Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

ونعترف المركز "التكامل نانوبيو"، وجامعة طوكيو. هذا العمل كان يدعمها معونات للشباب العلماء (ب) (26810046) إلى كو ودعمها جزئيا من معونات "بحوث الترويج خصيصا" (25000005) إلى "جمهورية مقدونيا يأتون" بفضل "الزمالات البحثية من الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS ) للعلماء الشباب وبرنامج المدارس الرائدة في الدراسات العليا (جبلي).

1-إعداد الضيوف مع قفصالغراء-R والعلامات
<ol><li>إعداد حل الغراء-بنك دبي الوطني محبوس.<ol>
<li>توليف محبوسالغراء-دبي (الشكل 1) اتباع الإجراءات الموصوفة سابقا20.</li>
		<li>إعداد حل أسهم من محبوسالغراء-دبي (10 مم) في الجافة ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). ?...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences.">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry &amp; Biology. 9, 943-948 (2002).</li><li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus.">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals.">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li><li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Go+in!+Go+out!+Inducible+control+of+nuclear+localization.">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium-based+&amp;#34;molecular+glues&amp;#34;+for+modulation+of+biomolecular+functions.">Guanidinium-based &amp;#34;molecular glues&amp;#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li><li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer:+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization.">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li><li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+&amp;#34;Molecular+Glue&amp;#34;+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin.">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &amp;#34;Molecular Glue&amp;#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue:+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids.">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li><li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies.">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+glues+for+manipulating+enzymes:+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues.">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li><li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes.">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Photoswitch:+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions.">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li><li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

لقد تحققت التحقيقات السابقة من إزفاء آثار خفيفة من البروتينات في نواة الخلية باستخدام قفص NLS7،،من89. وكما ذكر آنفا، هذه الأساليب تتطلب تقنيات إضافية دمج البروتينات معلم NLS في السيتوبلازم. على النقيض من ذلك، يتيح لنا العلامة الغراء-R محبو...

نواة الخلية، التي تحمل المعلومات الوراثية، واحدة من العضيات الأكثر أهمية كهدف إيصال الأدوية سوبسيلولار، منذ التحوير الجيني النسخ المتماثل والتعبير فعالة لعلاج الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان والوراثية اضطرابات1،،من23. النووية تسليم المخدرات، وتصريف الببتيد العلامات مثل التعريب النووية إشارات (NLS)4،،من56 تم التحقيق على نطاق واسع. ومع ذلك، بغية الحد من الآثار الجانبية غير المرغوب فيها، مراقبة الزمانية المكانية لنقل جسد النووية ضروري.
سابقا، أحرز إزفاء آثار خفيفة من البروتينات في نواة الخلية باستخدام قفص NLS7،،من89. وترحيل NLS في نواة الخلية بالربط بالنقل هيولى البروتينات6. في أساليب الإبلاغ عنها، هي مباشرة أدمج السيتوبلازم microinjection8 ضيف بروتينات تحمل NLS محبوس أو المعرب عنها في الخلايا المستهدفة باستخدام تقنية توسيع الشفرة الجينية9. ولذلك، أسلوب الذي يمكن أن يحقق الإقبال على الهاتف الخلوي والمستحثه بالصورة النووية إزفاء مفيداً للتطبيقات العملية.
هنا، يمكننا وصف إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف في الخلايا الحية باستخدام العلامات الجذعية الغراء الجزيئية محبوس (محبوسالغراء-R، الشكل 1). الالتصاق الجزيئية للذوبان في الماء10،11،12،13،14،15،16،،من1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 واضعة متعددة قو+ المعلقات سابقا ووضعت أحكام التي تلتزم بالبروتينات11،،من1213،،من1415، 16،17والأحماض النووية18،،من1920و الأغشية فسفوليبيد21وطين نانوشيتس22،23 من خلال تشكيل جسور الملح متعددة بين المعلقات قو+ والجماعات أوكسيانيونيك على الأهداف. المعلقات قو+ آر الغراء محبوسمحمية بجماعة فوتوكليفابل أنيونى، الاستعاضة عن بوتيرات نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل (بانفوك). يجري تناول الضيوف الموسومة محبوسالغراء-R في المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام وإقامتهم في اندوسوميس (الشكل 2). عند فوتويرادييشن، يتم فصل مجموعات نفوك با محبوسالغراء-R العائد أونكاجيد جزيئية غراء (Uncagedالغراء-R) تحمل المعلقات قو+ متعددة، مما يسهل الهجرة الضيف المعلمة ثم في السيتوبلازم متبوعاً بنواة الخلية (الشكل 2). يمكن أن تكون العلامة الغراء-R محبوسأونكاجيد بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية أو اثنين-فوتون الضوء (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء دون لالضيائيه خطيرة. ونحن تثبت تسليم النووية الخاضعة للرقابة سباتيوتيمبورالي الجزيئات الضيوف، فضلا عن الضيوف جزيء صغير محبوسالغراء-R به، مع استخدام نقاط الكم (قدس) وصبغة فلورسنت (نيتروبينزوكساديازولي؛ بنك دبي الوطني)، على التوالي، كأمثلة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> الشكل 1: الهياكل التخطيطي محبوسالغراء-ر. المعلقات أيون (قو+) جوانيدينيوم 9 من الغراء محبوس-R محمية بمجموعة نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل محل butyrate (بانفوك). هي مجموعات نفوك باالمشقوق التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية أو اثنين-فوتون ضوء الجرد. هو فونكتيوناليزيد جوهر محبوسالغراء-R التنسيق مع نيتروبينزوكساديازولي (دبي) أو ديبينزوسيلوكتيني (دبكو). طبع بإذن من المرجع20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> الشكل 2: توضيح التخطيطي لتشغيل ضوء النووية إزفاء الضيوف مترافق مع علامة غراء-R محبوس. الضيف/هو تناول المتقارن الغراء-Rمحبوسفي المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام. عند فوتويرادييشن، علامة الغراء-R محبوسأونكاجيد أن تسفر عن علامة غراء-R Uncaged، التي يمكن أن تسهل هروب اندوسومال الضيف المعلمة. وفي وقت لاحق، ترحيل الضيف المعلمة إلى نواة الخلية. طبع بإذن من المرجع20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

نواة الخلية واحدة من العضيات الأكثر أهمية كهدف إيصال الأدوية سوبسيلولار، منذ التحوير الجيني النسخ المتماثل والتعبير فعالة لعلاج الأمراض المختلفة. هنا، علينا أن نبرهن إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف استخدام قفص العلامات الجزيئية الغراء (قفصالغراء-R)، الذين المعلقات أيون (قو+) جوانيدينيوم متعددة محمية بواسطة جماعة فوتوكليفابل أنيونى (butyrate محل نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل؛ مكتبة الإسكندرية نفوك). يجري تناول الضيوف الموسومة محبوسالغراء-R في المعيشة الخلايا عن طريق الالتقام، وتبقى في اندوسوميس. ومع ذلك، عند فوتويرادييشن، يتم تحويل محبوسالغراء-R في أونكاجيد الجزيئية الغراء (الغراءUncaged-R) تحمل المعلقات قو+ متعددة، مما يسهل الهروب اندوسومال وازفاء النووية اللاحقة للضيوف. هذا الأسلوب واعدة بالنسبة للموقع انتقائية النووية تستهدف إيصال المخدرات، حيث يمكن ترحيل الضيوف كلمات داخل السيتوبلازم متبوعاً بنواة الخلية فقط عندما فوتويرادياتيد. قفص يمكن تسليم العلامات الغراء-R الضيوف الجزيئات مثل نقاط الكم (قدس) فضلا عن الضيوف جزيء صغير. قفص يمكن أن تكون العلامات الغراء-R أونكاجيد مع الأشعة فوق البنفسجية ليس فقط ولكن أيضا الضوء اثنين-فوتون (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، والتي يمكن اختراق عميق في الأنسجة.

قبل فوتويرادييشن، Hep3B الخلايا المحتضنة مع محبوسالغراء-بنك دبي الوطني معارضها fluorescence الشروريه الانبعاثات من تلك الداخلية (λext = 488 نانومتر؛ الأرقام 4A ج 4، الخضراء). تم الحصول عليها صورة مجهرية مماثلة عند الإثارة في 543 نانومتر للصبغ الأحمر ...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

ويصف هذا البروتوكول إزفاء النووية آثار خفيفة للضيوف في الخلايا الحية باستخدام العلامات الغراء الجزيئية محبوس. هذا الأسلوب واعدة لإيصال الأدوية النووية الاستهداف الانتقائي الموقع.

سباتيوتيمبورالي الخاضعة لسيطرة النووية إزفاء من الضيوف في الخلايا الحية باستخدام الغراء الجزيئية محبوس كالعلامات فوتواكتيفاتابل

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال تسليم الأدوية ، مثل كيفية تسليم الدواء إلى حبيبات خلوية محددة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نقل الغاز النووي يمكن أن يُستحث بواسطة الضوء. وسوف يكون إظهار الإجراء رينا Mogaki وأكيو Arisaka الطلاب غراد من مجموعتي.للبدء في إعداد ربط نقطة الكم قفص الغراء الجزيئي عن طريق توليف الغراء الجزيئية في قفص ربط ديبنزوسيكوكين كما هو موضح في مزيد من التفاصيل في مكان آخر. إعداد محلول مخزون 10 ملليمولار من الغراء الجزيئي المحبوس ربط ديبنزوسيكين في DMSO الجافة. ثم إعداد نقطة الكم ربط الغراء الجزيئي قفص قفص عن طريق جعل أول aseye النقاط الكم وظيفية.لتحقيق هذا إضافة 100 microliters من 125 micromolar aseye PEG4 NHS إستر في DMF إلى 400 ميكرولترات من حل DMF التي تحتوي على 500 نانوموللار من النقاط الكم التي يتم المغلفة مع ربط أمين وظيفية. يُحرّك الخليط لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وضع الحل الناتج في غشاء السليلوز مجددة وdedyze ذلك لمدة 24 ساعة مقابل 800 مل من DMF.التالي تمييع محلول الأسهم من الغراء الجزيئي في قفص ربط ديبنزوسيكوكتيني إلى 50 ميكروموللار مع DMF وإضافة 200 ميكرولترات منه إلى حل ما بعد غسيل الكلى. يُحرّك الخليط لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. ثم dialyze الخليط الناتج لمدة 24 ساعة ضد 800 مل من DMF الطازجة باستخدام غشاء السليلوز مجددة مع قطع الوزن الجزيئي من 25000.بعد 24 ساعة تخفيف الحل الناتج إلى 200 نانومولار مع DMF. الحفاظ على سرطان الكبد البشري البشري HEP3 B-الخلايا في المتوسط الأساسي الأدنى النسر تحتوي على 10٪ FBS في ظل ظروف الثقافة القياسية. قبل يوم واحد من التجربة بذور 5000 HEP3 B-الخلايا في 200 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة في كل بئر من 8 شرائح الزجاج غرف.ثم تغطية الشريحة ووضعها في حاضنة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي إزالة المتوسطة الثقافة وشطف الخلايا مرتين مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ما قبل الدافئة. إلى كل بئر من الشريحة 8 غرف إضافة 200 ميكرولترات من FBS المتوسطة الحرة التي تحتوي على 10 ميكرومولار من الغراء الجزيئي الموبوغ الفلورسنت.بعد احتضان لمدة 3 ساعات إزالة المتوسطة الثقافة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. لتصور endosomes إضافة 200 ميكرولترات من وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على 100 نانومولار من صبغة فلورية حمراء إضافية مثل LysoTracker الأحمر. احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 20 دقيقة.ثم إزالة المتوسطة الثقافة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك يرجع الخلايا إلى 200 ميكرولترات من الثقافة وسط. للحث على النقل النووي من الغراء الجزيئي المُغَلَل الفلوري المُغَلَّل في قفص مكان الخلايا تحت مصدر ضوء زينون 100 واط مجهز بـ 365 نانومتر شريطية.تعريض الخلايا لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين. خلال هذا الوقت الحفاظ على عينة الخلية التحكم دون التعرض للأشعة فوق البنفسجية في الظلام. يمكن أن تؤخذ غطاء من ركائز الزجاج قبالة للأشعة فوق البنفسجية فعالة التعرض ولكن اتخاذ الحذر كما التعرض لفترات طويلة للأشعة فوق البنفسجية قد يسبب موت الخلايا.لتصور النوى إضافة ميكرولتر واحد من وصمة عار Hoeschst إلى الوسط ثقافة. احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 10 دقائق. ثم ضع العينة على خشبة المسرح من مجهر المسح الضوئي بالليزر confocal.سجل micrographs لفلوريسسنت المصبوغة الغراء الجزيئية في قفص، وLysoTracker الأحمر، واللطخة النووية. كما هو مبين سابقا, البذور 5000 الإنسان سرطان الكبدية HEP3 الخلايا B-الخلايا في كل بئر من 8 جيدا شريحة الغرفة والثقافة في ظل الظروف القياسية لمدة 24 ساعة. توريد عينات الخلية مع 200 ميكرولترات من FBS ثقافة حرة المتوسطة التي تحتوي على الغراء الجزيئية الموبوءة الفلورية.احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 3 ساعات. ثم إزالة المتوسطة الثقافة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إعادة الخلايا إلى 200 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة.ثم تخضع لعينة مجهرية ليزر confocal وتسجيل micrographs كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. كما أظهرت سابقا البذور 5000 الإنسان hepatocellular سرطان HEP3 خلايا B-الخلايا في كل بئر من 8 8 جيدا غرفة الشريحة والثقافة في ظل الظروف القياسية لمدة 24 ساعة. توريد عينات الخلية مع 200 ميكرولترات من FBS الحرة الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10 نانوموللار من نقطة الكم مرتبطة الغراء الجزيئي قفص.احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 3 ساعات. ثم إزالة المتوسطة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد شطف الخلايا إعادتها إلى 200 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة.ثم ضع اللوحة تحت مصدر ضوء زينون بقدرة 100 واط مجهز بمصفاة 365 نانومتر. تعريض عينة الخلية لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين مع الاحتفاظ بعينات التحكم في الظلام. لتصور نوى إضافة 1 ميكرولتر من وصمة عار Hoechst إلى الوسط ثقافة.احتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 10 دقائق. ثم صورة الخلايا باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر confocal. بذور سرطان الكبد البشري HEP3 B-الخلايا في اليوم السابق للتجربة في 5000 الخلايا في بئر في لوحة ثقافة 96 جيدا.ثم تغطية الخلايا مع 200 ميكروليتر من وسائل الإعلام الثقافة ومن ثم وضع لوحة في حاضنة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي إزالة المتوسطة الثقافة وشطف عينة الخلية مرتين مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 200 ميكرولترات من FBS الحرة الثقافة المتوسطة التي تحتوي على الغراء الجزيئي الموبوغ فلوريا في تركيزات تتراوح بين 0.1 إلى 100 ميكرومولار.احتضان لوحة لمدة 3 ساعات ومن ثم وضع لوحة تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تعريض عينة الخلية لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين مع الاحتفاظ بعينات التحكم في الظلام. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في 10 ميكرولترات من الخلية العد كيت - 8 كاشف إلى ثقافة المتوسطة واحتضان عينة الخلية الناتجة لمدة 2 ساعة.ثم قراءة امتصاص العينات في 450 نانومتر باستخدام قارئ microplate. قبل التصوير الإشعاعي HEP3 B-الخلايا المحتضنة مع الغراء الجزيئي الموبوغ الفلورية في قفص معارض الانبعاثات الفلورية punctate من الداخل micrograph مماثلة تظهر الأحمر LysoTracker يشير إلى أن الغراء الجزيئي الموبوغ الفلورية كان مترجما في endosomes. وبناء على ذلك، لوحظ أن انبعاث الفلوريسنس القابلة ل وإذعان الغراء الجزيئي المصنوع الفلورية الفلورية قد لوحظ خارج نواة الخلية قبل الأشعة فوق البنفسجية.بعد الأشعة فوق البنفسجية الفلورسنت يوحي بأن الفلورسنت المُغَلَّغ فلورياً كان غير مُجَدَّد وُجِدَ إلى السيتوبلازم و نواة الخلية. ويمكن أن تكون هذه الترجمة النووية للغراء الجزيئي المُصَجوغ الفلوري المُصَجَن مُستحثاً في الموقع بشكل انتقائي بواسطة 2-فوتون بالقرب من ضوء الأشعة تحت الحمراء. لم يفلت الغراء الجزيئي المُصَبوغ الفلوري في المناطق غير المشععة من إندوسومات وظل بمثابة مفلورة.يمكن أن توفر علامات الغراء الجزيئي المُتذرة في قفص أيضًا ضيوفًا جزوليين صغيرًا مثل النقاط الكمية في نواة الخلية. ويمكن أن تؤخذ هذه conjugates تصل إلى الخلايا وبعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 دقيقة يمكن رؤية الانبعاثات الفلورية من النقاط الكمومية داخل النواة. بعد هذا التطور مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج الجيني لاستكشاف العلاج الآثار الجانبية المنخفضة.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

إعداد سطحي والفعال للGlycopolymers نيون ثلاثي مكون عبر تسيطر عليها RAFT البلمرة

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiolabeling والكمي لمستويات الخلايا من Phosphoinositides التي كتبها التلألؤ تدفق عالية الأداء اللوني السائل الديناميكي

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

تسلسل مصنع ستريت Heteroxylans عن طريق إنزيمي، والمواد الكيميائية (مثلأيشن) والمادية (الطيف الكتلي، الرنين المغناطيسي النووي) تقنيات

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

التحقيقات في جورجيا (III) مجمع EOB-DTPA وه<sup&gt; 68</sup&gt; جورجيا رديولبلد التناظرية

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

وصف الإلكترون النقل عبر الأغشية الحيوية الحية

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

الليزر-تدفئة والتألق قياس الطيف الكتلي لدراسة المواد النووية في ظروف محاكاة حادث محطة الطاقة نووية

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

في الموقع الكشف والتحديد الكمي خلية مفردة لجسيمات نانوية أكسيد المعدن باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

التحكم في فوتوريدوكس افتتاح الدائري البلمرة من س-كاربوكسيانهيدريديس توسط مجمعات ني/الزنك

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

تحقيق ضغوط معتدلة في سفن مختومة باستخدام الثلج الجاف كمصدر2 CO الصلبة

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

المحركات الجزيئية يحركها الضوء على الأسطح للتصوير الجزيئي واحد

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...