Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
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Nous reconnaissons le centre pour l’intégration de NanoBio, l’Université de Tokyo. Ce travail a été soutenu par la subvention pour jeunes scientifiques (B) (26810046) à K.O. et partiellement pris en charge par subvention de recherche spécialement favorisé (25000005) à Mr T.A. Merci les bourses de recherche de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS ) pour les jeunes scientifiques et le programme Leading Graduate Schools (GPLLI).

1. préparation des invités avec cagecolle-R Tags
<ol><li>Préparer la solution de colle-NBD Caged.<ol>
<li>Une synthèse suivant les procédures décrites précédemment20 Cagedcolle-NBD (Figure 1).</li>
		<li>Préparer une solution de colle Caged-NBD (10 mM) dans le sec diméthylsulfoxyde (DMSO). Note : Stocker la solution dans l’obscurité. La solution peut être diluée avec tampons aqueux ou de milieux de cultu...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. 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Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. 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K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Les enquêtes précédentes de lumière déclenchée la translocation des protéines dans le noyau de la cellule ont été obtenus à l’aide de "cage" NLS7,8,9. Comme mentionné précédemment, ces méthodes nécessitent des techniques supplémentaires pour incorporer les NLS-protéines dans le cytoplasme. En revanche, notre balise de colle-R Cagedpermet non seulement translocation nucléaire induite par la photo, m...

Le noyau de la cellule, qui contient des informations génétiques, est l’un des principaux organites comme une cible de délivrance de médicaments subcellulaires, depuis modulation de la réplication des gènes et expression est efficace pour le traitement de diverses maladies dont le cancer et génétique les troubles de1,2,3. Pour nucléaire livraison de médicaments, conjugaison de peptide balises telles que la localisation nucléaire signaux (NLS)4,5,6 a été largement étudiée. Toutefois, afin de réduire les effets secondaires indésirables, contrôle spatio-temporelle de la translocation nucléaire est nécessaire.
Auparavant, lumière déclenchée la translocation des protéines dans le noyau de la cellule a été réalisée à l’aide de "cage" NLS7,8,9. NLS migre dans le noyau de la cellule en se liant aux protéines de transport cytoplasmique6. Dans les méthodes signalées, protéines de commentaires portant "cage" NLS sont directement incorporés dans le cytoplasme par microinjection8 ou exprimées dans les cellules cibles à l’aide d’un code génétique expansion technique9. Par conséquent, une méthode qui peut atteindre l’absorption cellulaire et translocation nucléaire photoinduit est avantageuse pour des applications pratiques.
Ici, nous décrivons la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités dans les cellules vivantes à l’aide de balises dendritiques colle moléculaire en cage (Cagedcolle-R, Figure 1). Les colles moléculaire solubles dans l’eau10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 portant plusieurs pendentifs Gu+ a été développé, qui adhèrent fermement à protéines11,12,13,14,15, 16,17, acides nucléiques18,19,20, de membranes phospholipidiques21et argile nanofeuillets22,23 à la formation de multiples ponts salins entre leurs pendentifs Gu+ et oxyanionic des groupes sur les cibles. Les pendentifs de Gu+ du Cagedcolle-R sont protégés par un groupe de photoclivables anionique, nitroveratryloxycarbonyl substitués butyrate (convBA). Invités le tag Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et séjour dans les endosomes (Figure 2). Dès lors, les groupes de conv BAdu Cagedcolle-R sont détachés pour produire une uncaged moléculaire colle (colle-RUncaged) transportant plusieurs pendentifs Gu+ , qui facilite ensuite la migration de l’invité étiquetée dans le cytoplasme, suivi par le noyau de la cellule (Figure 2). La balise de colle-R Cagedpeut être uncaged par l’exposition aux UV ou deux photons proche infrarouge (NIR) lumière sans phototoxicité grave. Nous démontrons l’administration nucléaire spatio-temporelle controlee de macromoléculaires invités ainsi que des invités de petites molécules avec Cagedtags de colle-R, en utilisant des points quantiques (QDs) et un colorant fluorescent (nitrobenzoxadiazole ; NBD), respectivement, à titre d’exemples.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figure 1 : Structures schématiques Cagedcolle-r Les 9 pendentifs ion (Gu+) de guanidinium de Cagedcolle-R sont protégés par un groupe de nitroveratryloxycarbonyl substitués butyrate (convBA). Les groupes de conv BAsont clivés par irradiation UV ou lumière NIR deux photons. Le noyau central de Cagedcolle-R est fonctionnalisé avec nitrobenzoxadiazole (NBD) ou dibenzocylooctyne (DBCO). Réimprimé avec la permission de référence20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figure 2 : Illustration schématique de la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités conjugué avec une balise de colle-R Caged. L’invité /Cagedconjugué de colle-R est absorbé dans la vie des cellules par endocytose. Dès lors, la balise de colle-R Cagedest uncaged pour produire une balise de colle-R Uncagedqui peut faciliter l’évasion endosomal de l’invité étiquetée. Par la suite, l’invité tagged migre dans le noyau de la cellule. Réimprimé avec la permission de référence20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

Le noyau de la cellule est l’un des principaux organites comme une cible de délivrance de médicaments subcellulaires, depuis la modulation de la réplication des gènes et expression est efficace pour le traitement de diverses maladies. Ici, nous démontrons la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités à l’aide de cage tags colle moléculaire (Cagedcolle-R), dont plusieurs pendentifs ion (Gu+) de guanidinium sont protégés par un groupe de photoclivables anionique (butyrate-substitués nitroveratryloxycarbonyl ; BA CONV). Invités le tag Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et restent dans les endosomes. Toutefois, dès lors, Cagedcolle-R est converti en uncaged moléculaire colle (colle-RUncaged) transportant plusieurs pendentifs Gu+ , qui facilite l’évasion endosomal et translocation nucléaire subséquente des invités. Cette méthode est prometteuse pour site sélectif nucléaire ciblage administration de médicaments, puisque les invités marquées peuvent migrer dans le cytoplasme, suivi par le noyau de la cellule uniquement lorsque photoirradiated. Avec cage Tags de colle-R peuvent livrer macromoléculaires invités tels que boîtes quantiques (QDs) ainsi que de petites molécules hôtes. Avec cage Étiquettes de colle-R peuvent être uncaged avec non seulement les rayons UV, mais aussi les deux photons proche infrarouge (NIR) lumière qui peut pénétrer profondément dans les tissus.

Avant photo-irradiation, cellules Hep3B incubées avec Cagedcolle-NBD exposées émission de fluorescence ponctuée de leur intérieur (λext = 488 nm ; Figures 4 a et 4 C, vert). Une micrographie analogue a été obtenue sur l’excitation 543 nm pour le colorant rouge fluorescente (Figures 4 b et 4C, rouge), indiquant que le Cagedcolle-NBD localisée dans les ...

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Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Ce protocole décrit la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des clients dans l’utilisation des balises de "cage" colle moléculaire des cellules vivantes. Cette méthode est prometteuse pour administration de médicaments sélectifs site nucléaire de ciblage.

Spatio-temporelle contrôlée Translocation nucléaire des invités dans les cellules vivantes à l’aide de colles moléculaires en cage comme des balises Photoactivatable

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de l’administration de médicaments, comme la façon de livrer un médicament à un cellulaire-granulaire spécifique. Le principal avantage de cette technique est que la translocation nucléaire du gaz peut être induite par la lumière. Rina Mogaki et Akio Arisaka, les étudiants diplômés de mon groupe, feront la démonstration de la procédure.Pour commencer à préparer la colle moléculaire de cage liée à point quantique en synthétisant la colle moléculaire en cage liée dibenzocyclooctyne comme décrit plus en détail ailleurs. Préparer une solution de stock de 10 millimolaires de la colle moléculaire en cage liée dibenzocyclooctyne dans le DMSO sec. Préparez ensuite la colle moléculaire en cage liée au point quantique en faisant d’abord des points quantiques fonctionnalisés aseye.Pour ce faire, ajoutez 100 microlitres de 125 micromolaires aseye PEG4 NHS ester dans DMF à 400 microlitres d’une solution DMF contenant 500 nanomolaires de points quantiques qui sont recouverts d’amine cheville fonctionnalisée. Remuer le mélange pendant une heure à température ambiante. Placez la solution résultante dans une membrane de cellulose régénérée et dyz-la pendant 24 heures contre 800 ml de DMF.Ensuite, diluer la solution de stock de colle moléculaire en cage liée dibenzocyclooctyne à 50 micromolaire avec DMF et ajouter 200 microlitres de celui-ci à la solution post-dialyse. Remuer le mélange pendant trois heures à température ambiante. Puis dialyser le mélange résultant pendant 24 heures contre 800 ml de DMF frais à l’aide d’une membrane de cellulose régénérée avec le poids moléculaire coupé de 25000.Après 24 heures diluer la solution résultante à 200 nanomolaires avec DMF. Maintenir le carcinome hepatocellulaire humain HEP3 B-cells dans le milieu essentiel minimal d’Eagle contenant 10%FBS dans des conditions de culture standard. Un jour avant l’expérience semer 5000 cellules B HEP3 dans 200 microlitres de milieu de culture dans chaque puits d’une diapositive en verre à 8 chambelles.Couvrez ensuite la lame et placez-la dans un incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, retirez le milieu de culture et rincez les cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS préchauffé. À chaque puits de la diapositive chambée 8 ajouter 200 microlitres de milieu libre FBS contenant 10 micromolaire d’une colle moléculaire en cage ment colorante fluorescente.Après avoir couver pendant 3 heures enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire deux fois avec 100 microlitres de PBS. Pour visualiser les endosomes ajouter 200 microlitres de médias culturels contenant 100 nanomolaires d’un colorant fluorescent rouge supplémentaire comme LysoTracker Red. Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 20 minutes.Retirez ensuite le milieu de culture et rincez l’échantillon de cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS. Ensuite, retournez les cellules à 200 microlitres du milieu de culture. Pour induire la translocation nucléaire de la colle moléculaire en cage à colorant fluorescent placer les cellules sous une source de lumière xénon de 100 watts équipée d’un filtre bandpass de 365 nanomètres.Exposer les cellules à la lumière UV pendant 2 minutes. Pendant ce temps, gardez l’échantillon de cellule de contrôle sans exposition aux UV dans l’obscurité. Le couvercle des substrats en verre peut être enlevé pour une exposition efficace aux UV mais soyez prudent car une exposition prolongée à la lumière UV peut causer la mort cellulaire.Pour visualiser les noyaux ajouter un microlitre de tache hoeschst au milieu de la culture. Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 10 minutes. Placez ensuite l’échantillon sur la scène d’un microscope à balayage laser confocal.Enregistrez les micrographes de la colle moléculaire en cage teint fluorescente, du rouge LysoTracker et de la tache nucléaire. Comme indiqué précédemment, les graines 5000 humains hepatocellulaires carcinome HEP3 B-cellules dans chaque puits d’une diapositive de chambre 8 puits et la culture dans des conditions standard pendant 24 heures. Fournir aux échantillons de cellules 200 microlitres de milieu de culture libre FBS contenant la colle moléculaire en cage ment colorante fluorescente.Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 3 heures. Retirez ensuite le milieu de culture et rincez l’échantillon de cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS. Retourner les cellules à 200 microlitres de milieu de culture.Ensuite, sous réserve de microscopie à balayage laser confoccal échantillon et enregistrer les micrographes tels que décrits dans le protocole texte d’accompagnement. Comme précédemment montré graine 5000 humains hepatocellulaires carcinome HEP3 B-cellules dans chaque puits d’une diapositive de chambre 8 puits et la culture dans des conditions standard pendant 24 heures. Fournir aux échantillons cellulaires 200 microlitres de milieu de culture libre FBS contenant 10 nanomolaires de la colle moléculaire en cage liée au point quantique.Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 3 heures. Retirez ensuite le milieu et rincez l’échantillon de cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS. Après le rinçage des cellules les retourner à 200 microlitres de milieu de culture.Placez ensuite la plaque sous une source lumineuse de xénon de 100 watts équipée d’un filtre bandpass de 365 nanomètres. Exposez l’échantillon cellulaire à la lumière UV pendant 2 minutes en gardant les échantillons de contrôle dans l’obscurité. Pour visualiser les noyaux ajouter 1 microlitre de tache hoechst au milieu de la culture.Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 10 minutes. Puis imagez les cellules à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal. Ensemencer le carcinome hepatocellulaire humain HEP3 B-cells la veille de l’expérience à 5000 cellules par puits dans une plaque de culture de puits 96.Couvrez ensuite les cellules de 200 microlitres de médias culturels, puis placez la plaque dans un incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, retirez le milieu de culture et rincez l’échantillon de cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de culture libre FBS contenant la colle moléculaire en cage à colorant fluorescent à des concentrations allant de 0,1 à 100 micromolaires.Incuber la plaque pendant 3 heures, puis placer une plaque sous la source de lumière UV. Exposez l’échantillon cellulaire à la lumière UV pendant 2 minutes en gardant les échantillons de contrôle dans l’obscurité. Suite à l’exposition aux UV à 10 microlitres du reagent cell counting kit-8 au milieu de culture et incubation de l’échantillon cellulaire résultant pendant 2 heures.Lisez ensuite l’absorption des échantillons à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaque. Avant le rayonnement photo HEP3 B-cellules incubées avec de la colle moléculaire en cage teint fluorescente montre l’émission de fluorescence punctate de l’intérieur un micrographe analogue montrant le rouge LysoTracker indique que la colle moléculaire en cage teint fluorescentement a été localisée dans les endomètres. Par conséquent, l’émission de fluorescence attribuable à la colle moléculaire en cage ment colorée fluorescente a été observée à l’extérieur du noyau cellulaire avant le rayonnement UV.Après le rayonnement UV, le fluorescent suggère que la colle moléculaire en cage à colorant fluorescent a été indemne et a migré dans le cytoplasme et le noyau cellulaire. Une telle traduction nucléaire de la colle moléculaire en cage ment colorante fluorescente peut être induite site sélectivement par la lumière infrarouge proche de 2 photons. La colle moléculaire en cage teint fluorescentement dans les secteurs non irradiés n’a pas échappé aux endosomes et est restée comme fluorescence punctate.Les étiquettes de colle moléculaires en cage dendritiques peuvent également fournir des invités macromoléculaires tels que des points quantiques dans le noyau cellulaire. Ces conjugués peuvent être pris dans les cellules et après exposition aux UV pendant 2 minutes, l’émission de fluorescence des points quantiques peut être observée dans le noyau. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la thérapie génique pour explorer le traitement à faible effet secondaire.

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