Name: cell based assays of sineup non-coding rnas that can specifically enhance mrna translation
Uploaded: 2019-02-01T13:00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation at JoVE.com

Это исследование было частично поддерживается фундаментальной науки и технологии программы платформы для инновационных биологической медицины, № 17 am 0301014, от японского агентства для медицинских исследований и развития (AMED), исследовательский грант от МПКСНТ RIKEN центр для жизни Технологии и исследовательский грант от МПКСНТ RIKEN МСМ. Мы благодарим членов лаборатории PC и SINEUP сети ("Сисса", Университет Восточной Пьемонт и RIKEN) для размышлений обсуждения. Мы благодарим д-р Мэтью Валентина для корректуры.

<ol>
	<li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome.">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309 (5740), 1564-1566 (2005).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome.">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li><li>Hon, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+human+long+non-coding+RNAs+with+accurate+5'+ends.">An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5' ends.</a> Nature. 543 (7644), 199-204 (2017).</li><li>Tufarelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+antisense+RNA+leading+to+gene+silencing+and+methylation+as+a+novel+cause+of+human+genetic+disease.">Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease.</a> Nature Genetics. 34 (2), 157-165 (2003).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+tumour+suppressor+gene+p15+by+its+antisense+RNA.">Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA.</a> Nature. 451 (7175), 202-206 (2008).</li><li>Carninci, P., Hayashizaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNA+transcription+beyond+annotated+genes.">Noncoding RNA transcription beyond annotated genes.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 139-144 (2007).</li><li>Chu, Y., Yue, X., Younger, S. T., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+argonaute+proteins+in+gene+silencing+and+activation+by+RNAs+complementary+to+a+non-coding+transcript+at+the+progesterone+receptor+promoter.">Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter.</a> Nucleic Acids Research. 38 (21), 7736-7748 (2010).</li><li>Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microRNA+biogenesis.">Regulation of microRNA biogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 509-524 (2014).</li><li>Takahashi, H., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+genome+transcription:+new+possibilities+for+RNA+therapies.">Widespread genome transcription: new possibilities for RNA therapies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (2), 294-301 (2014).</li><li>Lam, J. K. W., Chow, M. Y. T., Zhang, Y., Leung, S. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing.">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4, e252 (2015).</li><li>Nishina, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA/RNA+heteroduplex+oligonucleotide+for+highly+efficient+gene+silencing.">DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide for highly efficient gene silencing.</a> Nature communications. 6, 7969 (2015).</li><li>Carrieri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+antisense+RNA+controls+Uchl1+translation+through+an+embedded+SINEB2+repeat.">Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat.</a> Nature. 491 (7424), 454-457 (2012).</li><li>Schein, A., Zucchelli, S., Kauppinen, S., Gustincich, S., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antisense+long+noncoding+RNAs+that+function+as+SINEUPs+in+human+cells.">Identification of antisense long noncoding RNAs that function as SINEUPs in human cells.</a> Scientific Reports. 6, 33605 (2016).</li><li>Zucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SINEUPs+are+modular+antisense+long+non-coding+RNAs+that+increase+synthesis+of+target+proteins+in+cells.">SINEUPs are modular antisense long non-coding RNAs that increase synthesis of target proteins in cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 174 (2015).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+features+of+synthetic+SINEUPs,+antisense+lncRNAs+that+specifically+enhance+protein+translation.">Identification of functional features of synthetic SINEUPs, antisense lncRNAs that specifically enhance protein translation.</a> PLOS ONE. 13 (2), e0183229 (2018).</li><li>Deutschbauer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169 (4), 1915-1925 (2005).</li><li>Indrieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+long+non-coding+RNAs+[SINEUPs]+rescue+defective+gene+expression+in+vivo.">Synthetic long non-coding RNAs [SINEUPs] rescue defective gene expression in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 27315 (2016).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+mammalian+cell+factories+with+SINEUP+noncoding+RNAs+to+improve+translation+of+secreted+proteins.">Engineering mammalian cell factories with SINEUP noncoding RNAs to improve translation of secreted proteins.</a> Gene. , (2015).</li><li>Sasso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+non-coding+SINEUP+RNA+boosts+semi-stable+production+of+fully+human+monoclonal+antibodies+in+HEK293E+cells.">A long non-coding SINEUP RNA boosts semi-stable production of fully human monoclonal antibodies in HEK293E cells.</a> MAbs. , 1-8 (2018).</li><li>Dang, V. T., Kassahn, K. S., Marcos, A. E., Ragan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+haploinsufficient+genes+and+their+genomic+proximity+to+segmental+duplications.">Identification of human haploinsufficient genes and their genomic proximity to segmental duplications.</a> European Journal of Human Genetics. 16 (11), 1350-1357 (2008).</li><li>Zucchelli, S., Patrucco, L., Persichetti, F., Gustincich, S., Cotella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Translation+in+Mammalian+Cell+Factories+to+Increase+Protein+Yield:+The+Unexpected+Use+of+Long+Non-Coding+SINEUP+RNAs.">Engineering Translation in Mammalian Cell Factories to Increase Protein Yield: The Unexpected Use of Long Non-Coding SINEUP RNAs.</a> Computational and Struct Biotechnology Journal. 14, 404-410 (2016).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model.">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes &amp; Development. 24 (15), 1634-1644 (2010).</li><li>Watts, J. K., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+disease+genes+in+the+laboratory+and+the+clinic.">Silencing disease genes in the laboratory and the clinic.</a> Journal of Pathology. 226 (2), 365-379 (2012).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells.">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (7), 670-676 (2014).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Liu, X., Harada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+isolation+from+mammalian+samples.">RNA isolation from mammalian samples.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Severin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+visualization+and+analysis+of+large-scale+sequencing+datasets+using+ZENBU.">Interactive visualization and analysis of large-scale sequencing datasets using ZENBU.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 217-219 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAe:+an+effective+method+for+targeted+protein+translation+enhancement+by+artificial+non-coding+RNA+with+SINEB2+repeat.">RNAe: an effective method for targeted protein translation enhancement by artificial non-coding RNA with SINEB2 repeat.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), e58 (2015).</li><li>Savi&#263;, N., Schwank, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapeutic+CRISPR/Cas9+genome+editing.">Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Translational Research. 168, 15-21 (2016).</li><li>Long, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAe+in+a+transgenic+growth+hormone+mouse+model+shows+potential+for+use+in+gene+therapy.">RNAe in a transgenic growth hormone mouse model shows potential for use in gene therapy.</a> Biotechnology Letters. , (2016).</li></ol>

Соавтор Piero Carninci является одним из основателей TransSINE Technologies Co. Ltd., хранящий интеллектуальной собственности по поданной патент (EP2691522A4 и JP2017169573A) и выдаче патента (US9353370B2) для SINEUP технологии.

Мы описали здесь протокол конкретно повышения производства белка из мишенью мРНК с помощью синус содержащих некодирующих РНК, называется SINEUPs. В качестве примера представитель оптимального синтетических SINEUP-GFP показано вверх регулировать перевод GFP мРНК 2.6-fold как измеряется Западной блот анализ.
Разработка оптимального BD имеет решающее значение для обеспечения SINEUP специфику и потенции (степени белка вверх-регулирования). Ранее мы экранируется Западной блот анализ15 17 BDs SINEUP-GFP и обнаружил, что оптимальный BD перекрывается Авг-Козак последовательность мРНК гена GFP, хотя он не может быть в случае с другими мРНК и должны быть проверены для каждого случая. Еще одна независимая группа также проверку BD, используя другой метод31. Как скрининг многие УРБ может быть довольно длительным и обременительным, мы ввели метод обнаружения SINEUP высокой пропускной способности здесь. Этот метод меры относительные изменения в плотности GFP интегрированы в transfected клеток SINEUP по сравнению с управления вектор transfected клетки. Для обеспечения клетки в частности хорошо плиты культуры являются transfected одинаково и GFP сигнал не сосредоточены только определенного региона хорошо, очень важно распространять клетки одинаково в скважинах на шаге 2.1. Для этой цели осторожно встряхнуть пластину и обратно в 10 раз (↑↓) после посева клетки внутри чистый скамейке и повторять в 5% CO2 инкубатора перед началом инкубации.
Другим важным шагом является расчет концентрации белка в шаге 3.3. Просчеты здесь может привести к загрузке ошибочное количество белка в Западной блот анализ, следовательно, предотвращение обнаружения небольших изменений в выражении протеина, некоторые из слабых SINEUPs или генерации ложных срабатываний от перегрузки. Рекомендуется подготовить свежезаваренным белка калибровочной кривой каждый раз, убедившись, что равное количество стандартов и образцы протеина измеряются в шаге 3.3.3. Протокол описанных здесь сосредоточена на SINEUP-GFP, но Западная блот анализ может быть использован для любых целевых mRNA интереса. Время инкубации и концентрация антител должны быть оптимизированы для каждого целевого компьютера получить лучший результат.
Одной из уникальных особенностей SINEUPs является, что уровень выражения целевого мРНК остается неизменным. Это важно для лечения РНК с DNase, чтобы избежать обнаружения transfected SINEUPs и Геномную ДНК методом ПЦР qRT. SINEUP РНК и выражение mRNA цели должно быть измерено qRT ПЦР для подтверждения успех transfection и SINEUP деятельности. SINEUPs содержат последовательность синус, который богат на протяжении как людские, так и мышь геномов. Чтобы избежать неспецифических обнаружения последовательностей синус, не рекомендуется для разработки qRT ПЦР Праймеры для синус последовательности.
В этом протоколе мы использовали линий клеток человека, но SINEUPs эффективным в ряде клеточных линий из нескольких различных видов12,13,14,18,19. Условия культуры и transfection клетки могут быть изменены согласно различных клеточных линий, до тех пор, как они поддерживать эффективность трансфекции SINEUP векторов. Кроме того могут использоваться альтернативные методы добычи, синтеза cDNA РНК и белка концентрацию проверка, учитывая, что они сохраняют требуемого качества РНК и белков для qRT-PCR и Западной блот анализ. Хотя мы использовали конкретные цитометр микро ну высокой пропускной способности, которая позволила обнаружения GFP флуоресценции через всю скважину, другие цитофлуориметрами с аналогичными дальность обнаружения может быть используемые31. Следует отметить, что если распределение клеток и трансфекции равны во всем хорошо, то это не нужно сканировать весь колодец для флуоресценции GFP: половина или четверть площади хорошо может быть достаточно, чтобы различать SINEUP эффект в зависимости от эксперимент Аль навыки.
Создание протокола обнаружения SINEUP высокой пропускной способностью позволяет для одновременного скрининга несколько УРБ, ориентация данной мРНК в культивируемых клеток. Это важно, поскольку правила, регулирующие оптимальной ориентации, BD до сих пор неясны. Мультиплекс, скрининг системы позволяет для крупномасштабных испытаний многих SINEUPs против различных генов, полезные для охвата нескольких генов, участвующих в частности сигнальный путь к примеру. Кроме того, он может быть использован для расширения поиска для эффективного SINEUPs ориентации несколько мРНК, проектирование различных SINEUP BDs вокруг региона Сен-Козак (см. рис. 1), совместно transfecting полную длину целевой mRNAs (5ʹ утр-CDS-3ʹ утр) сливается с GFP мРНК в культивируемых клеток для поиска оптимального SINEUPs и впоследствии тестирования кандидатов BD против эндогенного мРНК в культивируемых клеток и животных в естественных условиях модели, от людей и мышей для других видов животных и растений.
Этот протокол скрининга является очень быстро. Нам не нужно исправить и собрать клетки, но просто нужно разместить живые клетки культуры пластины в изображения документа. Мы предлагаем использовать этот протокол высокопроизводительного скрининга для выбора оптимального BDs SINEUPs и оценить потенциальных кандидатов, Западная блот анализ. Таким образом отобранные кандидаты с оптимальной УРБ могут применяться для увеличения антител производства18,19,21. В настоящее время РНК терапевтические области резко возрастает. К примеру siRNA, Асо, мРНК и ТРИФОСФАТЫ РНК терапии, широко используются для управления выражение mRNA их соответствующих целей9,32. В этом контексте SINEUPs находятся в зачаточном, но пока никто из изученных SINEUPs изменено выражение целевой мРНК. Кроме того, не изменяйте SINEUPs целевой мРНК, но только вверх регулировать перевод мРНК. Кроме того функция потерь заболеваний в результате haploinsufficiency могут быть направлены на SINEUP терапии, достижения 2 раза индукции протеина17,33. Хотя пробить эффекты должны быть дополнительно изучены, SINEUPs потенциально и конкретно цели единого, выраженная мРНК с дополнительные последовательности в BD.
Ограничение этого высокопроизводительного протокола является, что это не подходит для экрана BDs SINEUPs в в естественных условиях мыши модели, потому что меры по протоколу GFP интегрированных интенсивности только. Как естественный антисмысловых lncRNAs, что post-transcriptionally, SINEUPs не могут применяться, когда целевой мРНК отсутствует в клетки или образцов ткани.
Тем не менее SINEUPs может применяться для усиления функции исследования, повышения антител и как РНК терапии вверх-регулировать экспрессию дефицит белков в диапазоне 1,5-3,0 раза. Описанные здесь методы представляют полезным руководством для целевых и обнаружить SINEUP-индуцированной перевода повышение желаемого мРНК и обеспечить новый инструмент для регулирования post-transcriptional ген.

В постгеномной эре, многие идеи были приобретены в нормативной роли ген некодирующих антисмысловых стенограмм вследствие развития секвенирование нового поколения технологий1,2,3 и Джин-инструменты для редактирования. Эта категория стенограммы, который ранее считался «transcriptional корзину», теперь устанавливается как ключевой игрок генетического регулирования. Сообщается, что Антисмысловые стенограммы модулировать хроматина и стабильность управления и выражение их родственных белков кодирования чувство мРНК4,5. В большинстве случаев этот режим регулирования является отрицательным и антисмысловых стенограммы замолчать их смысл коллегами через РНК-РНК взаимодействия6,7. Эта черта природных антисмысловых стенограммы был использован с помощью желаемого генов в виде синтетических малые интерферирующие РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) и антисмысловых oligos (АСО)8,9,10 ,11 оставляя технологического пустота для целевых генов вверх регулирование.
Один интригующий исследование изменил перспективы поле Антисмысловые РНК, продемонстрировав, что antisense длиной некодирующих РНК (как lncRNAs) генов Uchl1 (гидролазы L1 убиквитин C-терминала) и Uxt (повсеместно выразил стенограмма) положительно регулируют перевод их узнаваемыми смысле мРНК на уровне post-transcriptional в мышах12. Конец 5ʹ этих lncRNAs перекрывается с несколькими базами в регионе непереведенные 5ʹ (5ʹ утр) их соответствующих смысле стенограмм, и конец 3ʹ non перекроя содержит Перевернутый повторить Ретротранспозоны принадлежащих к краткосрочной перемежаются ядерной элемент (синус) семья. Интересно мы обнаружили, что основной движущей силой этого трансляционного вверх регулирование встраиваемых синус повторить и это не ограничивается мыши, синус повторяет только. Человека Alu повтор содержащих как lncRNAs также усилено перевод целевой чувство мРНК, армирующие идею романа класса синус driven регулирования antisense кодирования РНК, соответствующим названием SINEUPs13. Недавние исследования показали, что потенциал естественных SINEUPs сохраняется в синтетических SINEUPs, призванных конкретно цели различных эндогенных и экзогенных генов14,15. SINEUPs имеют две важные функции: первый «связывающий домен» (BD) который обычно 5ʹ конец региона дополняет последовательность охватывающих первичной начать кодон мРНК белка кодирования и второй «эффекторных домен» (ED) как он включает в себя Перевернутый повторить синуса, что является обязательным условием для SINEUP функции14 (рис. 1). SINEUPs могут быть настроены для разработки BD, конкретно ориентированная на ген выбора. Это затем могут быть использованы для того чтобы рассечь функции конкретных генов, участвующих в биологической реакции, как лучшая альтернатива обычной стратегии гиперэкспрессия мРНК. Кроме того, этот универсальный инструмент может применяться для повышения антител и как препарат для лечения заболеваний гаплонедостаточных, вызванных недостаточной дозировке функциональных белков16,,1718, 19,,2021.
Преимущества технологии SINEUP многообразны. Это не меняет выражение целевого показателя на уровне транскрипционный анализ. Длиннее BDs обеспечивают больше конкретности в SINEUPs, не вызывая двуцепочечной ДНК зависимая стресс ответ15. Всасывание белков поддерживается в пределах нормального физиологического диапазона клеток, предотвращая любые пагубные последствия из-за ошибочной или чрезмерного белков. SINEUPs совместимы с широким разнообразием мыши, человека, и хомяк культивированный клеточных линий, например, HEK293T/17, HepG2, HeLa, Чо, MN9D и многие больше12,13,14,15,18 ,19. SINEUPs можно эффективно ориентировать эндогенного генов, временно гиперэкспрессия генов и отмеченных флагом или Люцифераза фьюжн генов, устраняя необходимость ген специфического антитела14,18. Основные SINEUP анализ требует обычной клеточной культуры, transfection, натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE), реальном времени количественных обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) Инструменты и параметры, и знания могут быть получены в течение короткого времени.
Здесь мы описываем метод для ориентации генов с синтетическими SINEUPs вверх-регулировать перевод, эффект в отличие от других технологий, таких как РНК интерференции9 и Асо-gapmers-11,-22,-23. Широко используемый метод для активации гена РНК руководствуясь является кластеризованным регулярно interspaced короткие палиндром повторяется-активации на основе (CRISPRa), где выражение гена инициируется транскрипционный анализ уровня24. Этот метод, хотя простой и быстрый, требует несколько одно руководство РНК (sgRNAs) ориентации же гена для более высокой эффективности, тем самым увеличивая шансы пробить привязки25. Кроме того ключевого фермента CRISPRa системы, каталитически мертвым ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (dCas9) имеет низкий привязки специфики и sgRNAs ориентация которую двунаправленным промоутер регионы могут неспецифически вверх регулировать рядом гены25. И наоборот SINEUPs связывают целевой мРНК в регион одной привязки с высокой точностью и не влияют на экспрессию генов поблизости. Мы обсудим основные этапы в SINEUP дизайн, transfection, белка и РНК выражение анализа. Кроме того мы представляем полуавтоматическое, высок объём изображений системы на экране несколько SINEUPs сразу, что полезно для обнаружения оптимального SINEUPs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Synthetic SINEUP</td>
			<td>Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan</td>
			<td>https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320</td>
			<td>Step 1.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/17</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-11268</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6902A01</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-124</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C2</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6083-1</td>
			<td>Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#9803S</td>
			<td>Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#8553S</td>
			<td>Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>#5000112JA</td>
			<td>Step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 &#181;l</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>#4561035</td>
			<td>Step 4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm&#215;4 m)</td>
			<td>Amasham</td>
			<td>10600013</td>
			<td>Step 4.3., This is a 0.45 &#181;m nitrocellulose membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#9999S</td>
			<td>Step 4.4. A component of the blocking solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Tag Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-6455</td>
			<td>Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-Actin antibody produced in mouse</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A5441</td>
			<td>Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0448</td>
			<td>Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako</td>
			<td>P0447</td>
			<td>Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti &#946;-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Detection Reagents</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN2109</td>
			<td>Step 4.9.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AS4500</td>
			<td>Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>AS1390</td>
			<td>Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ambion</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>6110A</td>
			<td>Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>Step 6.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst3342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Step 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celigo S</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>200-BFFL-S</td>
			<td>Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell based assays of sineup non-coding rnas that can specifically enhance mrna translation

Повышение целевых белков имеет важное значение не только для изучения биологических процессов, но и для терапевтических и биотехнологических применений. Здесь мы представляем метод выборочно вверх-регулировать выражение протеина желаемого генов в культивируемых клеток с помощью синтетических antisense кодирования РНК, известный как SINEUPs. Этот положительный контроль экспрессии генов находится на post-transcriptional уровне и оказываемое Перевернутый короткие перемежаются ядерный элемент (синус) повторить в конце 3ʹ SINEUPs, включает в себя его эффекторных домена (Эд). SINEUPs специально можно привязать к любой мРНК белка кодирования выбора путем его привязки домена (BD), регион, предназначенные для дополнения последовательность в регионе непереведенные 5ʹ (5ʹ утр) и вокруг начала кодон мРНК. Целевой объект специфического SINEUPs разработан таким образом transfected культивируемых клеток и белков и РНК извлекаются для анализа ниже по течению, как правило 24-48 ч после transfection. SINEUP-индуцированного белка вверх регулирования определяется Западной блот анализ и РНК выражение измеряется с помощью реального времени Количественная обратная транскрипция ПЦР. Мы заметили, что BD дизайн имеет решающее значение для достижения оптимального SINEUP активности и что тестирование различных размеров BD и позиции в отношении начала кодон цель, которую рекомендуется мРНК. Таким образом мы здесь описывать полуавтоматические высок объём изображения метод, основанный на флуоресценции обнаружения, который может быть реализован к цели, которую мРНК сливается с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП). SINEUPs конкретно улучшить перевод в пределах физиологической норме клетки, без изменения целевого уровня Стенограмма. Этот метод успешно работает против ряда эндогенных и экзогенных целей, в широкий спектр человека и мыши, насекомых клеточных линий, а также в естественных условиях систем. Кроме того были зарегистрированы SINEUPs увеличить производство антител и работать как терапевтические против гаплонедостаточных генов РНК. Универсальный и модульных характер SINEUPs делает их подходящим инструментом для трансляционного управления ген специфического.

SINEUP-GFP-это синтетический SINEUP, содержащий как оптимальный BD (-28 / + 4 перекрываются в мРНК гена GFP) и Эд (Перевернутый B2 синус от AS -Uchl1) которые можно вверх регулируют перевод GFP мРНК (Рисунок 3А и 3B) без изменения экспрессии гена GFP мРНК (рис. 3 c и 3D). Для оптимального УРП и ЭЦП для SINEUPs, мы разработали протокол анализа полуавтоматические изображений Улучшено время обнаружения и увеличил количество образцов, которые одновременно проходят проверку по сравнению с обычными Западной блот анализ15. Как показано на рисунке 4, эта система электронного фотографирования высок объём принял 3 дней (Западная блот анализ заняло 2 недели для 48 SINEUPs). Продемонстрировав, что SINEUP-GFP увеличивает GFP перевода, мы обнаружены GFP интегрированных интенсивности цитометр изображения. Оптимальное BD SINEUP-GFP индуцированных 1.4-fold увеличение экспрессии белка GFP. Хотя мы наблюдали сжатия сигналов от 2.6-fold (Западная блот анализ, см. рис. 3а) к 1.4-fold (Imaging анализ, смотрите Рисунок 5), разница может быть связано Калибровка инструмента программного обеспечения обработки изображений. Тем не менее мы обнаружили значительно более высокий уровень флюоресценции GFP, по сравнению с контролем (Рисунок 5А и 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig1.jpg"> Рисунок 1: основной дизайн синтетических SINEUPs. BD = связывающий домен целевой мРНК, Эд = эффекторных домен, содержащий последовательность Перевернутый синус. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig2.jpg"> Рисунок 2: Транскрипция, начиная с сайтов (тссс) человеческий белок болезнь Паркинсона 7 (PARK7) мРНК в определенных тканях и клетках как определяется Кейдж анализа. (A) A снимок показывает результат поиска ТВУ для человека PARK7 мРНК, используя омику интеграции данных и интерактивной визуализации системы30. Горизонтальные зеленая стрелка в трек hg19 гена Entrez указывает геномной положение ссылки на человека PARK7 мРНК и вертикальные зеленые бары в FANTOM5 КЛЕТКЕ 1 и 2 треки указывают сумму Спецкабель (измеряется как стенограмм за миллион (tpm)) от 1829 виды тканей и клеток. (B) масштаб в регионе заметно ТВУ в группе A (масштаб 1/354: 35.4 kb до 100 bp). Серый затененной области в фазе FANTOM5 КЛЕТКЕ, 1 и 2 треки указывает ТП 6 конкретных ячеек из всего 1829, которые перечислены в нижней части рисунка. Цифры (11.369, 4.998, 4.304, 3,509, 3.477 и 3.055) соответствует этих перечисленных клеток указывают стенограмм за миллион для каждой из ячеек в серой тени должностях ТВУ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig3.jpg"> Рисунок 3: Западная блот анализ, подтверждающие вверх регулирование перевод SINEUP-GFP. (A) SINEUP-GFP был осмотрен Западной блот с анти GFP антитела. (B) результаты были нормализованы к интенсивности β-миозина белков группы. МРНК гена GFP (C) и (D) SINEUP РНК выражения были обнаружены qRT ПЦР. p < 0.0005, n = 3, 2-Стьюдента t тест, погрешностей, стандартное отклонение. Эта цифра была изменена с Такахаси et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig4.jpg"> Рисунок 4: схема анализа полуавтоматические изображений SINEUP. День 1: Семя клетки интереса к 24 хорошо плиты. День 2: Transfect GFP и SINEUP-GFP. День 3: Анализ эффекта SINEUPs путем измерения интенсивности GFP интегрированы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58627/58627fig5.jpg"> Рисунок 5: высок объём анализ перевода вверх регулирование SINEUP-GFP. (A) сравнение GFP флюоресценция между элементом управления и SINEUP-GFP transfected клеток15. Шкалы бар = 2 mm. (B) GFP комплексной интенсивность нормализована всего мобильный номер ЦИКом ядерных окрашивание с Hoechst 33342. p < 0.0005, n = 3, 2-Стьюдента t тест, погрешностей, стандартное отклонение. ПЗ: поле зрения. Эта цифра была изменена с Такахаси et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58627/58627fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation at JoVE.com

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Ячейки на основе анализов SINEUP кодирования РНК, которые могут конкретно улучшить перевод мРНК

SINEUPs являются синтетические антисмысловых некодирующих РНК, которые содержат привязки домена (BD) и домен эффектор (Эд) и вверх регулировать перевод целевых мРНК. Здесь мы описываем методы обнаружения для SINEUPs в культивированный клеточных линий, анализ их перевод содействие деятельности Западной блот и полуавтоматические высокую пропускную способность системы.

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, такие как, как положительно умерить активность гена, воспользовавшись mRNAs, которые присутствуют в клетках и тканях. Как компенсировать недостатки в активности, и как добиться высокого перевода из mRNAs in vitro и in vivo. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем глобально экран SINEUP целевых генов в живых клетках, путем изображения без фиксации и сбора.Таким образом, последствия этого метода распространяются на нашу терапию гаплоинсуффизуемых экземпляров, потому что SINEUPs может вызвать двукратный рост дефицита белка, таких как фратаксин в случаях атаксии Фридриха. Для начала откройте браузер Зенбу и нажмите на базу данных проекта Fantom, представляющих интерес. Поиск целевого гена, и проверить для транскрипции начала сайта, или TSS, и уровень экспрессии в желаемых клеток и тканей.Чтобы определить TSS, проконсультируйтесь с примером анализа белка болезни Паркинсона семь, или PARK7 мРНК. Проверьте TSS по области пика клетки. Чтобы определить уровни экспрессии клеток и тканей, выберите область пика клетки и нажмите на увеличение геномной области для выбора.Проверьте выражение PARK7 в типе интереса клеток и тканей, исследуя список выражений стенограммы в нижней части страницы. Затем, дизайн связывания домена последовательности нескольких различных длин, соответствующих 40 баз вверх по течению, и 32 баз вниз по течению от первого methionine или AUG. До трансфекции с SINEUPs, семенные клетки, представляющие интерес на двух поли-д-лизин покрытием 24 пластины хорошо, как описано в рукописи.Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентный инкубатор CO2 для достижения 70 процентов слияния. Очень важно распределять клетки поровну в колодцах, для этого аккуратно встряхните пластину 10 раз вперед и назад после посева клеток внутри чистой скамейки, и повторите в пятипроцентной инкубаторе CO2. После инкубации измените средний до 0,4 мл свежей среды.Для анализа SINEUP-GFP сделайте несколько трубок 1,5 мл с 0,1 мл смешанного раствора, с pEGFP-C2, SINEUP-GFP, реагентами трансфекции и OptiMEM в каждой трубке, а затем инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 20 минут. Добавьте 0,1 мл этого смешанного раствора из каждой трубки в отдельную скважину из 24 колодцев и обозначить эти скважины SINEUP-GFP одним, двумя, тремя, четырьмя и пятью. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентный инкубатор CO2 в течение 24 часов.Через 24 часа, мыть клетки с 0,5 мл PBS. Добавить 25uL 0,05 процента веса на объем трипсина, и инкубировать в пять процентов CO2 инкубатор в течение пяти минут. Добавьте 275uL клеточной среды на колодец.Для извлечения белка возьмите одну из двух пластин и собери 225uL или три четверти клеток из одной колодец, и 75uL или одну четверть клеток для извлечения РНК, каждая в отдельную трубку 1,5 мл. Центрифуга при 6000xg в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. После центрифугации тщательно удалите супернатант из трубки, помеченной белковой изоляцией.Добавьте 60uL раствора лиза к клеткам и перемешайте путем pipetting Смешивание тщательно путем вращать на медленной скорости на один час на 4 градусах Celsius. Центрифуга трубки при 14 000xg в течение 10 минут при четырех градусах цельсия для сбора белка супернатанта. Для определения концентрации белка сначала приготовьте пять-шесть разбавление свежей сыворотки крупного рогатого скота в стандарте белка альбумин в ультра-чистой воде, с концентрациями от 0,2 до 1,5 мг/мл белка.Для приготовления рабочего реагента смесь Dash добавляет 20uL реагента S в один мл реагента А в двух мл трубки. Добавьте пять uL воды в качестве отрицательного контроля. А потом, BSA стандартный или образец белка в каждой хорошо.Добавить 25uL реагента тире, а затем осторожно добавить 200uL реагента B на хорошо, избегая образования пузырьков. Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы инкубировать при комнатной температуре, в течение пяти-восьми минут. Измерьте абсорбанс протеина на 750nm с спектрофотометром.Подготовь стандартную кривую, нацавав стандартные концентрации белка BSA на х-оси и их соответствующее поглощение на оси y. Применить стандартное уравнение кривой для расчета концентрации белка образца. Чтобы начать разделение белка, добавьте один том 2x погрузочного красителя к каждому объему образца белка.Нагрейте при температуре 90 градусов по Цельсию в течение пяти минут, и сразу же остыть на льду в течение одной минуты. Загрузите от 10 до 20 г образцов белка до 10 процентов полиакриламинидного геля SDS и разделите на 100-150V. Перенесите белок из геля в 0,5-метровую нитроцеллюлозную мембрану с помощью полусухого трансферного инструмента.Заполните буфер передачи при 25V в течение 30 минут. После переноса поместите мембрану в контейнер и добавьте блокирующий раствор до тех пор, пока мембрана не будет полностью пропитана, и инкубировать ее при комнатной температуре в течение 30 минут при встряхивании. Добавьте соответствующее антитело к блокирующий раствор, и залить мембрану.Гибридизировать путем инкубации мембраны в течение 30 минут при комнатной температуре, в то время как тряска. После гибридизации промойте мембрану, добавив буфер 1x TBST в течение пяти минут при комнатной температуре, и повторите еще два раза. Выполните следующую гибридизацию со вторичным антителом, разбавленным блокирующим раствором над мембраной, при комнатной температуре в течение 30 минут при встряхивании.Затем промойте мембрану, добавив буфер 1x TBST в течение пяти минут при комнатной температуре, и повторите еще два раза. Перенесите мембрану в коробку, наполненную двумя мл расширенной реагентной смеси ECL HRP. Накройте коробку алюминиевой фольгой и инкубировать в течение одной-двух минут при комнатной температуре.Тщательно удалите мембрану из смеси реагентов ECL и подвергайте ее использованию инструмента для визуализации люминесценции. Для анализа влияния SINEUP-GFP в клетках с помощью изображений, мыть pEGFP-C2, и SINEUP-GFP трансектируемых клеток из второй пластины 24 хорошо с 0,5 мл PBS на колодец. Чтобы испачкать ядро, добавьте 2 г гехста-33342 к каждому колодец и инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут.Используйте цитометр изображения с высокой пропускной способностью для измерения окрашенных клеток Hoechst, чтобы подсчитать общее количество клеток. Измерьте интенсивность зеленой флуоресценции, чтобы подсчитать количество положительных клеток GFP. Для анализа, белкового upregulatory эффект SINEUPs, использовать программное обеспечение для визуализации для определения GFP интегрированной интенсивности Вычислить его как сумму всех пикселей интенсивности отображения сигналов в сегментированных объектов, полученных для каждого канала.После успешной трансфекции с SINEUP-GFP, синтетическим SINEUP, содержащим как оптимальный обязательный домен, так и домен эффектора GFP, перевод мРНК был регулируется без изменения выражения GFP mRNA. Протокол полуавтоматического анализа изображений улучшил время обнаружения и увеличил количество образцов, одновременно скринингированных по сравнению с обычным западным анализом помарки. Несмотря на разницу в интенсивности сигнала, от 2,6 раза в анализе западной помарки до 1,4 раза в анализе изображений, были обнаружены значительно более высокие уровни флуоресценции GFP по сравнению с контролем.При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы определить правильную последовательность целевых mRNAs для разработки правильного связывания домена. Гены часто транскрибируются от промоутеров, и могут использовать различные сайты инициации перевода. Браузер Зенбу является очень полезным инструментом для изучения такой дисперсии mRNA.Мы также предлагаем разработать различные SINEUPs с переменными связывающими сайтами. В целом мы считаем, что быстрое адаптация SINEUPs к множественности целей создаст новую область, состоящую из положительно регулируемого перевода существующих РНК, что является взаимным и бесплатным для области siRNA. Часть этих функций мы предусматриваем, что эта технология будет иметь важное значение для производства большего количества белков в пробирке, как биореакторы, а также in vivo естественно исправить дозировку гена.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Метаболические маркировки и профилирование передачи РНК с помощью Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

На основе биотина пулдаун Assay для проверки mRNA цели сотовой адаптивной

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Генная инженерия сапротрофные discoideum клетки на основе выбора и роста бактерий

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Экспрессирующих длиной некодирующих РНК с помощью активации генов ТРИФОСФАТЫ

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...