Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Wir anerkennen das Zentrum für NanoBio Integration, der University of Tokyo. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (26810046), K.O. und teilweise unterstützt von Beihilfe für speziell gefördert Forschung (25000005), t.a. r.m. Dank der Research Fellowships der Japan Society für die Förderung der Wissenschaft (JSPS ) für junge Wissenschaftler und das Programm für die führenden Graduate Schools (GPLLI).

1. Vorbereitung der Gäste mit KäfigKleber-R Stichwörter
<ol><li>CagedKleber-NBD Lösung ansetzen.<ol>
<li>CagedKleber-NBD (Abbildung 1) nach dem Verfahren beschriebenen20zu synthetisieren.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Stammlösung CagedKleber-NBD (10 mM) in trockenen Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Hinweis: Bewahren Sie die Stammlösung in Dunkelheit. Die Lösung kann mit wässrigen Puffer oder Zellkulturmedien nach Gebrau...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. 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K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Vorausgegangenen Untersuchungen Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern sind mit Käfig NLS7,8,9erreicht worden. Wie bereits erwähnt, erfordern diese Methoden zusätzliche Techniken, die NLS-markierten Proteine in das Zytoplasma zu integrieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht unser Caged-Kleber-R-Tag nicht nur Foto-induzierte nuklearen Translokation, sondern auch zelluläre Aufnahme der Gäste. Die...

Der Zellkern, der genetischen Information trägt, ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs und genetische 1,2,3-Störungen. Für nukleare Lieferung von Medikamenten Konjugation von Peptid Stichwörter wie nukleare Lokalisierung Signale (NLS)4,5,6 allgemein untersucht worden ist. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren, ist jedoch räumlich-zeitliche Kontrolle der nuklearen Translokation notwendig.
Zuvor wurde Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern mit Käfig NLS7,8,9erreicht. NLS wandert in den Zellkern durch die Bindung an zytoplasmatischen Transport Proteine6. In den gemeldeten Methoden sind Gast Proteine mit Käfig NLS direkt in das Zytoplasma durch Mikroinjektion8 integriert oder in den Zielzellen mit einem genetischen Code Ausbau Technik9ausgedrückt. Daher ist eine Methode, die zelluläre Aufnahme und Foto-induzierte nuklearen Translokation erreichen kann vorteilhaft für praktische Anwendungen.
Hier beschreiben wir Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit dendritischen eingesperrte molekularen Klebstoff (CagedKleber-R, Abb. 1) Tags. Wasserlösliche Leime molekulare10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 mit mehreren Gu+ -Anhänger sind bereits entwickelt worden, die halten uns fest an Proteine11,12,13,14,15, 16,17, Nukleinsäuren18,19,20, Phospholipid-Membranen-21und Ton Nanosheets22,23 durch die Bildung von zahlreichen Salz Brücken zwischen ihren Gu+ -Anhänger und Oxyanionic Gruppen auf die Ziele. Die Gu+ -Anhänger CagedKleber-r sind durch einen anionischen Photocleavable Gruppe, Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (BASVOC) geschützt. Gäste, die mit dem Stichwort CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und Aufenthalt in Endosomen (Abbildung 2). Auf Photoirradiation sind die BASVOC Gruppen von CagedKleber-R freistehend ein uncaged molekularen Klebstoff (UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu+ Anhänger nachzugeben, dann die Migration von tagged Gast erleichtert in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern (Abbildung 2). Caged-Kleber-R-Tag kann durch die Einwirkung von UV- oder zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht ohne schwere Phototoxizität uncaged. Wir demonstrieren die raumzeitlich kontrollierte nukleare Lieferung von makromolekularen Gäste sowie kleine Molekül Gäste mit CagedKleber-R Tags Quantenpunkte (QDs) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Nitrobenzoxadiazole; NBD), bzw. als Beispiele.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Strukturen der CagedKleber-R. Die 9 Guanidinium Ion (Gu+) Anhänger CagedKleber-r sind von einer Gruppe von Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (BASVOC) geschützt. Die BA-SVOC-Gruppen sind durch Bestrahlung mit UV- oder zwei-Photon NIR Licht gespalten. Die fokale Kern CagedKleber-R ist mit Nitrobenzoxadiazole (NBD) oder Dibenzocylooctyne (DBCO) funktionalisiert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Licht-ausgelösten nuklearen Translokation Gäste konjugiert mit einem CagedKleber-R Tag. Der Gast /CagedKleber-R Konjugat berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose. Auf Photoirradiation ist das CagedKleber-R Tag uncaged die Bezeichnung für einen Uncaged-Kleber-R, weichen, der Endosomal Entweichen von der tagged Gast erleichtern kann. Anschließend wandert der tagged Gast in den Zellkern. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

Der Zellkern ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Hier zeigen wir, dass Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste mit molekularen Klebstoff (CagedKleber-R) Tags, sperrte deren mehrere Guanidinium Ion (Gu+) Anhänger von einer anionischen Photocleavable Gruppe (Butyrat-substituierten geschützt sind Nitroveratryloxycarbonyl; BA SVOC). Gäste, die mit dem Stichwort CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und bleiben in Endosomen. Allerdings wird auf Photoirradiation, CagedKleber-R in uncaged molekularen Klebstoff (UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu+ Anhänger umgewandelt, die Endosomal entweichen und anschließenden nuklearen Translokation der Gäste erleichtert. Diese Methode ist vielversprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery, da tagged Gäste in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern übergehen können nur dann, wenn Photoirradiated. Im Käfig Kleber-R Tags können makromolekularen Gäste wie Quantenpunkte (QDs) sowie kleine Molekül Gäste liefern. Im Käfig Kleber-R Tags sind uncaged mit nicht nur UV-Licht, sondern auch zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht, das tief in das Gewebe eindringen kann.

Vor Photoirradiation, Hep3B Zellen inkubiert mit CagedKleber-NBD ausgestellt punctata Fluoreszenzemission von ihrem inneren (λExt = 488 nm; Abbildungen 4A und 4 C, grün). Eine analoge Schliffbild erhielt nach Anregung bei 543 nm für rot fluoreszierenden Farbstoff (Zahlen 4 b und 4 C, rot), darauf hinweist, dass CagedKleber-NBD in den Endosomen lokalisiert. Dem...

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Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Dieses Protokoll beschreibt Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekularen Klebstoff-Tags. Diese Methode ist viel versprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery.

Raumzeitlich kontrollierte nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekulare Leime als Photoactivatable Tags

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfrage im Bereich der Medikamentenabgabe zu beantworten, wie ein Medikament an eine bestimmte zelluläre Granular liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die nukleare Translokation von Gas durch Licht induziert werden kann. Demonstrieren das Verfahren werden Rina Mogaki und Akio Arisaka die Absolventen meiner Gruppe sein.Um mit der Vorbereitung des Quantenpunkt-verknüpften Käfig-Molekularklebers zu beginnen, indem man den Käfigmolekülkleber mit Dibenzocyclooctyne synthetisiert, wie an anderer Stelle ausführlicher beschrieben. Bereiten Sie eine 10 Millimolar-Stammlösung des Käfigmolekularklebers verbunden Dibenzocyclooctyne in trockenen DMSO. Dann bereiten Sie den Quantenpunkt verknüpftKäfig molekularen Kleber durch die erste Herstellung aseye funktionalisierten Quantenpunkte.Um dies zu erreichen, fügen Sie 100 Mikroliter von 125 Mikromolaren-Aseye PEG4 NHS Ester in DMF zu 400 Mikroliter einer DMF-Lösung mit 500 Nanomolar Quantenpunkten hinzu, die mit am in Amin funktionalisierten Peg beschichtet sind. Rühren Sie die Mischung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die resultierende Lösung in eine regenerierte Zellulosemembran geben und 24 Stunden gegen 800 ml DMF dialysieren.Als nächstes verdünnen Sie die Stammlösung von Käfig-Molekularkleber verbunden Dibenzocyclooctyne zu 50 Mikromolar mit DMF und fügen Sie 200 Mikroliter davon auf die Postdialyselösung. Rühren Sie die Mischung für drei Stunden bei Raumtemperatur. Dialyse die resultierende Mischung für 24 Stunden gegen 800 ml frisches DMF mit einer regenerierten Zellulosemembran mit dem Molekulargewicht abgeschnitten von 25000.Nach 24 Stunden verdünnen Sie die resultierende Lösung auf 200 Nanomolar mit DMF. Aufrechterhaltung des humanen hepatozellulären Karzinoms HEP3 B-Zellen in Eagles minimalem essentiellem Medium, das 10%FBS unter Standardkulturbedingungen enthält. Einen Tag vor dem Experiment säen 5000 HEP3 B-Zellen in 200 Mikroliter Kulturmedium in jeden Brunnen einer 8 Kammerglasrutsche.Dann bedecken Sie die Rutsche und legen Sie sie für 24 Stunden in einen Inkubator. Am nächsten Tag entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen zweimal mit 100 Mikrolitern vorgewärmter PBS ab. Zu jedem Brunnen des 8 kammerigen Dias 200 Mikroliter FBS freies Medium mit 10 Mikromolaren eines fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülklebers hinzufügen.Nach der Inkubation für 3 Stunden entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS. Zur Visualisierung der Endosomen fügen Sie 200 Mikroliter Kulturmedien hinzu, die 100 Nanomolar eines zusätzlichen roten Fluoreszenzfarbstoffs wie LysoTracker Red enthalten. Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe 20 Minuten lang.Entfernen Sie dann das Kulturmedium und spülen Sie die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS. Danach kehren die Zellen auf 200 Mikroliter des Kulturmediums zurück. Um die kernästhetische Translokation des fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülklebers zu induzieren, platzieren Sie die Zellen unter einer 100 Watt Xenon-Lichtquelle, die mit einem 365-Nanometer-Bandpassfilter ausgestattet ist.Setzen Sie die Zellen 2 Minuten lang UV-Licht aus. Während dieser Zeit halten Sie die Kontrollzellenprobe ohne UV-Exposition im Dunkeln. Der Deckel der Glassubstrate kann für eine effiziente UV-Exposition abgenommen werden, aber seien Sie vorsichtig, da eine längere Exposition gegenüber UV-Licht zum Zelltod führen kann.Um die Kerne zu visualisieren, fügen Sie dem Kulturmedium einen Mikroliter Hoeschst-Färbung hinzu. Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe 10 Minuten lang. Legen Sie die Probe dann auf die Bühne eines konfokalen Laserscanmikroskops.Zeichnen Sie die Mikrographen für den fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülkleber, den LysoTracker Red und den nuklearen Fleck auf. Wie bereits gezeigt, samen 5000 humanes hepatozelluläres Karzinom HEP3 B-Zellen in jedem Brunnen einer 8-Well-Kammer-Rutsche und Kultur unter Standardbedingungen für 24 Stunden. Liefern Sie die Zellproben mit 200 Mikrolitern FBS-freiem Kulturmedium, das den fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülkleber enthält.Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe für 3 Stunden. Entfernen Sie dann das Kulturmedium und spülen Sie die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS. Bringen Sie die Zellen auf 200 Mikroliter Kulturmedium zurück.Dann unterziehen Sie probe konfokale Laserscanning Mikroskopie und erfassen Sie die Mikrographen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Wie zuvor gezeigt, Saat 5000 humanhepatozelluläre Karzinom HEP3 B-Zellen in jedem Brunnen einer 8 Brunnenkammer Rutsche und Kultur unter Standardbedingungen für 24 Stunden. Liefern Sie die Zellproben mit 200 Mikrolitern FBS-freiem Kulturmedium, das 10 Nanomolar des Quantenpunkt-verknüpften Käfig-Molekularklebers enthält.Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe für 3 Stunden. Entfernen Sie dann das Medium und spülen Sie die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS. Nach dem Spülen der Zellen kehren sie auf 200 Mikroliter Kulturmedium zurück.Legen Sie die Platte dann unter eine 100 Watt Xenon-Lichtquelle, die mit einem 365 Nanometer Bandpassfilter ausgestattet ist. Setzen Sie die Zellprobe 2 Minuten lang UV-Licht aus, um die Kontrollproben im Dunkeln zu halten. Um die Kerne zu visualisieren, fügen Sie 1 Mikroliter Hoechst Fleck zum Kulturmedium hinzu.Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe 10 Minuten lang. Dann stellen Sie die Zellen mit einem konfokalen Laserscanmikroskop ab. Samen Sie das humane hepatozelluläre Karzinom HEP3 B-Zellen am Tag vor dem Experiment mit 5000 Zellen pro Brunnen in eine 96 Brunnenkulturplatte.Dann bedecken Sie die Zellen mit 200 Mikroliter Kulturmedien und legen Sie die Platte dann 24 Stunden lang in einen Inkubator. Am nächsten Tag das Kulturmedium entfernen und die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS abspülen. Dann fügen Sie 200 Mikroliter FBS freies Kulturmedium mit dem fluoreszierend gefärbten Käfig molekularen Kleber in Konzentrationen von 0,1 bis 100 Mikromolar.Inkubieren Sie die Platte für 3 Stunden und legen Sie dann eine Platte unter die UV-Lichtquelle. Setzen Sie die Zellprobe 2 Minuten lang UV-Licht aus, um die Kontrollproben im Dunkeln zu halten. Nach UV-Exposition bei 10 Mikrolitern des Zellzähl-Kits-8-Reagenzes an das Kulturmedium und inkubieren Sie die resultierende Zellprobe für 2 Stunden.Lesen Sie dann die Absorption der Proben bei 450 Nanometern mit einem Mikroplattenleser. Vor der Photostrahlung zeigt HEP3 B-Zellen, die mit fluoreszierend gefärbtem Käfigmolekülkleber inkubiert werden, eine punktuelle Fluoreszenzemission aus dem Inneren einer analogen Mikrografie, die den LysoTracker Red zeigt, dass fluoreszierend gefärbter Käfigmolekularkleber in den Endosomen lokalisiert wurde. Dementsprechend wurde die fluoreszierend gefärbte Käfigmolekülkleber außerhalb des Zellkerns vor der UV-Strahlung beobachtet.Nach UV-Strahlung deutet der Fluoreszenz darauf hin, dass fluoreszierend gefärbter Käfigmolekülkleber nicht gekeltert wurde und in das Zytoplasma und den Zellkern migriert wurde. Eine solche kerntechnische Übersetzung des fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülklebers kann standortselektiv durch 2-Photonen-Nahinfrarotlicht induziert werden. Der fluoreszierend gefärbte Käfigmolekülkleber in nicht bestrahlten Bereichen entweichte nicht aus den Endosomen und blieb als Punktelfluoreszenz erhalten.Die dendritischen Käfig-Molekularklebe-Tags können auch makromolekulare Gäste wie Quantenpunkte in den Zellkern liefern. Diese Konjugate können in die Zellen aufgenommen werden und nach UV-Exposition für 2 Minuten kann die Fluoreszenzemission der Quantenpunkte innerhalb des Zellkerns gesehen werden. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gentherapie, um die Behandlung mit niedrigen Nebenwirkungen zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Leichte und effiziente Herstellung von Tri-Komponente Fluorescent Glycopolymere über RAFT-kontrollierte Polymerisation

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Forschung

Chemie

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

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Untersuchungen über die Ga (III) -Komplexes von EOB-DTPA and Its<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radiolabeled Analog

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Charakterisierung von Elektronentransport durch lebende Biofilme

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

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Laser-Heizung und Ausstrahlung Spektrometrie für die Untersuchung von Kernmaterial in Bedingungen simulieren einen Atomkraftwerksunfall

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

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In Situ Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

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Kontrollierte Photoredox ringöffnende Polymerisation von O- Carboxyanhydrides vermittelt durch Ni/Zn-komplexe

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

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Mäßiger Druck in verschlossenen Gefäßen, die Verwendung von Trockeneis als Solid CO2 zu erreichen

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Lichtgetriebenen molekularen Motoren auf Oberflächen für einzelne molekulare Bildgebung

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...