井中装载5μl 的水 (负控制)、bsa 标准 (蛋白质标准和阳性对照) 或蛋白质样本。</li>
		<li>在每口井中加入25μl 的试剂。每口井小心加入200μl 试剂 b (folin 试剂), 避免任何气泡形成。用铝箔覆盖板材, 等待5-10。</li>
		<li>用分光光度计测量750纳米的蛋白质吸收率。吸收率稳定至少1小时。</li>
		<li>通过在 x 轴上绘制 bsa 标准蛋白质浓度 (mg/ml) 及其在 y 轴上的各自吸收率来准备标准曲线。应用标准曲线方程计算样品蛋白质浓度。 请注意:如果需要, 在此步骤中暂停协议, 或转到步骤4。对于长期储存, 在液氮中捕捉冷冻蛋白质样品, 并在-80°c 下储存。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. sds-page 分离蛋白质与抗体靶蛋白检测 (西方印迹分析)
<ol><li>从步骤3.3 中, 将2倍负载染料 (0.1 m tris-hcl (ph 值 6.8)、4% sds、20% 甘油、1.42 2-甲基丙烯酸酯和0.2% 溴酚蓝) 添加到每个体积的蛋白质样品中。在90°c 加热 5分钟, 并立即在冰上冷却1分钟。</li>
	<li>将10-20 微克的蛋白质样品加载到 10% sds 聚丙烯酰胺凝胶上, 并以 100-150 v 的速度分离) (见材料表)。</li>
	<li>通过半干式转移仪器 (25 mm tris、192 mm 甘氨酸和20% 甲醇), 在 25 v 处将蛋白质从凝胶转移到0.45 微米的硝化纤维素膜 (见材料表), 时间为30分钟。</li>
	<li>添加阻止溶液 (在 1x tbst 缓冲液中添加5% 的无脂干牛奶 (137 mm ncl, 20 mm tris-hcl (ph 7.6), 0.1% tween-20))) (见材料表)), 直到膜完全浸泡, 并在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>在 sineup-gfp 的情况下, 将蛋白质与抗 gfp 抗体 (在阻断溶液中稀释 1:2000) (见材料表) 杂交, 在室温下孵育 30分钟, 并在室温下晃动。作为一种内部控制蛋白, 通过与抗β-肌动蛋白抗体 (在阻断溶液中稀释 1:2000) 杂交检测β-肌动蛋白 30分钟, 在室温下晃动。</li>
	<li>在容器中加入 1个 tbst 缓冲液, 直到膜完全浸泡, 并在室温下清洗5分钟。再重复两次清洗步骤 (共三次清洗)。</li>
	<li>杂交 gfp 蛋白稀释 (1: 1000 在阻断溶液中) 抗兔抗体与辣根过氧化物酶 (hrp) 结合, 并将β-肌动蛋白与稀释 (1:1000 在阻滞液中) 的抗小鼠抗体结合在膜上30分钟, 室温下晃动。</li>
	<li>用 1x tbst 缓冲液清洗膜 5分钟, 在室温下。再重复两次清洗步骤 (共三次清洗)。</li>
	<li>混合同等体积的 hrp 增强化学发光 (ecl) 检测试剂1和 2 (见材料表)。将膜转移到2毫升 ecl 试剂混合物中, 用铝箔覆盖包装盒, 让其在室温下孵育1-2分钟。使用发光成像仪器, 小心地从 ecl 试剂混合物中取出膜并暴露膜。</li>
</ol>5. rna 提取和 dnase 治疗
<ol><li>按照从单层27中生长的细胞中提取总 rna 的标准协议,或者使用市售的 rna 提取试剂盒 (见材料表)。简单地说, 在步骤 2.3 (每 ~ 500万细胞 1 ml mlr) 27 中, 在收获的细胞中加入任何 guanidine 异硫氰酸酯和苯酚的单相裂解试剂 (mlr). 请注意:经常更换手套。使用不含 rnase 的试剂和经过二乙基吡咯烷酮 (depc) 处理的塑料制品和玻璃器皿, 防止 rna 降解。如果需要, 请在此步骤中暂停协议。将提取的 rna 储存在-80°c。</li>
	<li>在步骤5.1 中的纯化 rna 中加入0.1 体积的 10倍 dnase 缓冲液和 2 u 的 dnase (见材料表)。</li>
	<li>将反应体积设置为 50μl, 用无核酸酶水搅拌均匀。在37°c 下孵化30分钟。</li>
	<li>加入0.1 体积的再悬浮 dnase 失活试剂, 搅拌均匀 (见材料表)。在室温下温和晃动, 孵化5分钟。</li>
	<li>以 10, 000 x克的速度离心, 以 10, 000 x 克的速度离心, 将上清液 (无 dna rna) 转移到一个新鲜的无 rnase 1.5 ml 管中。注意不要接触颗粒, 因为这会导致 dnase 的结转, 这是一个麻烦的下游步骤。</li>
	<li>在紫外分光光度计中测量 a260和 a260/a280 比 (对于纯 rna,范围为 1.8-2.0)。</li>
</ol>6. 一级 cdna 合成与 qrt-pcr 分析
<ol><li>
按照标准的 cdna 合成协议进行第一链 cdna 合成, 如下所示 (见材料表)。
	<ol>
<li>将0.75μm 寡核苷酸 dt 引物、4.3μm 随机引物、dntp (每1毫米) 与 200-500 ng 总 rna (从步骤 5-8) 混合在总反应体积的10μl 中。在65°c 下孵化 5分钟, 然后立即放在冰上。</li>
		<li>混合1x 逆转录酶缓冲液, 1 u 的 rnase 抑制剂, 10 u 的逆转录酶, 并添加 10μl rna-引物混合从6.1.1。</li>
		<li>如果需要, 使用无核酸水将总反应体积设置为20μl。轻轻混合, 在30°c 孵育 10分钟, 然后在42°c 孵育 60分钟, 最后在95°c 孵育 5分钟, 使酶失活。把管子冷却在冰上。 请注意:在冰上解冻 rna 样品和所有试剂, 并在冰上制备反应混合物。如果目标 rna 只是多 a rna, 则仅使用寡核苷酸 dt 底漆 (2.5μm)。如果需要, 暂停协议。将合成的 cdna 储存在-20°c。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在技术三聚体 (ncos3, cagel 标准偏差 > 0.2) 和生物复制 (n=3) 中使用1μl 的 10 ng cdna、0.4μl 反向底漆 (10μm)、0.4 微米的正向底漆 (10μm)、dna 聚合酶的混合物溶液 10μl) 进行 qrt-pcr, 0.4μl 双链 dna 染色染料, 10μl 无核酸酶水 (反应体积为 20μl), 可在以下条件下检测 pcr 产物;在95°c 下保持恒定 (1个循环) 30秒, 在95°c 时保持 5秒 (40循环), 在60°c 下保持 30秒, 熔融曲线阶段。初级例子是人类 gapdh _ fw:ctctctctctttc, 人 gapdh _ rv:gccacacacacacacacatcc, egfp _ fw/gccacacacattgag, egfp _ rv: cggggggggggacaccaccag, sinup-gfp _ fw:ctg. gtttttttttttttag 和 sineup-gfp _ rv:ctccgggctcttagc。请参阅材料表。用 2- ct±sd 方法28分析定量 rna 表达。</li>
</ol>7. 半自动检测方法对 sineup 的成像分析
<ol><li>用 0.5 ml 的 pbs 清洗24个井板中的一口井的细胞。</li>
	<li>在24小时井板的每一口和37°c 孵育细胞中添加2.0 微克的 hoechst 33342 (见材料表) (以500μl 的 pbs 溶解), 在37°c 下孵育细胞 20分钟, 以染色细胞核。</li>
	<li>使用高通量微胶囊图像细胞仪 (请参见材料表)。利用成像软件29, 通过计算 gfp 综合强度来分析 sineup 的蛋白质向上调节效应, 该强度是为每个通道计算的分段对象中显示信号的所有像素强度的总和。</li>
	<li>收集细胞, 检查 rna 的表达 (回到步骤5和 6)。</li>
</ol>

<ol>
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相应的作者 piero carninci 是 transine 技术有限公司的创始人之一, 该公司拥有已申请专利 (ep26915222a4 和 jp20179673a) 的知识产权, 并授予 sineup 技术专利 (us9333370b2)。

我们在这里描述了一种协议, 通过一种名为 sineup 的含有 sine 的非编码 rna 来专门提高目标 mrna 的蛋白质生产。作为一个有代表性的例子, 最佳合成 sinup-gfp 被证明可以通过西方印迹分析来调节 gfp mrna 的2.6 倍的翻译。
设计最佳 bd 对于确保 sinup 的特异性和有效性 (蛋白质向上调节的程度) 至关重要。此前, 我们通过西方印迹分析15 筛选了17 bd sineup-gfp, 发现最佳 bd 与 gfp mrna 的 aug-kozak 序列重叠, 但与其他 mrna 可能不是这样, 应针对每个病例进行验证。另一个独立小组也使用不同的方法对bd 进行了筛查31。由于筛选许多 bd 可能非常耗时和繁琐, 因此我们在此处引入了一种高通量的 sineup 检测方法。该方法测量了与对照载体经细胞相比, sineup 转染细胞 gfp 综合密度的相对变化。为了确保培养板的特定井中的细胞被均匀地转染, transfected 信号不只集中在井的某一区域, 在步骤2.1 中, 将细胞均匀地分布在井中是非常重要的。为此, 在清洁的长凳内播种细胞后, 轻轻摇晃板10次左右 (↑), 并在开始孵育前在 5% co 2 孵化器中重复 。
另一个关键步骤是在步骤3.3 中计算蛋白质浓度。这里的误判可能会导致在西方印迹分析过程中加载错误数量的蛋白质, 从而阻止检测到一些弱 sineup 在蛋白质表达方面的微小变化, 或因超载而产生假阳性。建议每次都重新准备蛋白质标准曲线, 确保在3.3.3 的步骤中测量同等数量的标准和蛋白质样本。这里描述的协议侧重于 sineup-gfp, 但西方印迹分析可用于任何感兴趣的目标 mrna。应针对每个目标优化抗体的培养时间和浓度, 以获得最佳效果。
sineup 的一个独特之处在于靶-mrna 表达水平不受影响。用 dnase 处理 rna 是非常重要的, 以避免 qrt-pcr 检测转染的 sineup 和基因组 dna。应使用 qrt-pcr 检测 sinup rna 和靶点 mrna 表达, 以确认转染和 sineup 活性的成功。sineup 包含一个 sine 序列, 这在人类和小鼠基因组中都是丰富的。为了避免非特异性检测的 sine 序列, 不建议将 qrt-pcr 引物设计到 sine 序列中。
在这个协议中, 我们使用了人类细胞系, 但 sineup 在来自 12个、13、14、18、19的几个不同物种的一些细胞系中是有效的。细胞培养和转染条件可以根据不同的细胞系进行修改, 只要这些细胞保持 sinup 载体的转染效率。此外, 可以采用 rna 提取、cdna 合成和蛋白质浓度检查的替代方法, 因为它们保留了 qrt-pcr 和西方印迹分析所需的 rna 和蛋白质质量。虽然我们使用了一种特定的高通量微井细胞仪, 可以在整个井中检测 gfp 荧光, 但其他具有类似检测范围的细胞仪可以使用31。需要注意的是, 如果整个井的细胞分布和转染相等, 那么就没有必要对整个井进行 transfection 荧光扫描: 一口井面积的一半或四分之一可能足以根据实验来识别 sineuup 效应的技能。
通过建立高通量 sineup 检测协议, 可以同时筛选培养细胞中针对给定 mrna 的多个 bd。这一点很重要, 因为关于 bd 最佳目标的规则仍不清楚。这种多重筛选系统允许针对不同的基因对许多 sineup 进行大规模测试, 例如, 这对于针对特定信号通路中涉及的多个基因非常有用。此外, 它还可用于扩大针对多个 mrna 的有效 sineup 的搜索, 围绕 aug-kozak 区域设计不同的 sineup bds (参见图 1), 与 gfp mrna 融合的全长目标 mrna (5-7l uts-3e-eux utr)在培养的细胞中寻找最佳的 sineup, 然后在培养的细胞和体内模型动物中测试 bd 候选物质, 从人类和小鼠到其他动植物物种。
这种筛选方案非常快。我们不需要修复和收集细胞, 只需要将活细胞培养板放置在成像仪器中。我们建议使用这种高通量筛选协议来选择最佳的 sineup bd, 并通过西方印迹分析来评估潜在的候选项。因此, 选择具有最佳 bds 的候选候选项可用于增加抗体产生 18、19、21.目前, rna 治疗领域正在急剧增长。例如, sirna、aso、mrna 和 crispr 疗法被广泛用于控制各自目标9、32的 mrna 表达。在此背景下, sineup 尚处于起步阶段, 但迄今为止, 所研究的 sineup 都没有改变目标 mrna 的表达。此外, sineup 不编辑目标 mrna, 而只是上调 mrna 的翻译。此外, 单倍性不足引起的功能丧失疾病可通过 sineup 治疗的目标, 实现2倍诱导的缺陷蛋白17,33。虽然非目标效应需要进一步研究, 但 sineup 有可能并专门针对一个单一的、表达的 mrna, 并与 bd 互补的序列。
这种高通量协议的一个局限性是, 它不适合在体内小鼠模型中筛选 sineup 的 bds, 因为该协议只测量 gfp 集成强度。由于 sineup 是在转录后起作用的自然反义 incrna, 当目标 mrna 在细胞或组织样本中缺失时, 它们不能被应用。
然而, sineup 可用于功能增益研究, 提高抗体的产生, 并作为 rna 疗法, 在1.5-3.0倍的范围内提高缺乏蛋白的表达。本文所述的方法为靶向和检测 sineup 诱导的所需 mrna 翻译增强提供了有益的指导, 并为转录后基因调控提供了新的工具。

在后基因组时代, 由于下一代测序技术 1、2、3和基因编辑工具。这类成绩单以前被认为是 "转录垃圾", 现在被确定为基因监管的关键参与者。反义转录报告调节染色质和控制稳定性和表达他们的同源蛋白编码感觉 mrna4,5。在大多数情况下, 这种监管模式是负面的, 反义记录通过 rna-rna 相互作用6,7使感觉对应的沉默。这种自然反义转录的特征已被用来降低所需的基因的形式合成小干扰 rna (sirna), 微 rna (mirna), 和反义寡核苷酸 (aso)8,9,10 ,11为有针对性的基因向上调节留下了技术空白。
一项有趣的研究改变了反义 rna 场的观点, 证明了uchl1 (泛素 c-末端水解酶 l1) 和uxt (泛素表达的转录) 基因的反义长非编码 rna (as lnrna)在12岁小鼠转录后水平上积极调节它们同源意义 mrna 的翻译.这些 as lna 的5核末端与其相应的感觉记录的 5-未翻译区域 (5、utr) 中的几个碱基重叠, 而非重叠的3端包含属于短插层核的反转换子的倒置重复元素 (sine) 系列。有趣的是, 我们发现, 这种平移向上调节背后的主要驱动力是嵌入式 sine 重复, 它并不局限于鼠标 sine 重复。人的 alu 重复 as ncrna 还增强了目标感知 mrna 的翻译, 强化了一类新型的 sine 驱动的监管反义非编码 rna 的理念, 适当地命名为 sinp13.最近的研究表明, 天然 sinep 的潜力被保存在合成 sinep 中, 专门针对各种内源基因和外源基因14,15.sineup 有两个重要特征: 第一, "结合域" (bd), 它通常是 5-p 末端区域, 它是对包含蛋白质编码 mrna 的主要起始密码子的序列的补充, 其次是 "效应域" (ed), 因为它包含了倒置重复的 sine, 这是 sineup 函数14的先决条件 (图 1)。sineup 可以定制, 以设计专门针对首选基因的 bd。然后, 可以利用这一点来剖析参与生物途径的特定基因的功能, 作为传统 mrna 过度表达策略的更好替代品。此外, 这种多功能工具可用于促进抗体的产生, 并作为一种药物, 以治疗单倍体不足的疾病引起的功能蛋白剂量不足 16,17, 18, 19,20,21。
sineup 技术的优势是多方面的。它不会改变目标在转录水平上的表达。较长的 bd 为 sineup 提供了更具体的特性, 同时不会诱导依赖 dsrna 的应激反应15。蛋白质诱导保持在细胞的正常生理范围内, 防止任何有害影响, 由于异常或过度的蛋白质表达。sineup 与各种各样的老鼠、人和仓鼠培养的细胞系兼容, 例如 hek29kht17、hepg2、hela、cho、mn9d 和更多的12、13、14、15、18 ,19。sineup 可以有效地靶向内源性基因、短暂过度表达的基因和 flag-tor 标记或荧光融合基因, 从而消除 14,18基因特异性抗体的需要。基本的 sinup 分析需要常规的细胞培养、转染、十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page)、实时定量逆转录聚合酶链反应 (qrt-pcr) 仪器和设置, 以及专业知识可以在很短的时间内获得。
在这里, 我们描述了一种针对具有合成 sineup 的基因的方法, 以提高翻译的水平, 这一效果与其他技术 (如 rna 干扰9和 aso gapmers11、22、23) 相反。一种广泛使用的 rna 引导基因激活方法是聚集定期间隔的短棕榈重复激活 (crispra), 其中基因表达在转录水平24触发。这种方法虽然简单、快速, 但需要多个单一引导 rna (sgrna) 针对同一基因, 以获得更高的效率, 从而增加了离目标结合25的机会。此外, crispra 系统的关键酶, 催化死的 crispr 相关蛋白 9 (dcas9) 具有较低的结合特异性和针对双向启动子区域的 sgrna 可以非特异性向上调节附近的基因25。相反, sineup 结合到具有高特异性的单个结合区域的 mrna, 并且不会影响附近基因的表达。我们讨论了 sineup 设计、转染、蛋白质和 rna 表达分析所涉及的基本步骤。此外, 我们还提供了一个半自动、高通量的成像系统, 可同时筛选多个 sineup, 这对于检测最佳的 sineup 非常有用。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Synthetic SINEUP</td>
			<td>Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan</td>
			<td>https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320</td>
			<td>Step 1.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/17</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-11268</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6902A01</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-124</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C2</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6083-1</td>
			<td>Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#9803S</td>
			<td>Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8553S</td>
			<td>Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>#5000112JA</td>
			<td>Step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 &#181;l</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>#4561035</td>
			<td>Step 4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm&#215;4 m)</td>
			<td>Amasham</td>
			<td>10600013</td>
			<td>Step 4.3., This is a 0.45 &#181;m nitrocellulose membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#9999S</td>
			<td>Step 4.4. A component of the blocking solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Tag Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-6455</td>
			<td>Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-Actin antibody produced in mouse</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A5441</td>
			<td>Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0448</td>
			<td>Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0447</td>
			<td>Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti &#946;-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Detection Reagents</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN2109</td>
			<td>Step 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AS4500</td>
			<td>Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AS1390</td>
			<td>Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ambion</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>6110A</td>
			<td>Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>Step 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst3342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Step 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>200-BFFL-S</td>
			<td>Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell based assays of sineup non-coding rnas that can specifically enhance mrna translation

靶蛋白增强不仅对生物过程的研究具有重要意义, 而且对治疗和生物技术的应用也具有重要意义。在这里, 我们提出了一种方法, 有选择地提高蛋白质表达所需的基因在培养细胞中的合成反义非编码 rna 称为 sineup。这种基因表达的正控制是在转录后水平, 并由倒置短的混合核元件 (sine) 重复在 sineup 的3端, 包括其效应域 (ed)。sineup 可以通过其结合域 (bd) 与任何蛋白质编码 mrna 的选择结合, 该区域旨在补充 5-博未翻译区域 (5-博 utr) 内和 mrna 起始密码子周围的序列。以这种方式设计的目标特异性 sineup 被转染到培养的细胞, 蛋白质和 rna 被提取用于下游分析, 通常是转染后24-48。用西方印迹分析检测 sineup 诱导的蛋白质调节, 并利用实时定量逆转录酶链反应技术检测 rna 表达。我们观察到 bd 设计对于实现最佳的 sineup 活动至关重要, 建议根据目标 mrna 的起始密码子测试不同的 bd 大小和位置。因此, 我们在这里描述了一种基于荧光检测的半自动高通量成像方法, 该方法可以针对与绿色荧光蛋白 (gfp) 融合的 mrna。sineup 特别增强细胞正常生理范围内的翻译, 而不改变目标转录水平。这种方法已成功地应用于一系列内源性和外源性目标, 在各种各样的人类、小鼠和昆虫细胞系以及体内系统中使用。此外, 据报道, sineup 增加了抗体的产生, 并作为 rna 治疗单倍体基因不足的药物。sineup 的多功能和模块化特性使其成为特定基因平移控制的合适工具。

sineup-gfp 是一种合成 sineup, 包含最佳 bd (-28/+ 4 与 gfp mrna 重叠) 和 ed (as-uchl1的倒置 sine b2), 可以向上调节 gfp mrna 的翻译 (图 3a 和 3A), 而不改变 gfp 的表达式(图 3c 和 3C)。为了筛选 sineup 的最佳 bd 和 ed, 我们开发了半自动图像分析协议, 与传统的西方印迹分析相比, 该协议缩短了检测时间, 并增加了同时筛选样本的数量.如图 4所示, 这种高通量成像系统花了3天时间 (48次 sineup 的西方印迹分析用了2周时间)。在证明 sineup-gfp 提高了 gfp 翻译后, 我们通过图像细胞仪检测到了 gfp 集成强度。sineup-gfp 的最佳 bd 诱导 gfp 蛋白表达增加1.4倍。尽管我们观察到信号压缩从 2.6倍 (西方印迹分析, 见图 3a) 到 1.4倍 (成像分析, 见图 5), 但差异可能是由于成像仪器软件的校准造成的。然而, 我们检测到的 gfp 荧光水平明显高于对照 (图 5a 和 5A)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig1.jpg"> 图 1: 合成 sineup 的基本设计.bd = 结合域以 mrna 为目标, ed = 包含倒置 sine 序列的效应域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig2.jpg"> 图 2: 通过 cage 分析检测到的特定组织和细胞中人类帕金森病蛋白 7 (park7) mrna 的转录起始位点 (tss).(a) 使用组学数据集成和交互式可视化系统显示人类park7 mrna tss 搜索结果的快照30。enterz 基因 hg19 轨道中的水平绿色箭头表示参考人类park7 mrna 的基因组位置, fantom5 cage 1 和2条轨道中的垂直绿条表示 tpm 的总和 (以每百万条记录 (tpm) 衡量) 从1, 829 种组织和细胞。(b) 放大 a 组中技术支助服务的标记区域 (半35354刻度: 35.4 kb 至 100 bp)。fantom5 cage 第1阶段和第2轨道中的灰色阴影区域表示在总数 1 829个中列出的6个特定细胞的 tss, 这些细胞列在图的底部。与这些列名单元相对应的数字 (11.369、4.998、4.304、3.509、3.509 和 3.055) 显示了 tss 灰色阴影位置上每个特定单元的每百万记录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig3.jpg"> 图 3: 西方印迹分析证实了 sineup-gfp 对翻译的上调.(a) 用抗 gfp 抗体对 sineup-gfp 进行了西方印迹检测。(b) 结果归一化为β肌动蛋白蛋白带的强度。(c) 用 qrt-pcr 检测 gfp mrna 和 (d) sineup rna 表达。p < 0.0005, n = 3, 双尾学生的 t 测试, 误差线是标准偏差。这一数字已从 takahashi 等人15人处修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig4.jpg"> 图 4: sineup 半自动图像分析原理图.第1天: 24个井盘中感兴趣的种子细胞。第2天: 转染 Transfect 和 sineup-gfp。第3天: 通过测量 gfp 综合强度来分析 sineup 的影响。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig5.jpg"> 图 5: sineup-gfp 对翻译上调的高通量分析.(a) 对照与 sineup-gfp 转染细胞15的 transfected 荧光比较。用 hoechst 33342 将标度条 = 2 毫米 (b) gfp 综合强度归一化为核染色计数的细胞总数。p < 0.0005, n = 3, 双尾学生的 t 测试, 误差线是标准偏差。fov: 视野。这一数字已从 takahashi 等人15人处修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig5large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation at JoVE.com

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

基于细胞的 sineup 非编码 rna 检测, 可专门增强 mrna 的翻译能力

sineup 是一种合成反义非编码 rna, 它包含一个结合域 (bd) 和一个效应域 (ed), 并向上调节目标 mrna 的翻译。在这里, 我们描述了在培养细胞系中检测 sineup 的方法, 分析了他们的翻译促进活性的西方印迹和半自动高通量成像系统。

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

此方法可以帮助回答关键问题，例如如何利用细胞和组织中的 mRNA 来积极调节基因的活性。如何弥补活动缺陷，以及如何实现体外和体内mRNA的高翻译。这项技术的主要优点是，我们可以通过成像，无需固定和收集，在全球范围内筛选SINEUP在活细胞中的目标基因。因此，这项技术的影响延伸到我们的治疗，以癌症的实例，因为SINEUPs可以诱导双倍增加的缺乏蛋白质，如弗拉塔辛在弗里德里希的厌食症的情况下。首先，打开Zenbu浏览器，然后单击感兴趣的范托姆项目数据库。搜索目标基因，并检查转录开始位点，或 TSS，和表达水平在所需的细胞和组织。要确定 TSS，请参阅帕金森病蛋白七或 PARK7 mRNA 的示例分析。按笼峰区域检查 TSS。要确定细胞和组织特定的转录表达水平，请选择笼峰区，然后单击放大基因组区域进行选择。通过浏览页面底部的脚本表达列表，检查感兴趣的细胞和组织类型的 PARK7 表达。然后，设计几个不同长度的绑定域序列，对应于上游的40个碱基，以及第一个基氨酸或8月下游的32个碱基。在与SINEUPS转染之前，在两个聚d-lysine涂层的24孔板上感兴趣的种子细胞，如手稿中所述。在37摄氏度的CO2培养箱中孵育24小时，达到70%的汇合。在井中均匀分布细胞非常重要，为此，在将细胞播种到干净的长凳内后，来回轻轻摇动盘子10次，并在5%的CO2培养箱中重复。孵育后，将介质更改为0.4mL的新鲜介质。用于分析SINEUP-GFP，用0.1mL的混合溶液制造几个1.5mL管，每个管中用pEGFP-C2、SINEUP-GFP、转染试剂和OptiMEM，然后在室温下孵育管20分钟。将这种混合溶液的0.1mL从每个管添加到24孔板的单独油井中，并用SINEUP-GFP一、二、三、四和五标记这些油井。在5%的CO2培养箱中孵育37摄氏度的板，24小时。24小时后，用0.5mL的PBS清洗细胞。每体积尝试性增加25uL0.05%的重量，并在5%的CO2培养箱中孵育5分钟。每井加入275uL的细胞介质。对于蛋白质提取，取两个板块中的一个，从一个井中收获225uL或四分之三的细胞，75uL或四分之一的细胞用于RNA提取，每个细胞进入一个单独的1.5mL管中。在摄氏四度下以 6000xg 的离心机 5 分钟。离心后，小心地从标有蛋白质隔离的管子上取出上清液。将 60uL 的解液添加到细胞中，通过移液混合，在四摄氏度下以慢速旋转一小时，彻底混合。在4摄氏度下将管在14，000xg下离心10分钟，以收集蛋白质上清液。要确定蛋白质浓度，首先在超纯水中准备5至6倍的新鲜牛血清白蛋白蛋白标准，浓度在0.2至1.5mg/mL蛋白。为了准备工作试剂，A Dash 混合将 20uL 的试剂 S 添加到 2 mL 管中的一 mL 试剂 A 中。添加五 uL 的水作为负对。然后，BSA标准或蛋白质样品在每个井。加入25uL的试剂 A 短划线，然后仔细添加 200uL 的试剂 B，避免任何气泡形成。用铝箔盖住板，在室温下孵育，五至八分钟。使用分光光度计测量 750nm 的蛋白质吸收度。通过绘制 x 轴上的 BSA 标准蛋白质浓度及其在 y 轴上各自的吸收度来准备标准曲线。应用标准曲线方程计算样本蛋白浓度。要开始蛋白质分离，在蛋白质样品的每个体积中加入一卷2倍的加载染料。在 90 摄氏度下加热 5 分钟，立即在冰上冷却一分钟。将 10 至 20ug 的蛋白质样品加载至 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶，并在 100 至 150V 下分离。通过半干转移仪器将蛋白质从凝胶转移到0.5微米硝基纤维素膜。在 25V 下填充传输缓冲液 30 分钟。转移后，将膜放在容器中，加入阻消溶液，直到膜完全浸泡，并在室温下孵育30分钟。摇动。将适当的抗体加入阻断溶液，并倒在膜上。通过在室温下孵育膜30分钟，同时摇动膜进行杂交。杂交后，在室温下加入1x TBST缓冲液洗涤膜5分钟，再重复两次。在室温下在室温下摇动30分钟，用稀释的二次抗体进行下一次杂交。然后在室温下加入1x TBST缓冲液5分钟，然后重复两次，清洗膜。将膜转移到装满两 ML HRP 增强型 ECL 试剂混合物的盒子里。用铝箔盖住盒子，在室温下孵育一到两分钟。小心地从 ECL 试剂混合物中去除膜，并使用发光成像仪器将其暴露。要通过成像分析SINEUP-GFP在细胞中的效果，请用每井0.5mL的PBS清洗pEGFP-C2和SINEUP-GFP转切细胞。要染色核，在每孔中加入2ug的 Hoechst-33342，并在37摄氏度下孵育细胞，20分钟。使用高通量微孔图像细胞仪测量霍赫斯特染色细胞，计算细胞总数。测量绿色荧光的强度，以计算GP阳性细胞的数量。要分析SINEUP的蛋白质上调节效应，使用成像软件确定GSP集成强度 计算它作为显示每个通道获得的分段物体中信号的所有像素强度的总和。使用SINEUP-GFP（一种既包含最佳结合域和有效域GFP的合成SINEUP）成功转染后，mRNA翻译在不改变GFP mRNA的表达的情况下得到调节。与传统的西方印迹分析相比，半自动图像分析协议提高了检测时间，增加了同时筛选的样品数量。虽然信号强度有差异，从西方印迹分析的2.6倍到成像分析的1.4倍，但与对照组相比，检测到的GGFP荧光水平要高得多。在尝试此过程时，必须记住确定目标 mRNA 的正确序列以设计正确的绑定域。基因通常从启动者转录，并可能使用不同的翻译启动网站。Zenbu 浏览器是探索此类 mRNA 方差的非常有用的工具。我们还建议设计不同的SINEUP与可变绑定位点。总之，我们相信，迅速使SINEUPS适应多种目标，将建立一个新的领域，包括对现有RNA进行积极调节的转换，这是一个对西RNA领域的互惠和补充。我们设想，这项技术的一部分，将有助于产生更多的蛋白质在体外，如生物反应器，以及体内自然纠正基因剂量。

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

工程人为因素来特异性地操纵人细胞中的选择性剪接

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

科研

遗传学

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

化学修饰肽核酸对单链 rna 双链 rna 的序列特异和选择性识别

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

使用 Macroarrays 的转移 rna 的代谢标记和剖面分析

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

rna 下拉法识别长非编码 rna 的 rna 靶点

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

基于生物素的下拉法对细胞 miRNAs mRNA 靶点的验证

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

人牙小泡干细胞的分离、鉴定及微 rna 遗传修饰

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

基于细菌选择和生长的盘状细胞基因工程

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

利用体外和细胞内形状研究小分子诱导的预 mrna 结构变化

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

使用基因激活 crispr 过度表达长非编码 rna

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

纳米测序全血 mRNA 测序

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...