Name: cell based assays of sineup non-coding rnas that can specifically enhance mrna translation
Uploaded: 2019-02-01T13:00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation at JoVE.com

इस अध्ययन में आंशिक रूप से अभिनव जैविक चिकित्सा, no 17am0301014 के लिए बुनियादी विज्ञान और मंच प्रौद्योगिकी कार्यक्रम, चिकित्सा अनुसंधान और विकास (एमएड) के लिए जापान एजेंसी से, अनुसंधान अनुदान MEXT से आरआईकेईएन केंद्र के लिए जीवन का समर्थन किया था विज्ञान प्रौद्योगिकी और MEXT से आरआईकेईएन आईएमएस के लिए एक अनुसंधान अनुदान । हम पीसी लैब के सदस्यों को धंयवाद और SINEUP नेटवर्क (SISSA, पूर्वी Piedmont और आरआईकेईएन के विश्वविद्यालय) सोचा उत्तेजक विचार विमर्श के लिए । हम ठीक करने के लिए डॉ मैथ्यू वेलेंटाइन धंयवाद ।

<ol>
	<li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome.">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309 (5740), 1564-1566 (2005).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome.">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li><li>Hon, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+human+long+non-coding+RNAs+with+accurate+5'+ends.">An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5' ends.</a> Nature. 543 (7644), 199-204 (2017).</li><li>Tufarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+antisense+RNA+leading+to+gene+silencing+and+methylation+as+a+novel+cause+of+human+genetic+disease.">Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease.</a> Nature Genetics. 34 (2), 157-165 (2003).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+tumour+suppressor+gene+p15+by+its+antisense+RNA.">Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA.</a> Nature. 451 (7175), 202-206 (2008).</li><li>Carninci, P., Hayashizaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNA+transcription+beyond+annotated+genes.">Noncoding RNA transcription beyond annotated genes.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 139-144 (2007).</li><li>Chu, Y., Yue, X., Younger, S. T., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+argonaute+proteins+in+gene+silencing+and+activation+by+RNAs+complementary+to+a+non-coding+transcript+at+the+progesterone+receptor+promoter.">Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter.</a> Nucleic Acids Research. 38 (21), 7736-7748 (2010).</li><li>Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microRNA+biogenesis.">Regulation of microRNA biogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 509-524 (2014).</li><li>Takahashi, H., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+genome+transcription:+new+possibilities+for+RNA+therapies.">Widespread genome transcription: new possibilities for RNA therapies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (2), 294-301 (2014).</li><li>Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing.">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4, e252 (2015).</li><li>Nishina, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA/RNA+heteroduplex+oligonucleotide+for+highly+efficient+gene+silencing.">DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing.</a> Nature communications. 6, 7969 (2015).</li><li>Carrieri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+antisense+RNA+controls+Uchl1+translation+through+an+embedded+SINEB2+repeat.">Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat.</a> Nature. 491 (7424), 454-457 (2012).</li><li>Schein, A., Zucchelli, S., Kauppinen, S., Gustincich, S., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antisense+long+noncoding+RNAs+that+function+as+SINEUPs+in+human+cells.">Identification of antisense long noncoding RNAs that function as SINEUPs in human cells.</a> Scientific Reports. 6, 33605 (2016).</li><li>Zucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINEUPs+are+modular+antisense+long+non-coding+RNAs+that+increase+synthesis+of+target+proteins+in+cells.">SINEUPs are modular antisense long non-coding RNAs that increase synthesis of target proteins in cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 174 (2015).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+features+of+synthetic+SINEUPs,+antisense+lncRNAs+that+specifically+enhance+protein+translation.">Identification of functional features of synthetic SINEUPs, antisense lncRNAs that specifically enhance protein translation.</a> PLOS ONE. 13 (2), e0183229 (2018).</li><li>Deutschbauer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169 (4), 1915-1925 (2005).</li><li>Indrieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+long+non-coding+RNAs+[SINEUPs]+rescue+defective+gene+expression+in+vivo.">Synthetic long non-coding RNAs [SINEUPs] rescue defective gene expression in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 27315 (2016).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mammalian+cell+factories+with+SINEUP+noncoding+RNAs+to+improve+translation+of+secreted+proteins.">Engineering mammalian cell factories with SINEUP noncoding RNAs to improve translation of secreted proteins.</a> Gene. , (2015).</li><li>Sasso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+non-coding+SINEUP+RNA+boosts+semi-stable+production+of+fully+human+monoclonal+antibodies+in+HEK293E+cells.">A long non-coding SINEUP RNA boosts semi-stable production of fully human monoclonal antibodies in HEK293E cells.</a> MAbs. , 1-8 (2018).</li><li>Dang, V. T., Kassahn, K. S., Marcos, A. E., Ragan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+haploinsufficient+genes+and+their+genomic+proximity+to+segmental+duplications.">Identification of human haploinsufficient genes and their genomic proximity to segmental duplications.</a> European Journal of Human Genetics. 16 (11), 1350-1357 (2008).</li><li>Zucchelli, S., Patrucco, L., Persichetti, F., Gustincich, S., Cotella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Translation+in+Mammalian+Cell+Factories+to+Increase+Protein+Yield:+The+Unexpected+Use+of+Long+Non-Coding+SINEUP+RNAs.">Engineering Translation in Mammalian Cell Factories to Increase Protein Yield: The Unexpected Use of Long Non-Coding SINEUP RNAs.</a> Computational and Struct Biotechnology Journal. 14, 404-410 (2016).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24 (15), 1634-1644 (2010).</li><li>Watts, J. K., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+disease+genes+in+the+laboratory+and+the+clinic.">Silencing disease genes in the laboratory and the clinic.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 365-379 (2012).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells.">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (7), 670-676 (2014).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Liu, X., Harada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+isolation+from+mammalian+samples.">RNA isolation from mammalian samples.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Severin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+visualization+and+analysis+of+large-scale+sequencing+datasets+using+ZENBU.">Interactive visualization and analysis of large-scale sequencing datasets using ZENBU.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 217-219 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAe:+an+effective+method+for+targeted+protein+translation+enhancement+by+artificial+non-coding+RNA+with+SINEB2+repeat.">RNAe: an effective method for targeted protein translation enhancement by artificial non-coding RNA with SINEB2 repeat.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), e58 (2015).</li><li>Savi&#263;, N., Schwank, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapeutic+CRISPR/Cas9+genome+editing.">Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Translational Research. 168, 15-21 (2016).</li><li>Long, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAe+in+a+transgenic+growth+hormone+mouse+model+shows+potential+for+use+in+gene+therapy.">RNAe in a transgenic growth hormone mouse model shows potential for use in gene therapy.</a> Biotechnology Letters. , (2016).</li></ol>

इसी लेखक पिएरो Carninci TransSINE टेक्नोलॉजीज कं लिमिटेड के संस्थापकों में से एक है कि दायर पेटेंट (EP2691522A4 और JP2017169573A) पर बौद्धिक संपदा रखती है, और US9353370B2 प्रौद्योगिकी के लिए पेटेंट (SINEUP) दी ।

हम यहां विशेष रूप से एक साइन-गैर कोडिंग आरएनए, SINEUPs बुलाया के माध्यम से एक लक्ष्य mRNA के प्रोटीन उत्पादन बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया । एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, इष्टतम सिंथेटिक SINEUP-GFP अप करने के लिए दिखाया गया है-GFP mRNA २.६ के अनुवाद को विनियमित-के रूप में पश्चिमी दाग विश्लेषण से मापा ।
एक इष्टतम BD डिजाइनिंग SINEUP विशिष्टता और शक्ति (प्रोटीन की हद तक विनियमन) को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इससे पहले, हमने पश्चिमी ब्लाटर विश्लेषण द्वारा SINEUP-GFP के 17 बीडीएस की जांच की और पाया कि इष्टतम BD GFP mRNA के AUG-श्मिट अनुक्रम को ओवरलैप करता है, हालांकि यह अन्य mRNAs के साथ मामला नहीं हो सकता और प्रत्येक मामले के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए । एक अंय स्वतंत्र समूह भी एक अलग31विधि का उपयोग कर BD दिखलाई । स्क्रीनिंग के रूप में कई बीडीएस काफी समय लेने वाली और बोझिल हो सकता है, हम एक उच्च प्रवाह SINEUP जांच विधि यहां शुरू की । यह विधि नियंत्रण वेक्टर transfected-कोशिकाओं की तुलना में SINEUP transfected-कोशिकाओं में GFP एकीकृत घनत्व में सापेक्ष परिवर्तन के उपाय करता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक संस्कृति प्लेट के एक विशेष कुआं में कोशिकाओं को समान रूप से transfected है और GFP संकेत अच्छी तरह से केवल एक निश्चित क्षेत्र के लिए ध्यान केंद्रित नहीं है, यह बहुत ही कदम २.१ में कुओं में समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रयोजन के लिए, धीरे थाली हिला 10 बार आगे पीछे (↑ ↓) एक साफ पीठ के अंदर कोशिकाओं बोने के बाद और 5% CO2 मशीन में दोहराने से पहले मशीन शुरू ।
एक और महत्वपूर्ण कदम ३.३ कदम में प्रोटीन एकाग्रता की गणना है । यहां गलत गणना पश्चिमी दाग विश्लेषण के दौरान प्रोटीन की एक ग़लत राशि की लोडिंग करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, फलस्वरूप कमजोर SINEUPs के कुछ द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति में छोटे परिवर्तन का पता लगाने या अतिभारित से झूठी सकारात्मक पैदा करने को रोकने । यह ताजा प्रोटीन मानक वक्र हर बार तैयार करने के लिए सिफारिश की है, सुनिश्चित करें कि मानकों और प्रोटीन के नमूनों की बराबर मात्रा में कदम 3.3.3 में मापा जाता है बना । प्रोटोकॉल यहां वर्णित SINEUP-GFP पर केंद्रित है, लेकिन पश्चिमी दाग विश्लेषण ब्याज की किसी भी लक्ष्य mRNA के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मशीन समय और एंटीबॉडी की एकाग्रता के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
SINEUPs की अनूठी विशेषताओं में से एक है कि लक्ष्य-mRNA अभिव्यक्ति स्तर अप्रभावित रहता है । यह qRT-पीसीआर द्वारा transfected SINEUPs और जीनोमिक डीएनए का पता लगाने से बचने के लिए DNase के साथ आरएनए का इलाज करने के लिए महत्वपूर्ण है । अभिकर्मक और SINEUP गतिविधि दोनों की सफलता की पुष्टि के लिए SINEUP RNAs और target mRNA एक्सप्रेशन को qRT-पीसीआर द्वारा मापा जाना चाहिए । SINEUPs एक साइन अनुक्रम है, जो दोनों मानव और माउस जीनोम भर में प्रचुर मात्रा में होते हैं । ज्या अनुक्रम का गैर-विशिष्ट डिटेक्शन से बचने के लिए, यह qRT-पीसीआर प्राइमरों को साइन अनुक्रम के लिए डिज़ाइन करने के लिए अनुशंसित नहीं है ।
इस प्रोटोकॉल में हम मानव कोशिका लाइनों का इस्तेमाल किया, लेकिन SINEUPs कई विभिंन प्रजातियों12,13,14,18,19से सेल लाइनों के एक नंबर में प्रभावोत्पादक हैं । सेल संस्कृति और अभिकर्मक स्थितियों के रूप में इन SINEUP वैक्टर के अभिकर्मक दक्षता बनाए रखने के रूप में लंबे समय के रूप में अलग सेल लाइनों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है । इसके अलावा, आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, और प्रोटीन एकाग्रता जाँच के वैकल्पिक तरीकों को देखते हुए नियोजित किया जा सकता है कि वे qRT-पीसीआर और पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए आवश्यक आरएनए और प्रोटीन गुणवत्ता की रक्षा करते हैं । जब तक हम एक विशिष्ट उच्च प्रवाह माइक्रो-अच्छी तरह से cytometer, जो पूरी तरह से GFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने में सक्षम थे, एक समान पता लगाने रेंज के साथ अन्य cytometers31इस्तेमाल किया जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अगर कोशिकाओं और अभिकर्मक के वितरण के एक अच्छी तरह भर में बराबर हैं, तो यह आवश्यक नहीं है GFP प्रतिदीप्ति के लिए पूरी तरह से स्कैन: आधा या एक अच्छी तरह के क्षेत्र के एक चौथाई प्रयोग के आधार पर SINEUP प्रभाव विचार करने के लिए पर्याप्त हो सकता है अल कौशल ।
एक उच्च प्रवाह SINEUP का पता लगाने प्रोटोकॉल की स्थापना कई बीडीएस के एक साथ स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में एक दिया mRNA लक्ष्यीकरण । यह महत्वपूर्ण है के रूप में BD द्वारा अधिकतम लक्ष्यीकरण शासी नियम अभी भी अस्पष्ट हैं । इस तरह के एक मल्टीप्लेक्स स्क्रीनिंग प्रणाली विभिंन जीन के खिलाफ कई SINEUPs के बड़े पैमाने पर परीक्षण के लिए अनुमति देता है, कई उदाहरण के लिए एक विशेष संकेत मार्ग में शामिल जीन लक्ष्यीकरण के लिए उपयोगी है । इसके अलावा, यह प्रभावी SINEUPs कई mRNAs लक्ष्यीकरण के लिए खोज का विस्तार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, अगस्त के आसपास विभिंन SINEUP बीडीएस डिजाइन-श्मिट क्षेत्र ( 1 चित्रादेखें), सह transfecting पूर्ण लंबाई लक्ष्य mRNAs (5 पिरणामस्वरूप UTR-सीडीएस-3 पिरणामस्वरूप UTR) GFP mRNA के साथ जुड़े प्रसंस्कृत कोशिकाओं में इष्टतम SINEUPs को खोजने के लिए, और बाद में अंतर्जात mRNA के खिलाफ BD के उम्मीदवारों का परीक्षण करने के लिए प्रसंस्कृत कोशिकाओं में और vivo मॉडल जानवरों में, मनुष्यों और चूहों से अन्य पशु और प्रजातियों के पौधे.
यह स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल बहुत तेज है । हम ठीक है और कोशिकाओं को इकट्ठा करने की जरूरत नहीं है, लेकिन सिर्फ इमेजिंग साधन में रहने वाले सेल संस्कृति प्लेट जगह की जरूरत है । हम इस उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए SINEUPs के इष्टतम बीडीएस का चयन करें और पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा संभावित उंमीदवारों का मूल्यांकन करने का प्रस्ताव । इस प्रकार, इष्टतम बीडीएस के साथ चयनित उंमीदवारों एंटीबॉडी उत्पादन बढ़ाने के लिए लागू किया जा सकता है18,19,21। वर्तमान में, आरएनए चिकित्सीय क्षेत्र नाटकीय रूप से बढ़ रहा है । उदाहरण के लिए, सिरना, ASO, mRNA, और CRISPR आरएनए चिकित्सा, व्यापक रूप से उनके संबंधित लक्ष्य9,३२के mRNA अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए कार्यरत हैं । इस संदर्भ में, SINEUPs अपने शैशव में हैं, लेकिन अब तक कोई भी अध्ययन SINEUPs लक्ष्य mRNAs की अभिव्यक्ति बदल दिया है । इसके अलावा, SINEUPs लक्ष्य mRNA संपादित नहीं करते हैं, लेकिन केवल अप-mRNA के अनुवाद को विनियमित । इसके अलावा, हानि-समारोह haploinsufficiency से उत्पंन रोगों SINEUP चिकित्सा द्वारा लक्षित किया जा सकता है, की कमी प्रोटीन17,३३की एक 2 गुना प्रेरण प्राप्त करने । बंद लक्ष्य प्रभाव हालांकि आगे का अध्ययन करने की जरूरत है, SINEUPs संभावित और विशेष रूप से एक लक्ष्य, BD के लिए एक पूरक अनुक्रम के साथ mRNA व्यक्त किया.
इस उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह उपयुक्त नहीं है SINEUPs में vivo माउस मॉडल में बीडीएस स्क्रीन क्योंकि प्रोटोकॉल GFP एकीकृत तीव्रता केवल उपाय । के रूप में SINEUPs प्राकृतिक antisense lncRNAs कि अधिनियम के बाद transcriptionally हैं, वे लागू नहीं किया जा सकता है जब लक्ष्य mRNA कोशिकाओं या ऊतक नमूनों में लापता है ।
फिर भी, SINEUPs लाभ के समारोह अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, एंटीबॉडी उत्पादन बढ़ाने के लिए, और एक आरएनए थेरेपी के रूप में अप-1.5-3.0-गुना की सीमा के भीतर कमी प्रोटीन की अभिव्यक्ति को विनियमित । तरीकों यहां वर्णित करने के लिए लक्ष्य और वांछित mRNA के SINEUP प्रेरित अनुवाद वृद्धि का पता लगाने के लिए एक उपयोगी गाइड वर्तमान और पोस्ट के लिए एक नया उपकरण-transcriptional जीन विनियमन प्रदान करते हैं ।

जीनोमिक के बाद के दौर में, कई अंतर्दृष्टि के जीन विनियामक भूमिकाओं में प्राप्त किया गया है गैर कोडिंग antisense टेप अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकास के कारण1,2,3 और जीन संपादन उपकरण । टेप, जो पहले "transcriptional कचरा" माना जाता था की यह श्रेणी अब आनुवंशिक विनियमन के एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में स्थापित किया गया है । Antisense टेप को क्रोमेटिन और नियंत्रण स्थिरता और उनके cognate प्रोटीन की अभिव्यक्ति-कोडिंग नब्ज mRNA4,5की सूचना है । ज्यादातर मामलों में, विनियमन के इस विधा नकारात्मक और antisense टेप आरएनए-आरएनए6,7के माध्यम से उनकी भावना समकक्षों मौन है । प्राकृतिक antisense टेप की यह विशेषता सिंथेटिक छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना), microRNA (miRNA), और antisense ओलिगोस्पर्मिया (ASO) के रूप में downregulate वांछित जीन का उपयोग किया गया है8,9,10 ,11 लक्षित जीन अप के लिए एक तकनीकी शूंय छोड़ने-विनियमन ।
एक पेचीदा अध्ययन का प्रदर्शन है कि antisense लंबे समय से गैर कोडिंग RNAs (lncRNAs के रूप में) जीन Uchl1 (ubiquitin सी-टर्मिनल hydrolase L1) और Uxt (बैरे-प्रतिलिपि व्यक्त की) द्वारा antisense आरएनए क्षेत्र के परिप्रेक्ष्य बदल चूहों में transcriptional स्तर के पश्चात्12में उनके cognate भाव mRNA के अनुवाद को सकारात्मक रूप से विनियमित करना । इन के रूप में lncRNAs के 5 पिरणामस्वरूप अंत 5 पिरणामस्वरूप untranslated क्षेत्र में कई कुर्सियां (5 पिरणामस्वरूप UTR) उनके इसी भाव टेप के साथ ओवरलैप, और गैर अतिव्यापी 3 पिरणामस्वरूप अंत एक retrotransposon की एक औंधा दोहराने शामिल लघु interspersed परमाणु से संबंधित तत् (ज्या) कुटुंब. दिलचस्प है, हमने पाया है कि इस शोधों के पीछे मुख्य ड्राइविंग बल-विनियमन एंबेडेड साइन दोहराने है और यह केवल माउस को दोहराने के लिए सीमित नहीं है । मानव Alu दोहराने-lncRNAs के रूप में भी लक्ष्य भावना mRNAs का अनुवाद बढ़ाया, ज्या के एक उपंयास वर्ग के विचार मजबूत-विनियामक antisense गैर कोडिंग RNAs, उचित13SINEUPs नाम चालित । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्राकृतिक SINEUPs की क्षमता सिंथेटिक SINEUPs में संरक्षित करने के लिए विशेष रूप से विभिंन अंतर्जात और exogenous जीन14,15लक्ष्य बनाया है । SINEUPs दो महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं: पहले "बाध्यकारी डोमेन" (बी) जो आम तौर पर 5 पिरणामस्वरूप अंत एक प्रोटीन के प्राथमिक शुरू codon को शामिल अनुक्रम के पूरक क्षेत्र है mRNA कोडिंग, और दूसरा "प्रभाव डोमेन" (ईडी) के रूप में इसे शामिल एक SINEUP समारोह14 के लिए एक शर्त है जो ज्या के उल्टे दोहराने (चित्रा 1) । SINEUPs के लिए एक विशेष रूप से पसंद की एक जीन लक्ष्यीकरण BD डिजाइन अनुकूलित किया जा सकता है । यह तो एक विशेष एक जैविक मार्ग में शामिल जीन के समारोह काटना दोहन किया जा सकता है, एक पारंपरिक mRNA के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में व्यक्त की रणनीति । इसके अलावा, इस बहुमुखी उपकरण एंटीबॉडी उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए लागू किया जा सकता है, और कार्यात्मक प्रोटीन की अपर्याप्त खुराकों की वजह से haploinsufficient रोगों के इलाज के लिए एक दवा के रूप में16,17,18, 19,20,21.
SINEUP टेक्नोलॉजी के फायदे कई गुना होते हैं. यह transcriptional स्तर पर लक्ष्य की अभिव्यक्ति में परिवर्तन नहीं करता है । अब बीडीएस SINEUPs को और अधिक विशिष्टता प्रदान करते हैं, जबकि एक dsRNA-निर्भर तनाव15प्रतिक्रिया उत्प्रेरण नहीं है । प्रोटीन प्रेरण कोशिका की सामान्य शारीरिक सीमा के भीतर बनाए रखा है, ंयायपालिका या अत्यधिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के कारण किसी भी बचके प्रभाव को रोकने. SINEUPs माउस, मानव की एक विस्तृत विविधता के साथ संगत कर रहे हैं, और हंसटर प्रसंस्कृत सेल लाइनों, उदाहरण के लिए, HEK293T/17, HepG2, हेला, चो, MN9D, और कई और12,13,14,15,18 ,19. SINEUPs कुशलतापूर्वक अंतर्जात जीन लक्ष्य कर सकते हैं, क्षणिक जीन, और झंडा-टैग या luciferase फ्यूजन जीन, जीन विशिष्ट एंटीबॉडी14,18की जरूरत को नष्ट करने । बुनियादी SINEUP विश्लेषण नियमित सेल संस्कृति, अभिकर्मक, सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो की आवश्यकता है (एसडीएस-पृष्ठ), वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर) उपकरणों और सेटिंग्स, और विशेषज्ञता कम समय में प्राप्त किया जा सकता है ।
यहाँ, हम अप करने के लिए कृत्रिम SINEUPs के साथ जीन लक्ष्यीकरण के लिए एक विधि का वर्णन-अनुवाद को विनियमित, आरएनए हस्तक्षेप9 और ASO gapmers11,22,23जैसे अन्य प्रौद्योगिकियों के विपरीत एक प्रभाव. आरएनए-निर्देशित जीन सक्रियण के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि नियमित रूप से प्रतिक्रियाशील लघु palindromic दोहराया-आधारित सक्रियण (CRISPRa), जहां जीन अभिव्यक्ति transcriptional स्तर24पर शुरू हो रहा है संकुल है । इस विधि, हालांकि सरल और तेजी से, एकाधिक एकल गाइड RNAs (sgRNAs) उच्च दक्षता के लिए एक ही जीन लक्ष्यीकरण की आवश्यकता है, जिससे ऑफ लक्ष्य बंधन25की संभावना बढ़ रही है । इसके अलावा, CRISPRa प्रणाली के प्रमुख एंजाइम, उत्प्रेरक मृत CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (dCas9) कम बाध्यकारी विशिष्टता और sgRNAs लक्ष्यीकरण द्वि-दिशात्मक प्रवर्तक क्षेत्रों गैर विशेष रूप से अप-पास के जीन25को विनियमित कर सकते हैं । इसके विपरीत, SINEUPs उच्च विशिष्टता के साथ एक एकल बंधन क्षेत्र में mRNA लक्ष्य को बांध और आसपास के जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करते । हम SINEUP डिजाइन, अभिकर्मक, प्रोटीन और आरएनए एक्सप्रेशन विश्लेषण में शामिल बुनियादी कदमों पर चर्चा करते हैं । इसके अलावा, हम एक अर्द्ध स्वचालित, उच्च प्रवाह इमेजिंग प्रणाली को एक बार में कई SINEUPs स्क्रीन, जो इष्टतम SINEUPs का पता लगाने के लिए उपयोगी है वर्तमान ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Synthetic SINEUP</td>
			<td>Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan</td>
			<td>https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320</td>
			<td>Step 1.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/17</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-11268</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6902A01</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-124</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C2</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6083-1</td>
			<td>Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#9803S</td>
			<td>Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8553S</td>
			<td>Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>#5000112JA</td>
			<td>Step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 &#181;l</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>#4561035</td>
			<td>Step 4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm&#215;4 m)</td>
			<td>Amasham</td>
			<td>10600013</td>
			<td>Step 4.3., This is a 0.45 &#181;m nitrocellulose membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#9999S</td>
			<td>Step 4.4. A component of the blocking solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Tag Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-6455</td>
			<td>Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-Actin antibody produced in mouse</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A5441</td>
			<td>Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0448</td>
			<td>Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0447</td>
			<td>Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti &#946;-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Detection Reagents</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN2109</td>
			<td>Step 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AS4500</td>
			<td>Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AS1390</td>
			<td>Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ambion</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>6110A</td>
			<td>Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>Step 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst3342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Step 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>200-BFFL-S</td>
			<td>Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell based assays of sineup non-coding rnas that can specifically enhance mrna translation

लक्षित प्रोटीन वृद्धि महत्व का न केवल जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए है, लेकिन यह भी चिकित्सकीय और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों के लिए । यहां, हम चुनिंदा अप करने के लिए एक विधि प्रस्तुत-कृत्रिम antisense गैर के माध्यम से संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में वांछित जीन के प्रोटीन अभिव्यक्ति को विनियमित-कोडिंग RNAs SINEUPs के रूप में जाना जाता है । जीन अभिव्यक्ति के इस सकारात्मक नियंत्रण के बाद transcriptional स्तर पर है और एक औंधा लघु interspersed परमाणु तत्व (ज्या) SINEUPs के 3 पिरणामस्वरूप अंत है कि उसके प्रभाव डोमेन (एड) शामिल है पर दोहराने के द्वारा लागू । SINEUPs विशेष रूप से किसी भी प्रोटीन के लिए बाध्य कर सकते है अपने बाध्यकारी डोमेन (BD) के माध्यम से पसंद की कोडिंग mRNA, एक के लिए 5 पिरणामस्वरूप untranslated क्षेत्र (5 पिरणामस्वरूप UTR) और codon के शुरू mRNA के भीतर अनुक्रम पूरक डिजाइन क्षेत्र । लक्ष्य-विशिष्ट इस तरह से डिजाइन SINEUPs प्रसंस्कृत कोशिकाओं को transfected हैं, और प्रोटीन और आरएनए अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए निकाले जाते हैं, आम तौर पर 24-48 एच पोस्ट-अभिकर्मक. SINEUP-प्रेरित प्रोटीन अप-विनियमन पश्चिमी दाग विश्लेषण और आरएनए अभिव्यक्ति द्वारा पता लगाया है वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर का उपयोग कर मापा जाता है । हमने देखा है कि bd डिजाइन इष्टतम SINEUP गतिविधि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और है कि लक्ष्य mRNA के शुरू codon के संबंध में विभिंन bd आकार और पदों के परीक्षण की सिफारिश की है । इसलिए, हम यहां एक अर्द्ध स्वचालित उच्च प्रवाह इमेजिंग विधि प्रतिदीप्ति पता लगाने कि लक्ष्य mRNA ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ जुड़े को लागू किया जा सकता है पर आधारित का वर्णन । SINEUPs विशेष रूप से सेल के सामांय शारीरिक सीमा के भीतर अनुवाद बढ़ाने के लिए, लक्ष्य प्रतिलिपि स्तर फेरबदल के बिना । इस विधि को सफलतापूर्वक अंतर्जात और exogenous लक्ष्य की एक सीमा के खिलाफ कार्यरत है, मानव, माउस की एक विस्तृत विविधता में, और vivo सिस्टम में साथ कीट सेल लाइनों । इसके अलावा, SINEUPs एंटीबॉडी उत्पादन में वृद्धि और एक आरएनए haploinsufficient जीन के खिलाफ चिकित्सकीय के रूप में काम करने के लिए सूचित किया गया है । SINEUPs की बहुमुखी और मॉड्यूलर प्रकृति उन्हें जीन-विशिष्ट शोधों के नियंत्रण के लिए एक उपयुक्त उपकरण बनाती है.

SINEUP-GFP एक सिंथेटिक दोनों एक इष्टतम BD युक्त SINEUP है (-28/+ 4 GFP mRNA को ओवरलैप) और एक प्रवर्तन निदेशालय (के रूप में-Uchl1) कि अप कर सकते है विनियमित GFP mRNA अनुवाद (चित्रा 3 और बी) के GFP की अभिव्यक्ति को बदलने के बिना mRNA (चित्रा 3 सी और 3d) । SINEUPs के लिए इष्टतम बीडीएस और अनुदेशों के लिए स्क्रीन, हम अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण का एक प्रोटोकॉल है कि सुधार का पता लगाने के समय विकसित और एक साथ एक पारंपरिक पश्चिमी दाग विश्लेषण15के साथ तुलना में दिखलाई जा रहा नमूनों की संख्या में वृद्धि हुई । के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, इस उच्च प्रवाह इमेजिंग प्रणाली 3 दिन लग गए (पश्चिमी दाग विश्लेषण ४८ SINEUPs के लिए 2 सप्ताह लग गए) । कर प्रदर्शन किया है कि SINEUP-GFP GFP अनुवाद बढ़ जाती है, हम छवि cytometer द्वारा GFP एकीकृत तीव्रता का पता चला । SINEUP के इष्टतम BD-GFP GFP प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक १.४ गुना वृद्धि प्रेरित । हालांकि हम २.६-गुना (पश्चिमी दाग विश्लेषण से संकेतों के संपीड़न मनाया, चित्र 3ए देखें) १.४-गुना (इमेजिंग विश्लेषण, चित्रा 5देखें), अंतर इमेजिंग साधन सॉफ्टवेयर के अंशांकन के कारण हो सकता है । फिर भी, हम नियंत्रण (चित्र 5 ए और 5B) के साथ तुलना में GFP प्रतिदीप्ति के काफी उच्च स्तर का पता चला ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig1.jpg"> चित्रा 1: सिंथेटिक SINEUPs के बुनियादी डिजाइन । BD = बंधन डोमेन mRNA लक्ष्य, एड = प्रभाव एक औंधा साइन अनुक्रम युक्त डोमेन । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig2.jpg"> चित्रा 2: प्रतिलेखन शुरू साइटें (TSSs) मानव पार्किंसंस रोग प्रोटीन 7 (PARK7) mRNA विशिष्ट ऊतकों और कोशिकाओं में पिंजरे विश्लेषण द्वारा पता चला के रूप में । (क) एक ओमिक्स डेटा एकीकरण और इंटरैक्टिव दृश्य प्रणाली30का उपयोग mRNA मानव PARK7 के लिए एक TSS खोज परिणाम दिखा स्नैपशॉट । Entrez जीन hg19 ट्रैक में क्षैतिज हरे तीर संदर्भ मानव PARK7 mRNA और FANTOM5 पिंजरे 1 में ऊर्ध्वाधर हरी सलाखों के जीनोमिक स्थिति को इंगित करता है और 2 पटरियों TSSs की राशि से संकेत मिलता है (प्रति मिलियन (tpm) के रूप में मापा) १,८२९ ऊतकों और कोशिकाओं के प्रकार । (ख) एक पैनल में TSS के चिह्नित क्षेत्र के ज़ूम में (1/354 स्केल: ३५.४ kb से १०० bp) । FANTOM5 पिंजरे चरण 1 और 2 पटरियों में ग्रे छायांकित क्षेत्र आंकड़ा के तल पर सूचीबद्ध हैं, जो कुल १,८२९ से बाहर 6 विशिष्ट कोशिकाओं के TSS इंगित करता है । इन सूचीबद्ध कक्षों के लिए संगत संख्याओं (११.३६९, ४.९९८, ४.३०४, ३.५०९, ३.४७७, और ३.०५५) TSS के धूसर छायांकित स्थितियों में प्रत्येक विशिष्ट कक्ष के लिए प्रति लाख लेखन इंगित करता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig3.jpg"> चित्रा 3: पश्चिमी दाग विश्लेषण की पुष्टि-SINEUP-GFP द्वारा अनुवाद के विनियमन । (क) SINEUP-GFP विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी-दाग की जांच की गई. (ख) β-actin प्रोटीन बैंड की तीव्रता के लिए परिणाम सामान्यीकृत थे । (ग) qRT-पीसीआर द्वारा GFP mRNA और (घ) SINEUP RNAs एक्सप्रेशन का पता लगाया गया. p < ०.०००५, n = 3, दो-पुच्छित विद्यार्थी का t-परीक्षण, त्रुटि पट्टियां मानक विचलन हैं । यह आंकड़ा ताकाहाशी एट अल.15से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig4.jpg"> चित्रा 4: SINEUP अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण के योजनाबद्ध । 1 दिन: एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में ब्याज की बीज कोशिकाओं । Day 2: Transfect GFP और SINEUP-GFP । 3 दिन: GFP एकीकृत तीव्रता को मापने के द्वारा SINEUPs के प्रभाव का विश्लेषण । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig5.jpg"> चित्रा 5: अनुवाद के उच्च प्रवाह विश्लेषण-विनियमन SINEUP द्वारा-GFP । (क) नियंत्रण और SINEUP-GFP transfected कोशिकाओं के बीच GFP प्रतिदीप्ति की तुलना15. स्केल बार = 2 मिमी. (ख) GFP एकीकृत तीव्रता Hoechst ३३३४२ के साथ परमाणु दाग द्वारा गिना कुल सेल संख्या को सामान्यीकृत किया गया. p < ०.०००५, n = 3, दो-पुच्छित विद्यार्थी का t-परीक्षण, त्रुटि पट्टियां मानक विचलन हैं । FOV: देखने के क्षेत्र । यह आंकड़ा ताकाहाशी एट अल.15से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig5large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation at JoVE.com

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

सेल SINEUP गैर कोडिंग RNAs है कि विशेष रूप से mRNA अनुवाद में वृद्धि कर सकते है आधारित परख

SINEUPs सिंथेटिक antisense गैर कोडिंग RNAs है, जो एक बाध्यकारी डोमेन (BD) और एक प्रभाव डोमेन (ED) और अप लक्ष्य mRNA के अनुवाद को विनियमित होते हैं । यहां, हम SINEUPs के लिए खोज तरीकों का वर्णन के लिए संस्कृति में सेल लाइनों, उनके अनुवाद का विश्लेषण-पश्चिमी दाग और एक अर्द्ध स्वचालित उच्च प्रवाह इमेजिंग प्रणाली द्वारा गतिविधि को बढ़ावा देने ।

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

यह विधि कोशिकाओं और ऊतकों में मौजूद mRNAs का लाभ उठाकर, जीन की गतिविधि को सकारात्मक रूप से कैसे मॉडरेट करें, जैसे कि प्रमुख प्रश्नों का उत्तर देने में मदद कर सकती है। गतिविधि में कमियों की भरपाई कैसे करें, और एमआरएएनए इन विट्रो और वीवो में उच्च अनुवाद कैसे प्राप्त करें। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि हम विश्व स्तर पर रहने वाली कोशिकाओं में SINEUP के लक्ष्य जीन स्क्रीन कर सकते हैं, निर्धारण और संग्रह के बिना इमेजिंग द्वारा ।तो इस तकनीक के निहितार्थ हैप्लोइन्सफ्यूनिक उदाहरणों की हमारी चिकित्सा के लिए विस्तारित है, क्योंकि SINEUPs फ्रेडरिक के ataxia के मामलों में frataxin जैसे एक कमी प्रोटीन में दो गुना वृद्धि को प्रेरित कर सकते हैं । शुरू करने के लिए, ज़ेनबू ब्राउज़र खोलें, और रुचि के फैनटॉम प्रोजेक्ट डेटाबेस पर क्लिक करें। लक्ष्य जीन खोजें, और प्रतिलेखन शुरू साइट, या TSS, और वांछित कोशिकाओं और ऊतकों में अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करें ।TSS निर्धारित करने के लिए, पार्किंसंस रोग प्रोटीन सात, या PARK7 mRNA के उदाहरण विश्लेषण से परामर्श करें । पिंजरे पीक क्षेत्र द्वारा TSS की जांच करें । सेल और ऊतक विशिष्ट प्रतिलेखन अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए, पिंजरे पीक क्षेत्र का चयन करें और चयन के लिए जीनोमिक क्षेत्र को बढ़ाना पर क्लिक करें।पृष्ठ के नीचे ट्रांसक्रिप्ट अभिव्यक्ति सूची की खोज करके, सेल और ऊतक प्रकार की रुचि में पार्क7 अभिव्यक्ति की जांच करें। फिर, 40 बेस अपस्ट्रीम के अनुरूप कई अलग-अलग लंबाई के डोमेन दृश्यों को डिजाइन करें, और पहले मेथियोनाइन या अगस्त के 32 ठिकानों के नीचे। SINEUPs के साथ ट्रांसफैक्शन से पहले, पांडुलिपि में वर्णित दो पॉली-डी-lysine लेपित 24 अच्छी प्लेटों पर ब्याज की बीज कोशिकाओं।७० प्रतिशत की नरमी हासिल करने के लिए पांच प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट । कुओं में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करना बहुत महत्वपूर्ण है, इस उद्देश्य के लिए धीरे-धीरे एक साफ बेंच के अंदर कोशिकाओं को बोने के बाद प्लेट को 10 बार आगे-पीछे हिलाएं, और पांच प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में दोहराएं। इनक्यूबेशन के बाद, नए माध्यम के माध्यम को 0.4mL में बदलें।SINEUP-GFP का विश्लेषण करने के लिए मिश्रित समाधान के 0.1mL के साथ कई 1.5mL ट्यूब बनाने के लिए, pEGFP-C2, SINEUP-GFP, ट्रांसफैक्शन अभिकर्मक और प्रत्येक ट्यूब में OptiMEM के साथ, और फिर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब इनक्यूबेट । प्रत्येक ट्यूब से इस मिश्रित समाधान के 0.1mL एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक अलग अच्छी तरह से जोड़ें, और SINEUP-GFP एक, दो, तीन, चार, और पांच के साथ इन कुओं लेबल । 24 घंटे के लिए एक पांच प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट ।24 घंटे के बाद, पीबीएस के 0.5mL के साथ कोशिकाओं को धो लें। मात्रा ट्रिप्सिन प्रति ०.०५ प्रतिशत वजन के 25uL जोड़ें, और पांच मिनट के लिए एक पांच प्रतिशत CO2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट । सेल माध्यम के 275uL प्रति अच्छी तरह जोड़ें।प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, दो प्लेटों में से एक ले, और फसल 225uL या कोशिकाओं के तीन तिमाहियों एक अच्छी तरह से, और 75uL या आरएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं के एक चौथाई, प्रत्येक एक अलग 1.5mL ट्यूब में । सेंट्रीफ्यूज 6000xg पर पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर । अपकेंद्रित्र के बाद, प्रोटीन अलगाव द्वारा लेबल ट्यूब से सुपरनैंट को सावधानी से हटा दें।कोशिकाओं में लाइसिस समाधान का 60uL जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए धीमी गति से घूर्णन करके अच्छी तरह से मिश्रण द्वारा मिश्रण करें। प्रोटीन सुपरनैंट एकत्र करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14, 000xg पर ट्यूब अपकेंद्रित्र । प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, पहले अल्ट्रा-शुद्ध पानी में ताजा गोजातीय सीरम एल्बुमिन प्रोटीन मानक के पांच से छह गुना कमजोर पड़ने को तैयार करें, जिसमें ०.२ से लेकर 1.5 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन तक की सांद्रता हो ।वर्किंग रिएजेंट तैयार करने के लिए एक डैश मिक्स दो एमएल ट्यूब में रिएजेंट ए के एक एमएल में 20uL रिएजेंट एस जोड़ें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पानी के पांच यूएल जोड़ें। और फिर, प्रत्येक अच्छी तरह से बीएसए मानक या प्रोटीन नमूना।अभिवात एक डैश के 25uL जोड़ें, और फिर ध्यान से प्रति अच्छी तरह से अभिकर्मक बी के 200uL जोड़ें, किसी भी बुलबुला गठन से परहेज । कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली को कवर, पांच से आठ मिनट के लिए । स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 750 एनएम पर प्रोटीन अवशोषण को मापें।एक्स-एक्सिस पर बीएसए मानक प्रोटीन सांद्रता की साजिश रचकर एक मानक वक्र तैयार करें, और वाई-एक्सिस पर उनके संबंधित अवशोषण। नमूना प्रोटीन एकाग्रता की गणना करने के लिए एक मानक वक्र समीकरण लागू करें। प्रोटीन जुदाई शुरू करने के लिए, प्रोटीन नमूने की प्रत्येक मात्रा में 2x लोडिंग डाई की एक मात्रा जोड़ें।पांच मिनट के लिए ९० डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, और तुरंत एक मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा । प्रोटीन के नमूनों के 10 से 20ug लोड 10 प्रतिशत एसडीएस पॉलीएक्रेलैमाइड जेल और १०० से 150V पर अलग । प्रोटीन को जेल से 0.5 माइक्रोमीटर नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली में स्थानांतरित करें, एक अर्ध-शुष्क हस्तांतरण उपकरण द्वारा।30 मिनट के लिए 25V पर स्थानांतरण बफर के साथ भरें । स्थानांतरण के बाद, झिल्ली को एक कंटेनर में रखें, और झिल्ली पूरी तरह से भिगोए जाने तक अवरुद्ध समाधान जोड़ें, और इसे हिलाते हुए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। अवरुद्ध समाधान में उपयुक्त एंटीबॉडी जोड़ें, और झिल्ली पर डालें।हिलते हुए, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए झिल्ली को इनक्यूबेटिंग करके हाइब्रिड करें। संकरण के बाद, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 1x टीबीटी बफर जोड़कर झिल्ली को धोएं, और दो बार दोहराएं। झिल्ली पर समाधान को अवरुद्ध करने में पतला एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अगले संकरण का प्रदर्शन करें, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए जबकि मिलाते हुए।फिर कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 1x टीबीस्ट बफर जोड़कर झिल्ली को धोएं, और दो बार दोहराएं। एचआरपी के दो एमएल से भरे बॉक्स में झिल्ली को स्थानांतरित करें ईसीएल रिएजेंट मिक्स बढ़ाया। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बॉक्स को कवर, और कमरे के तापमान पर एक से दो मिनट के लिए इनक्यूबेट ।ईसीएल रिएजेंट मिश्रण से झिल्ली को सावधानी से हटा दें, और एक ल्यूमिनेसेंस इमेजिंग इंस्ट्रूमेंट का उपयोग करके इसे बेनकाब करें। इमेजिंग द्वारा कोशिकाओं में SINEUP-GFP के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, pEGFP-C2 धोने, और SINEUP-GFP अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से PBS के 0.5 mL के साथ दूसरी 24 अच्छी तरह से थाली से कोशिकाओं को पार । नाभिक को दागने के लिए, प्रत्येक कुएं में होचस्ट-33342 का 2ug जोड़ें, और कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करने के लिए, Hoechst दाग कोशिकाओं को मापने के लिए एक उच्च थ्रूपुट माइक्रोवेल छवि साइटोमीटर का उपयोग करें। जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या को गिनने के लिए हरे रंग के फ्लोरेसेंस की तीव्रता को मापें। विश्लेषण करने के लिए, सिनेयूप्स के प्रोटीन अपरेगुलेटरी प्रभाव, इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग एक GFP एकीकृत तीव्रता निर्धारित करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए प्राप्त खंडित वस्तुओं में संकेतों को प्रदर्शित करने वाली सभी पिक्सेल तीव्रता के योग के रूप में गणना करें।SINEUP-GFP के साथ एक सफल ट्रांसफैक्शन के बाद, एक सिंथेटिक साइनअप जिसमें एक इष्टतम बाध्यकारी डोमेन और एक प्रभावक डोमेन जीएफपी दोनों होते हैं, एमआरएनए अनुवाद को जीएफपी एमआरएनए की अभिव्यक्ति को बदले बिना उपनियमित किया गया था। अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण के एक प्रोटोकॉल का पता लगाने के समय में सुधार हुआ और नमूनों की संख्या में वृद्धि हुई एक साथ एक पारंपरिक पश्चिमी दाग विश्लेषण के साथ तुलना में जांच की जा रही है । हालांकि संकेत तीव्रता में अंतर था, पश्चिमी दाग विश्लेषण में 2.6 गुना से इमेजिंग विश्लेषण में 1.4 गुना तक, नियंत्रण की तुलना में जीएफपी फ्लोरेसेंस के काफी उच्च स्तर का पता चला।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, सही बाध्यकारी डोमेन डिजाइन करने के लिए लक्ष्य mRNAs के सही अनुक्रम की पहचान करना याद रखना महत्वपूर्ण है। जीन अक्सर प्रमोटरों से लिखित हैं, और विभिन्न अनुवाद दीक्षा साइट का उपयोग कर सकते हैं। ज़ेनबू ब्राउज़र इस तरह के एमआरएनए विचरण का पता लगाने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है।हमारा सुझाव है कि वेरिएबल बाइंडिंग साइटों के साथ अलग-अलग सिनयूप्स भी डिजाइन करें। कुल मिलाकर हम मानते हैं कि जल्दी से लक्ष्यों की बहुलता के लिए SINEUPs अनुकूल एक नया क्षेत्र स्थापित करेगा जिसमें मौजूदा आरएनए के सकारात्मक विनियमित अनुवाद शामिल हैं, जो सिरना के क्षेत्र के लिए एक पारस्परिक और मानार्थ है । उन समारोह का एक हिस्सा हम परिकल्पना करते हैं कि यह तकनीक बायोरिएक्टरों की तरह विट्रो में प्रोटीन की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने के साथ-साथ वीवो में स्वाभाविक रूप से जीन की खुराक को सही करने के लिए सहायक होगी ।

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

इंजिनियरिंग कृत्रिम कारक विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में वैकल्पिक स्पष्टीकरण में हेरफेर करने के लिए

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

अनुक्रम-विशिष्ट और चयनात्मक पहचान डबल-असहाय RNAs पर एकल-असहाय RNAs द्वारा रासायनिक संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

चयापचय लेबलिंग और स्थानांतरण RNAs Macroarrays का उपयोग कर की रूपरेखा

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

आरएनए Pull-डाउन प्रक्रिया एक लंबी गैर-कोडिंग आरएनए के आरएनए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

बायोटिन आधारित Pulldown परख सेलुलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों को मान्य करने के लिए

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

अलगाव, लक्षण वर्णन और मानव दंत कूप स्टेम सेल के MicroRNA आधारित आनुवंशिक संशोधन

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

बैक्टीरिया पर चयन और विकास के आधार पर Dictyostelium discoideum कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

इन विट्रो और में-सेल आकार छोटे अणु प्रेरित पूर्व mRNA संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए का उपयोग करना

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

लंबे noncoding rnas का उपयोग करके overexpressing जीन सक्रिय crispr

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

पूरे रक्त से mRNA के अनुक्रमण नैनोकोर अनुक्रमण का उपयोग

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...