Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Vi anerkender centeret for NanoBio Integration, University of Tokyo. Dette arbejde blev støttet af licensbetaling for unge forskere (B) (26810046) til K.O. og delvist understøttet af licensbetaling for specielt fremmes forskning (25000005) til T.A. R.M. tak Research stipendier af Japan Society for fremme af videnskab (JSP'ER ) for unge videnskabsfolk og programmet for førende kandidat skoler (GPLLI).

1. forberedelse af gæsterne med burlim-R Tags
<ol><li>Forberede Cagedlim-NBD løsning.<ol>
<li>Syntetisere Cagedlim-NBD (figur 1) efter de procedurer tidligere beskrevet20.</li>
		<li>Forberede en stamopløsning af Cagedlim-NBD (10 mM) i tørre dimethylsulfoxid (DMSO). Bemærk: Opbevar stamopløsningen i mørke. Løsningen kan fortyndes med vandig buffere eller celle Kulturmedier efter forbrug.</li>
	</ol>
</li>
	<li>F...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences.">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry &amp; Biology. 9, 943-948 (2002).</li><li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus.">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals.">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li><li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Go+in!+Go+out!+Inducible+control+of+nuclear+localization.">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium-based+&amp;#34;molecular+glues&amp;#34;+for+modulation+of+biomolecular+functions.">Guanidinium-based &amp;#34;molecular glues&amp;#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li><li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer:+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization.">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li><li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+&amp;#34;Molecular+Glue&amp;#34;+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin.">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &amp;#34;Molecular Glue&amp;#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue:+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids.">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li><li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies.">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+glues+for+manipulating+enzymes:+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues.">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li><li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes.">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Photoswitch:+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions.">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li><li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Tidligere undersøgelser af lys-udløst translokation af proteiner i cellekernen er opnået ved hjælp af bur NLS7,8,9. Som tidligere nævnt kræver disse metoder ekstra teknikker til at indarbejde de NLS-tagged proteiner i cytoplasmaet. I modsætning hertil vores Cagedlim-R tag giver mulighed for ikke kun foto-induceret nukleare translokation, men også cellulære optagelse af gæsterne. Denne funktion af Caged<...

Cellekernen, der bærer genetisk information, er en af de vigtigste organeller som subcellulært medicinafgivelse mål, siden graduering af genet replikering og udtryk er effektiv til behandling af forskellige sygdomme herunder kræft og genetiske lidelser1,2,3. For nukleare leveringen af narkotika, konjugation af peptid tags som nukleare lokalisering signaler (NLS)4,5,6 har været bredt undersøgt. Men for at reducere uønskede bivirkninger, spatiotemporelle kontrol af den nukleare translokation er nødvendigt.
Tidligere, lys-udløst translokation af proteiner i cellekernen er opnået ved hjælp af bur NLS7,8,9. NLS vandrer ind i cellekernen ved binding til cytoplasmatisk transport proteiner6. I de rapporterede metoder, er gæst proteiner forsynet med bur NLS direkte indarbejdet i cytoplasma ved mikroinjektion8 eller udtrykt i target-cellerne bruger en genetiske kode ekspansion teknik9. Derfor, en metode, der kan opnå både cellulære optagelse og foto-induceret nukleare translokation er fordelagtige for praktiske anvendelser.
Heri, beskriver vi lys-udløst nukleare translokation af gæster i levende celler ved hjælp af dendritiske bur molekylære lim (Cagedlim-Rasmussen, figur 1) tags. Vandopløselige molekylære lim10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 forsynet med flere Gu+ vedhæng er tidligere udviklet, som overholder stramt proteiner11,12,13,14,15, 16,17, nukleinsyrer18,19,20, phospholipid membraner21og ler nanosheets22,23 gennem den dannelsen af flere salt broer mellem deres Gu+ vedhæng og oxyanionic grupper på målene. Gu+ vedhæng af Cagedlim-R er beskyttet af en anioniske photocleavable gruppe, butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gæsterne markeret med Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og ophold i endosomes (figur 2). Ved photoirradiation, er BANVOC grupper af Cagedlim-R adskilt for at give en uncaged molekylære lim (Uncagedlim-R) transporterer flere Gu+ vedhæng, som derefter letter overførslen af mærket gæsten i cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen (figur 2). Cagedlim-R tag kan være uncaged ved udsættelse for UV- eller to-foton nær-infrarødt (NIR) lys uden alvorlige fototoksicitet. Vi demonstrere spatiotemporally kontrolleret nuklear levering af makromolekylære gæster samt små-molekyle gæsterne med Cagedlim-R tags, ved hjælp af quantum dots (QDs) og et fluorescerende farvestof (nitrobenzoxadiazole; NBD), henholdsvis som eksempler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figur 1: Skematisk strukturer Cagedlim-r. De 9 guanidinium ion (Gu+) vedhæng af Cagedlim-R er beskyttet af en butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) gruppe. BANVOC grupper er kløvet af bestråling med UV- eller to-foton NIR lys. Fokale kernen i Cagedlim-R er functionalized med enten nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Genoptrykt med tilladelse fra reference20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figur 2: Skematisk illustration af lys-udløst nukleare translokation af gæsterne konjugeret med et Cagedlim-R tag. Gæsten /Cagedlim-R konjugat er taget i levende celler via endocytose. Ved photoirradiation er Cagedlim-R tag uncaged at give en Uncagedlim-R tag, som kan lette endosomal flugt af mærket gæsten. Efterfølgende vandrer tagged gæsten ind i cellekernen. Genoptrykt med tilladelse fra reference20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

Cellekernen er en af de vigtigste organeller som subcellulært medicinafgivelse mål, siden graduering af genet replikering og udtryk er effektiv til behandling af forskellige sygdomme. Her, viser vi lys-udløst nukleare translokation af gæster, der benytter bur molekylære lim (burlim-R) tags, hvis flere guanidinium ion (Gu+) vedhæng er beskyttet af en anioniske photocleavable gruppe (butyrat-substituerede nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gæsterne markeret med Cagedlim-R er taget i levende celler via endocytose og forblive i endosomes. Dog ved photoirradiation, er Cagedlim-R omdannet til uncaged molekylære lim (Uncagedlim-R) transporterer flere Gu+ vedhæng, som letter endosomal flugt og efterfølgende nukleare translokation af gæsterne. Denne metode er lovende for site-selektiv nukleare målrette medicinafgivelse, da de mærkede Gæster kan migrere ind i cytoplasmaet efterfulgt af cellekernen kun når photoirradiated. Bur Lim-R tags kan levere makromolekylære gæster såsom quantum dots (QDs) samt små-molekyle gæster. Bur Lim-R tags kan være uncaged med UV-lys, men også to-foton nær-infrarødt (NIR) lys, der kan trænge dybt ind i vævet.

Før photoirradiation, Hep3B cellerne inkuberes med Cagedlim-NBD udstillet punktformet fluorescens emission fra deres indre (λext = 488 nm; Tal 4A og 4 C, grønne). En analog Mikrograf blev fremstillet ved excitation på 543 nm for rødt-fluorescerende farvestof (tal 4B og 4 C, rød), der angiver, at Cagedlim-NBD lokaliseret i endosomes. I overensstemmelse herme...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Denne protokol beskriver lys-udløst nukleare translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim tags. Denne metode er lovende for site-selektiv nukleare målrette medicinafgivelse.

Spatiotemporally kontrolleret nuklear translokation af gæster i levende celler ved hjælp af bur molekylære lim som Photoactivatable Tags

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for narkotika levering, såsom hvordan man kan levere et lægemiddel til en bestemt cellulære-granulat. Den største fordel ved denne teknik er, at nuklear omplantning af gas kan induceres af lys. Demonstration af proceduren vil være Rina Mogaki og Akio Arisaka grad studerende fra min gruppe.For at begynde at forberede quantum dot forbundet bur molekylær lim ved at syntetisere bur molekylær lim forbundet dibenzocyclooctyne som beskrevet mere detaljeret andetsteds. Forbered en 10 millimolar bestand opløsning af bur molekylær lim forbundet dibenzocyclooctyne i tør DMSO. Derefter forberede quantum dot forbundet bur molekylær lim ved først at gøre aseye funktionaliserede kvanteprinder.For at opnå dette tilføje 100 mikroliter af 125 micromolar aseye PEG4 NHS ester i DMF til 400 mikroliter af en DMF-opløsning, der indeholder 500 nanomolar kvanteprikker, der er belagt med amin funktionaliseret pind. Rør blandingen i en time ved stuetemperatur. Den resulterende opløsning i en regenereret cellulosemembran og dialyze den i 24 timer mod 800 ml DMF.Dernæst fortyndes stamopløsningen af hemmelighedsfuld molekylær lim forbundet dibenzocyclooctyne til 50 mikromolar med DMF og tilsæt 200 mikroliter af det til postdialyseopløsningen. Rør blandingen i tre timer ved stuetemperatur. Dialyze derefter den resulterende blanding i 24 timer mod 800 ml frisk DMF ved hjælp af en regenereret cellulosemembran med molekylvægt skåret af 25000.Efter 24 timer fortyndes den resulterende opløsning til 200 nanomolar med DMF. Opretholde humane hepatocellulære karcinom HEP3 B-celler i Eagle's minimal væsentlige medium, der indeholder 10% FBS under standard kultur betingelser. En dag før eksperimentet frø 5000 HEP3 B-celler i 200 mikroliter af kultur medium i hver brønd af en 8 chambered glas dias.Dæk derefter diaset og læg det i en kuvøse i 24 timer. Den næste dag fjerne kultur medium og skyl cellerne to gange med 100 mikroliter af forvarperede PBS. Til hver brønd af de 8 chambered dias tilføje 200 mikroliter af FBS gratis medium, der indeholder 10 mikromolar af en fluorescerende farvet bur molekylær lim.Efter inkubation i 3 timer fjernes kulturmediet, og celleprøven skylles to gange med 100 mikroliter PBS. For at visualisere endosomer tilføje 200 mikroliter af kultur medier, der indeholder 100 nanomolar af en ekstra rød fluorescerende farvestof såsom LysoTracker Red. Inkuber den resulterende celleprøve i 20 minutter.Fjern derefter kulturmediet og skyl celleprøven to gange med 100 mikroliter PBS. Derefter returneres cellerne til 200 mikroliter af kulturmediet. At fremkalde nuklear translokation af fluorescerende farvet bur molekylær lim placere cellerne under en 100 watt xenon lyskilde udstyret med en 365 nanometer bandpass filter.Udsæt cellerne for UV-lys i 2 minutter. I denne periode skal kontrolcelleprøven opbevares uden UV-eksponering i mørke. Låget på glasunderlagene kan tages af for at opnå effektiv UV-eksponering, men vær forsigtig, da langvarig udsættelse for UV-lys kan forårsage celledød.For at visualisere kernerne tilføje en mikroliter af Hoeschst pletten til kulturmediet. Inkuber den resulterende celleprøve i 10 minutter. Placer derefter prøven på scenen af en konfokal laserscanning mikroskop.Optag mikrograferne for fluorescerende farvet molekylærlim i bur, LysoTracker Rød og den nukleare plet. Som tidligere vist, frø 5000 menneskelige hepatocellulære karcinom HEP3 B-celler i hver brønd af en 8 godt kammer dias og kultur under standard betingelser for 24 timer. Forsyne celleprøver med 200 mikroliter af FBS fri kultur medium, der indeholder fluorescerende farvet bur molekylær lim.Inkuber den resulterende celleprøve i 3 timer. Fjern derefter kulturmediet og skyl celleprøven to gange med 100 mikroliter PBS. Returner cellerne til 200 mikroliter af kulturmedium.Derefter underlagt prøve konfokal laserscanning mikroskopi og registrere mikrografer som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Som tidligere vist frø 5000 menneskelige hepatocellulære karcinom HEP3 B-celler i hver brønd af en 8 godt kammer dias og kultur under standard betingelser for 24 timer. Forsyne celleprøver med 200 mikroliter af FBS fri kultur medium, der indeholder 10 nanomolar af quantum dot forbundet bur molekylær lim.Inkuber den resulterende celleprøve i 3 timer. Fjern derefter mediet og skyl celleprøven to gange med 100 mikroliter PBS. Efter skylning cellerne returnere dem til 200 mikroliter af kultur medium.Placer derefter pladen under en 100 watt xenon lyskilde udstyret med en 365 nanometer bandpass filter. Udsæt celleprøven for UV-lys i 2 minutter, hvor kontrolprøverne opbevares i mørke. For at visualisere kernerne tilsættes 1 mikroliter Hoechst-plet til kulturmediet.Inkuber den resulterende celleprøve i 10 minutter. Derefter billede cellerne ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop. Frø det menneskelige hepatocellulære karcinom HEP3 B-celler dagen før eksperimentet på 5000 celler pr brønd i en 96 brønd kultur plade.Derefter dække cellerne med 200 mikroliter af kultur medier og derefter placere pladen i en inkubator i 24 timer. Den næste dag fjernes kulturmediet, og celleprøven skylles to gange med 100 mikroliter PBS. Derefter tilsættes 200 mikroliter af FBS fri kultur medium, der indeholder fluorescerende farvet bur molekylær lim i koncentrationer spænder fra 0,1 til 100 mikromolar.Inkuber pladen i 3 timer og læg derefter en plade under UV-lyskilden. Udsæt celleprøven for UV-lys i 2 minutter, hvor kontrolprøverne opbevares i mørke. Efter UV-eksponering ved 10 mikroliter af cell counting Kit-8 reagens til kulturmediet og inkuber den resulterende celleprøve i 2 timer.Læs derefter prøvernes absorption ved 450 nanometer ved hjælp af en mikropladelæser. Før fotostråling inkuberes HEP3 B-celler med fluorescerende farvet molekylærlim i bur, punktformig fluorescensemission fra interiøret, en analog mikrograf, der viser LysoTracker Rød, viser, at fluorescerende farvet molekylærlim i bur blev lokaliseret i endosomerne. Derfor blev fluorescensemissionen, der kunne henføres til den fluorescerende farvede molekylærlim i bur, observeret uden for cellekernen før UV-stråling.Efter UV-stråling fluorescerende tyder på, at fluorescerende farvet bur molekylærlim var uncaged og migreret ind i cytoplasmaet og cellekernen. En sådan nuklear oversættelse af fluorescerende farvet bur molekylærlim kan induceres site selektivt ved 2-foton nær infrarødt lys. Den fluorescerende farvede molekylærlim i bur i ikke-bestrålede områder slap ikke ud af enderne og forblev som punktformet fluorescens.Dendritiske bur molekylærlim tags kan også levere makromolekylære gæster såsom kvanteprikker i cellekernen. Disse konjugater kan tages op i cellerne, og efter UV-eksponering i 2 minutter kan fluorescensemissionen af kvanteprindene ses i kernen. Efter denne udvikling denne teknik banede vejen for forskere inden for genterapi til at udforske lav bivirkning behandling.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Facile og effektiv forberedelse af Tri-komponent fluorescerende Glycopolymers via RAFT-kontrolleret polymerisation

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radioaktiv mærkning og kvantificering af cellulære niveauer af phosphoinositider af højtryksvæskekromatografi-koblede Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekventering af Plant Wall Heteroxylans Brug Enzymatisk, Chemical (Methylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Undersøgelser på Ga (III) Kompleks af EOB-DTPA og dens<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radiomærket Analog

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Kendetegner elektron Transport gennem levende biofilm

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

Laser-varme og udstråling massespektrometri for studiet af nukleare materialer i betingelser simulerer et atomkraftværk ulykke

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Påvisning og enkelt celle kvantificering af Metal metaloxid bruger nukleare Microprobe analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Kontrolleret Photoredox Ring-åbning polymerisering af O- Carboxyanhydrides medieret af Ni/Zn komplekser

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

At opnå moderat pres i lukkede fartøjer, der anvender tøris som en Solid CO2 kilde

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Lys-drevet molekylære motorer på overflader for enkelt molekylær billeddannelse

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...