Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Wij erkennen het centrum voor NanoBio integratie, de Universiteit van Tokio. Dit werk was ondersteund door de Grant-in-Aid voor de wetenschappers (B) (26810046) van de jonge aan K.O. en slechts gedeeltelijk ondersteund door Grant-in-Aid speciaal bevorderd onderzoek (25000005) naar T.A. R.M. bedankt de Research Fellowships van Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS ) voor jonge wetenschappers en het programma voor toonaangevende gediplomeerde scholen (GPLLI).

1. bereiding van gasten met gekooidelijm-R Tags
<ol><li>Bereid Cagedlijm-NBD-oplossing.<ol>
<li>Synthetiseren Cagedlijm-NBD (Figuur 1) na de procedures eerder beschreven20.</li>
		<li>Voorbereiden van een stamoplossing van Cagedlijm-NBD (10 mM) in droge dimethylsulfoxide (DMSO). Opmerking: Bewaar de stockoplossing in donker. De oplossing kan worden verdund met waterige buffers of cel-cultuur-media bij gebruik.</li>
	</o...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences.">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry &amp; Biology. 9, 943-948 (2002).</li><li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus.">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals.">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li><li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Go+in!+Go+out!+Inducible+control+of+nuclear+localization.">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium-based+&amp;#34;molecular+glues&amp;#34;+for+modulation+of+biomolecular+functions.">Guanidinium-based &amp;#34;molecular glues&amp;#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li><li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer:+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization.">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li><li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+&amp;#34;Molecular+Glue&amp;#34;+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin.">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &amp;#34;Molecular Glue&amp;#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue:+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids.">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li><li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies.">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+glues+for+manipulating+enzymes:+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues.">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li><li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes.">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Photoswitch:+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions.">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li><li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Vorige onderzoeken van licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern hebben bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. Zoals eerder vermeld, vereisen deze methoden additionele technieken te nemen de NLS-gelabelde proteïnen in het cytoplasma. Onze Cagedlijm-R tag kan daarentegen niet alleen foto-geïnduceerde nucleaire translocatie, maar ook cellulaire opname van de gasten. Deze functie van de Caged<...

De celkern, die genetische informatie draagt, is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten waaronder kanker en genetische stoornissen van1,2,3. Voor nucleaire levering van drugs, vervoeging van peptide tags zoals nucleaire localisatie signalen (NLS)4,5,6 grote schaal is onderzocht. Ter beperking van ongewenste bijwerkingen hebben, is echter de spatio controle van de nucleaire translocatie nodig.
Eerder, licht-geactiveerd translocatie van eiwitten in de celkern heeft bereikt met behulp van gekooide NLS-7,-8,9. NLS worden naar de celkern door binding aan cytoplasmatische vervoer eiwitten6gemigreerd. In de gerapporteerde methoden, zijn gast eiwitten dragen gekooide NLS direct ingelijfd bij het cytoplasma van microinjection8 of uitgedrukt in de doelcellen met behulp van een genetische code uitbreiding techniek9. Een methode die zowel cellulaire opname- en foto-geïnduceerde nucleaire translocatie kan bereiken is dus voordelig voor praktische toepassingen.
Hierin beschrijven we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van dendritische gekooide moleculaire lijm (Cagedlijm-R, Figuur 1) tags. In water oplosbare moleculaire lijm10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , rekening houdend met meerdere Gu+ Hangers zijn eerder ontwikkeld, die strak houden aan eiwitten11,12,13,14,15, 16,17, nucleïnezuren18,19,20, fosfolipide membranen21en klei nanosheets22,23 via de vorming van meerdere zout bruggen tussen hun Gu+ hangers en oxyanionic groepen op de doelen. De hangers Gu+ van Cagedlijm-R worden beschermd door een anionogene photocleavable groep, butyraat-gesubstitueerde nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en verblijf in Endosomen (Figuur 2). Op photoirradiation, zijn de BANVOC groepen Cagedlijm-R zodanig dat deze een uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, die vervolgens de migratie van de tagged gast vergemakkelijkt vrijstaand in het cytoplasma gevolgd door de celkern (Figuur 2). De Cagedlijm-R tag kan worden uncaged door blootstelling aan UV- of twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht zonder ernstige fototoxiciteit. We tonen de spatiotemporally gecontroleerde nucleaire levering van macromoleculaire gasten evenals gasten van de kleine-molecuul met Cagedlijm-R tags, met behulp van quantumdots (QDs) en een fluorescente kleurstof (nitrobenzoxadiazole; NBD), respectievelijk, als voorbeelden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figuur 1: Schematische structuren van Cagedlijm-R. De 9 guanidinium ion (Gu+) Hangers van Cagedlijm-R worden beschermd door een groep butyraat-gesubstitueerde nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). De BANVOC groepen zijn gekloofd door bestraling met UV- of twee-foton NIR licht. De focal kern van Cagedlijm-R is matiemaatschappij met nitrobenzoxadiazole (NBD) of dibenzocylooctyne (DBCO). Overgenomen met toestemming van referentie20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figuur 2: Schematische afbeelding van licht-geactiveerd nucleaire translocatie van gasten geconjugeerd met een Cagedlijm-R tag. De gast /Cagedlijm-R conjugaat wordt in beslag genomen in levende cellen via endocytosis. Op photoirradiation is de Cagedlijm-R tag uncaged een Uncagedlijm-R tag, die endosomal ontsnappen van de tagged gast vergemakkelijken kan opleveren. Vervolgens worden de tagged gast naar de celkern gemigreerd. Overgenomen met toestemming van referentie20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

De celkern is een van de belangrijkste organellen als subcellular drug-levering doel, sinds modulatie van gene replicatie en expressie is effectief voor de behandeling van verschillende ziekten. Hier tonen we licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten met behulp van moleculaire lijm (GlueCaged-R) tags, waarvan meerdere guanidinium ion (Gu+) Hangers worden beschermd door een groep van de anionactieve photocleavable (butyraat-gesubstitueerde gekooide nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gasten gelabeld met Cagedlijm-R worden overgenomen in levende cellen via endocytose en blijven Endosomen. Echter, op photoirradiation, Cagedlijm-R wordt omgezet in uncaged moleculaire lijm (Glue-RUncaged) uitvoering van meerdere Gu+ Hangers, dat de endosomal vlucht en de daaropvolgende nucleaire translocatie van de gasten vergemakkelijkt. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug levering, aangezien de tagged gasten naar het cytoplasma gevolgd door de celkern migreren kunnen alleen als photoirradiated. Caged Lijm-R tags kunnen leveren macromoleculaire gasten zoals quantumdots (QDs) evenals kleine-molecuul gasten. Caged Lijm-R tags kunnen uncaged met niet alleen UV-licht, maar ook twee-foton nabij-infrarood (NIR) licht, dat diep in weefsel kan binnendringen.

Voor photoirradiation, Hep3B cellen geïncubeerd met Cagedlijm-NBD tentoongesteld punctate fluorescentie emissie van hun interieur (λext = 488 nm; Cijfers 4A en 4 C, groen). Een analoge opname werd verkregen na excitatie bij 543 nm voor rood-fluorescerende kleurstof (cijfers 4B en 4 C, rode), die aangeeft dat Cagedlijm-NBD gelokaliseerd in de Endosomen. Dienover...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Dit protocol beschrijft licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van gekooide moleculaire lijm tags. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug delivery.

Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de levering van geneesmiddelen, zoals hoe een geneesmiddel te leveren aan een specifieke cellulaire-korrelig. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat nucleaire translocatie van gas kan worden veroorzaakt door licht. Het aantonen van de procedure zal Rina Mogaki en Akio Arisaka de grad studenten uit mijn groep.Om te beginnen met de voorbereiding van de quantum dot gekoppelde kooi moleculaire lijm door het synthetiseren van gekooide moleculaire lijm gekoppeld dibenzocyclooctyne zoals beschreven in meer detail elders. Bereid een 10 millimolar voorraadoplossing van de gekooide moleculaire lijm gekoppelde dibenzocyclooctyne in droge DMSO. Bereid vervolgens de quantum dot gekoppelde gekooide moleculaire lijm door eerst het maken van aseye gefunctionaliseerde quantum dots.Om dit te bereiken voeg 100 microliter van 125 micromolar aseye PEG4 NHS ester in DMF tot 400 microliter van een DMF-oplossing met 500 nanomolar van quantum dots die zijn bekleed met amine gefunctionaliseerde peg. Roer het mengsel gedurende een uur op kamertemperatuur. Plaats de resulterende oplossing in een geregenereerd cellulosemembraan en dialyseer deze gedurende 24 uur tegen 800 ml DMF.Vervolgens verdunnen de voorraad oplossing van gekooide moleculaire lijm gekoppeld dibenzocyclooctyne tot 50 micromolar met DMF en voeg 200 microliters van het aan de post dialyse oplossing. Roer het mengsel drie uur op kamertemperatuur. Dialyseer vervolgens het resulterende mengsel gedurende 24 uur tegen 800 ml verse DMF met behulp van een geregenereerd cellulosemembraan met het moleculaire gewicht afgesneden van 25000.Verdun na 24 uur de resulterende oplossing tot 200 nanomolar met DMF. Onderhoud menselijk hepatocellulair carcinoom HEP3 B-cellen in Eagle's minimale essentiële medium met 10% FBS onder standaard kweekomstandigheden. Een dag voor het experiment zaad 5000 HEP3 B-cellen in 200 microliters van cultuurmedium in elke put van een 8 chambered glazen glijbaan.Bedek vervolgens de glijbaan en plaats deze 24 uur in een couveuse. De volgende dag verwijder het kweekmedium en spoel de cellen twee keer af met 100 microliter voorverwarmde PBS. Voeg aan elke put van de 8 kamerige dia 200 microliters FBS-vrij medium toe met 10 micromolar van een fluorescerende gekooide moleculaire lijm.Na 3 uur uitbroeden verwijder je het kweekmedium en spoel je het celmonster twee keer af met 100 microliter PBS. Om de endosomes te visualiseren voeg 200 microliters van cultuurmedia toe die 100 nanomolar van een extra rode fluorescerende kleurstof zoals Rood LysoTracker bevatten. Het resulterende celmonster gedurende 20 minuten uitbroeden.Verwijder vervolgens het kweekmedium en spoel het celmonster twee keer af met 100 microliter PBS. Daarna keren de cellen aan 200 microliters van het cultuurmiddel terug. Om nucleaire translocatie van de fluorescerende gekooide moleculaire lijm te induceren plaats de cellen onder een 100 watt xenon lichtbron uitgerust met een 365 nanometer bandpass filter.Stel de cellen gedurende 2 minuten bloot aan UV-licht. Gedurende deze tijd houden de controle cel monster zonder UV-blootstelling in het donker. Het deksel van de glazen substraten kan worden uitgeschakeld voor een efficiënte UV-blootstelling, maar wees voorzichtig omdat langdurige blootstelling aan UV-licht celdood kan veroorzaken.Om de kernen te visualiseren voeg een microliter van Hoeschst vlek aan het cultuurmedium toe. Het resulterende celmonster gedurende 10 minuten uitbroeden. Plaats vervolgens het monster op het podium van een confocale laserscanmicroscoop.Neem de micrografen op voor de fluorescerende gekooide gekooide moleculaire lijm, de LysoTracker Red en de nucleaire vlek. Zoals eerder getoond, zaad 5000 menselijke hepatocellulaire carcinoom HEP3 B-cellen in elke put van een 8 goed kamer dia en cultuur onder standaard omstandigheden voor 24 uur. Voorslever de celmonsters van 200 microliters van FBS vrij kweekmedium met de fluorescerende gekooide moleculaire lijm.Het resulterende celmonster gedurende 3 uur uitbroeden. Verwijder vervolgens het kweekmedium en spoel het celmonster twee keer af met 100 microliter PBS. Breng de cellen terug naar 200 microliters van cultuurmedium.Vervolgens onderworpen aan monster confocale laser scanning microscopie en neem de micrografen zoals beschreven in de begeleidende tekst protocol. Zoals eerder getoond zaad 5000 menselijke hepatocellulaire carcinoom HEP3 B-cellen in elke put van een 8 goed kamer dia en cultuur onder standaard omstandigheden voor 24 uur. Voorbeleed de celmonsters met 200 microliters van FBS gratis kweekmedium met 10 nanomolar van de quantumdot gekoppelde moleculaire lijm.Het resulterende celmonster gedurende 3 uur uitbroeden. Verwijder vervolgens het medium en spoel het celmonster twee keer af met 100 microliter PBS. Na het spoelen brengen de cellen ze terug naar 200 microliters van cultuurmedium.Plaats de plaat vervolgens onder een 100 watt xenon lichtbron uitgerust met een 365 nanometer bandpass filter. Stel het celmonster 2 minuten bloot aan UV-licht, waarbij de controlemonsters in het donker worden gehouden. Om de kernen te visualiseren voeg 1 microliter hoechst vlek aan het cultuurmedium toe.Het resulterende celmonster gedurende 10 minuten uitbroeden. Vervolgens beeld de cellen met behulp van een confocale laser scanning microscoop. Zaad de menselijke hepatocellulaire carcinoom HEP3 B-cellen de dag voor het experiment bij 5000 cellen per goed in een 96 goed kweekplaat.Bedek vervolgens de cellen met 200 microliters van cultuurmedia en plaats de plaat vervolgens 24 uur in een couveuse. De volgende dag verwijder het kweekmedium en spoel het celmonster twee keer af met 100 microliter PBS. Voeg vervolgens 200 microliters van FBS gratis kweekmedium toe dat de fluorescerend geverfde gekooide moleculaire lijm bevat in concentraties variërend van 0,1 tot 100 micromolar.Broed de plaat 3 uur in en plaats vervolgens een plaat onder de UV-lichtbron. Stel het celmonster 2 minuten bloot aan UV-licht, waarbij de controlemonsters in het donker worden gehouden. Na UV-blootstelling bij 10 microliter van de Cell Counting Kit-8 reagens aan het kweekmedium en het resulterende celmonster gedurende 2 uur uitbroeden.Lees vervolgens de absorptie van de monsters op 450 nanometer met behulp van een microplate-lezer. Voordat fotostraling HEP3 B-cellen geïncubeerd met fluorescerend geverfde moleculaire lijm vertoont punctate fluorescentie emissie van het interieur een analoge micrograaf waaruit de LysoTracker Red geeft aan dat fluorescerend geverfd gekooide moleculaire lijm werd gelokaliseerd in de endoosomen. Dienovereenkomstig werd de fluorescentieemissie toe te wijzen die aan fluorescerend geverfde gekooide moleculaire lijm toewijsbaar wordt waargenomen buiten de celkern voorafgaand aan UV-straling.Na UV-straling suggereert de fluorescerende dat fluorescerend geverfde gekooide moleculaire lijm niet werd gekiloned en gemigreerd naar het cytoplasma en de celkern. Een dergelijke nucleaire vertaling van de fluorescerende gekooide moleculaire lijm kan selectief worden geïnduceerd door 2-foton in de buurt van infrarood licht. De fluorescerende gekooide moleculaire lijm in niet bestraalde gebieden ontsnapte niet uit de endosomosomen en bleef als punctate fluorescentie.De dendritische gekooide moleculaire lijmtags kunnen ook macromoleculaire gasten zoals quantum dots in de celkern brengen. Deze conjugaten kunnen worden opgenomen in de cellen en na UV-blootstelling gedurende 2 minuten kan de fluorescentie-emissie van de quantum dots worden gezien in de kern. Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van gentherapie om een lage bijwerkingsbehandeling te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Facile en efficiënte voorbereiding van Tri-component Fluorescent Glycopolymers via-VLOT gecontroleerde polymerisatie

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radioactief en kwantificering van cellulaire niveaus van fosfoinositiden door High Performance Liquid Chromatography-gekoppeld Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Onderzoek naar het Georgia (III) Complex van EOB-DTPA en haar<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radioactief gemerkt Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Karakterisering van elektronentransport via levende Biofilms

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

Laser-verwarming en Spectrometrie van de Radiance voor de studie van nucleair materiaal in omstandigheden simuleren een ongeval kerncentrale

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Gecontroleerd Photoredox Ring-Opening polymerisatie van O- Carboxyanhydrides gemedieerd door Ni/Zn complexen

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Bereiken van matige druk in verzegelde vaartuigen met behulp van droogijs als een bron van Solid CO2

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Licht gestuurde moleculaire motoren op oppervlakken voor één moleculaire beeldvorming

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...