Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

אנו להכיר את המרכז לשילוב NanoBio, באוניברסיטת טוקיו. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדענים (B) (26810046) כדי לעלף ו חלקית נתמך על ידי מענק הסיוע למחקר מיוחד קידום (25000005) חומרי גלם עוזר ההוראה תודה מלגות של יפן אגודת המחקר עבור קידום המדע (JSPS ) עבור מדענים צעירים ואת התוכנית עבור המובילים בוגרת בתי ספר (GPLLI).

1. הכנת לאורחים עם דבק-R בכלובתגי
<ol><li>להכין פתרון דבק-להארכה כלואה.<ol>
<li>לסנתז כלואהדבק-להארכה (איור 1) בעקבות הליכים שתואר לעיל20.</li>
		<li>להכין פתרון מניות של כלואהדבק-להארכה (10 מ מ) ביבש דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). הערה: אחסן את ה...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences.">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry &amp; Biology. 9, 943-948 (2002).</li><li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus.">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals.">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li><li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Go+in!+Go+out!+Inducible+control+of+nuclear+localization.">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium-based+&amp;#34;molecular+glues&amp;#34;+for+modulation+of+biomolecular+functions.">Guanidinium-based &amp;#34;molecular glues&amp;#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li><li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer:+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization.">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li><li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+&amp;#34;Molecular+Glue&amp;#34;+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin.">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &amp;#34;Molecular Glue&amp;#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue:+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids.">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li><li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies.">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+glues+for+manipulating+enzymes:+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues.">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li><li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes.">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Photoswitch:+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions.">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li><li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

חקירות קודמות מבוססות אור טרנסלוקציה של חלבונים לתוך גרעין התא הושגו באמצעות בכלובים NLS7,8,9. כאמור, שיטות אלה דורשים שיטות נוספות כדי לשלב את החלבונים מתויג NLS בתוך הציטופלסמה. לעומת זאת, התגים דבק-R שלנו כלואהמאפשרת לא רק תמונה-induced ר?...

גרעין התא, אשר נושאת מידע גנטי, הוא אחד organelles החשובים ביותר כמטרה סמים subcellular-מסירה, מאז אפנון של שכפול גנטי, הביטוי הוא יעיל לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן ותעשיה והפרעות1,2,3. למסירה הגרעין של סמים, ההטיה של פפטיד תיוג כגון גרעיני לוקליזציה אותות (שקל)4,5,6 נחקר באופן נרחב. אולם, על מנת להפחית תופעות לוואי לא רצויות, ייתכן השליטה רוברטסונית גרעיני הוא הכרחי.
בעבר, מבוססות אור טרנסלוקציה של חלבונים לתוך גרעין התא הושגה באמצעות בכלובים NLS7,8,9. NLS נודד אל תוך גרעין התא על-ידי איגוד התחבורה cytoplasmic חלבונים6. בשיטות שדווחה, חלבונים חוות הנושאת NLS בכלובים ישירות שולבו הציטופלסמה מאת microinjection8 או לידי ביטוי תאי היעד באמצעות טכניקה הרחבה9הקוד הגנטי. לכן, שיטה להשגת ספיגת הסלולר והן צילום-induced רוברטסונית גרעינית היא יתרון עבור יישומים מעשיים.
במסמך זה, אנו מתארים מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים בתאים חיים באמצעות תגי דנדריטים דבק מולקולרית בכלובים (כלואהדבק-R, איור 1). דבקים מולקולרית מסיסים במים10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 הנושאת תליונים גו+ מרובים בעבר פותחו, אשר באופן הדוק לדבוק חלבונים11,12,13,14,15, 16,17, חומצות גרעין18,19,20, פוספוליפיד ממברנות21, ו קליי nanosheets22,23 דרך היווצרות גשרים מלח מרובים בין תליונים גו+ oxyanionic קבוצות על המטרות. ג. א.+ תליונים של כלואהדבק-R מוגנים על-ידי קבוצת anionic photocleavable, nitroveratryloxycarbonyl butyrate שהוחלפו (BANVOC). האורחים המתויגת כלואהדבק-R נלקחים לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה והישאר ב- endosomes (איור 2). על photoirradiation, קבוצות NVOC BA כלואהדבק-R מנותקים להניב תשואה של שברחה מכלוב מולקולרית דבק (Uncagedדבק-R) תליונים גו+ מרובים, נושאת המאפשרת ואז ההעברה של האורח מתויג לתוך הציטופלסמה ואחריו גרעין התא (איור 2). התג דבק-R כלואהניתן שברחה מכלוב על ידי חשיפה UV או שני הפוטונים-סגול (ניר) אור בלי phototoxicity רצינית. נדגים את המשלוח גרעיני מבוקר spatiotemporally של האורחים macromolecular, כמו גם מולקולה קטנה לאורחים תגים דבק-R כלואה, באמצעות נקודות קוונטיות (QDs) של הפלורסנט (nitrobenzoxadiazole; להארכה), בהתאמה, כדוגמאות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> איור 1: מבנה סכמטי של כלואהדבק-R. תליונים יון (ג. א.+) guanidinium 9 של כלואהדבק-R מוגן על ידי קבוצת nitroveratryloxycarbonyl butyrate שהוחלפו (BANVOC). הקבוצות NVOC BAהם ביקע על ידי הקרנה UV או אור ניר שני הפוטונים. ליבת מוקד כלואהדבק-R הוא functionalized עם nitrobenzoxadiazole (להארכה) או dibenzocylooctyne (DBCO). הודפס מחדש באישור הפניה20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> איור 2: איור סכמטי של מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים מצומדת עם תג דבק-R כלואה. האורח /כלואהדבק-R המספר המשלים הוא נלקח לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה. בעת photoirradiation, התג דבק-R כלואההינם שברחה מכלוב להניב תג דבק-R Uncaged, דבר היכול להקל על הבריחה endosomal של האורח מתויגות. לאחר מכן, האורח מתויג נודד אל תוך גרעין התא. הודפס מחדש באישור הפניה20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

גרעין התא הוא אחד organelles החשובים ביותר כמטרה סמים subcellular-מסירה, מאז אפנון של שכפול גנטי, הביטוי הוא יעיל לטיפול במחלות שונות. . הנה, נדגים מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים שימוש בכלוב תגיות דבק מולקולרית (בכלובדבק-R), תליונים יון (ג. א.+) מרובות של מי guanidinium מוגנים על-ידי קבוצת anionic photocleavable (butyrate-שהוחלפו nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). האורחים המתויגת כלואהדבק-R נלקחים לתוך החיים תאים באמצעות אנדוציטוזה וישארו endosomes. עם זאת, בעת photoirradiation, כלואהדבק-R מומר שברחה מכלוב מולקולרית דבק (Uncagedדבק-R) תליונים גו+ מרובים, נושאת המאפשרת את הבריחה endosomal ואת רוברטסונית גרעיני עוקבות של האורחים. בשיטה זו הוא מבטיח למסירה אתר סלקטיבית הגרעיני פילוח סמים, מאז מתויג האורחים יכולים להעביר לתוך הציטופלסמה ואחריו גרעין התא רק כאשר photoirradiated. בכלוב דבק-R תגיות יכול לספק לאורחים macromolecular כגון נקודות קוונטיות (QDs) כמו גם האורחים מולקולה קטנה. בכלוב תגיות דבק-R ניתן שברחה מכלוב עם לא רק אור UV, אלא גם שני הפוטונים-סגול (ניר) אור, אשר יכול לחדור עמוק לתוך רקמות.

לפני photoirradiation, תאים Hep3B מודגרות עם דבק כלואה-להארכה הציג פליטת קרינה פלואורסצנטית punctate מן הפנים שלהם (λext = 488 ננומטר; דמויות 4A ו- 4 Cירוק). Micrograph מקביל הושג על עירור-543 nm לצבע אדום-פלורסנט (דמויות 4B ו- 4 C, אדום), המצי...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

פרוטוקול זה מתאר מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים בתאים חיים באמצעות תגי דבק מולקולרית בכלובים. שיטה זו היא מבטיחה עבור משלוח סמים פילוח גרעיני האתר סלקטיבית.

Spatiotemporally מבוקר גרעיני טרנסלוקציה של האורחים בתאים חיים באמצעות דבקים מולקולרית בכלובים כמו Photoactivatable תגיות

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום אספקת תרופות, כגון כיצד לספק תרופה לתרופה ספציפית תאית-פרטנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי טרנסלוקציה גרעינית של גז יכול להיות המושרה על ידי אור. הפגנה של ההליך תהיה רינה מוגאקי ואקיו אריסאקה, הסטודנטים לתואר שני מהקבוצה שלי.כדי להתחיל להכין את הנקודה הקוונטית מקושר דבק מולקולרי כלוב על ידי סינתזה דבק מולקולרי בכלוב מקושר dibenzocyclooctyne כמתואר בפירוט רב יותר במקום אחר. הכן פתרון מלאי 10 מילימולרית של דבק מולקולרי בכלוב מקושר dibenzocyclooctyne ב DMSO יבש. לאחר מכן הכינו את הנקודה הקוונטית המקושרת לדבק מולקולרי בכלוב על ידי יצירת נקודות קוונטיות פונקציונליות של aseye.כדי להשיג זאת להוסיף 100 microliters של 125 micromolar aseye PEG4 NHS אסתר ב DMF כדי 400 microliters של פתרון DMF המכיל 500 nanomolar של נקודות קוונטיות מצופים אמין פונקציונלי יתד. מערבבים את התערובת במשך שעה בטמפרטורת החדר. מניחים את הפתרון וכתוצאה מכך קרום תאית מחדש דיאליזה זה במשך 24 שעות נגד 800 מ"ל של DMF.לאחר מכן לדלל את פתרון המלאי של דבק מולקולרי בכלוב מקושר dibenzocyclooctyne ל 50 micromolar עם DMF ולהוסיף 200 microliters של אותו לפתרון דיאליזה פוסט. מערבבים את התערובת במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. ואז להנייד את התערובת וכתוצאה מכך במשך 24 שעות נגד 800 מ"ל של DMF טרי באמצעות קרום תאית מחדש עם המשקל המולקולרי מנותק של 25000.לאחר 24 שעות לדלל את הפתרון וכתוצאה מכך 200 nanomolar עם DMF. לשמור על קרצינומה hepatocellular אנושי HEP3 B-תאים במדיום החיוני המינימלי של הנשר המכיל 10% FBS בתנאים תרבותיים סטנדרטיים. יום אחד לפני הניסוי זרע 5000 HEP3 B-תאים ב 200 microliters של תרבות בינוני לתוך כל באר של שקופית זכוכית 8 תאים.לאחר מכן לכסות את השקופית ולה למקם אותו לתוך אינקובטור במשך 24 שעות. למחרת להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את התאים פעמיים עם 100 microliters של PBS מחומם מראש. לכל באר של שקופית 8 תאים להוסיף 200 microliters של המדיום החופשי FBS המכיל 10 micromolar של דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי.לאחר הדגירה במשך 3 שעות להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. כדי לדמיין את אנדוזומים להוסיף 200 microliters של מדיה תרבות המכיל 100 nanomolar של צבע פלואורסצנטי אדום נוסף כגון LysoTracker אדום. דגירה מדגם התא וכתוצאה מכך במשך 20 דקות.לאחר מכן להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. לאחר מכן להחזיר את התאים 200 microliters של מדיום התרבות. כדי לגרום טרנסלוקציה גרעינית של דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי למקם את התאים תחת מקור אור קסנון 100 וואט מצויד מסנן 365 ננומטר bandpass.לחשוף את התאים לאור UV במשך 2 דקות. במהלך תקופה זו לשמור על מדגם תא הבקרה ללא חשיפה UV בחושך. המכסה של מצעי הזכוכית ניתן להוריד לחשיפה יעילה UV עם זאת לנקוט זהירות כמו חשיפה ממושכת לאור UV עלול לגרום למוות של תאים.כדי לדמיין את הגרעינים להוסיף מיקרוליטר אחד של כתם Hoeschst למדיום התרבות. דגירה מדגם התא וכתוצאה מכך במשך 10 דקות. לאחר מכן מקם את הדגימה על הבמה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל.תקליטו את המיקרוגרפים של הדבק המולקולרי הצפון-כלוא צבוע בצורה פלואורסצנתית, את האדום של LysoTracker ואת הכתם הגרעיני. כפי שהוצג בעבר, זרע 5000 קרצינומה hepatocellular אנושי HEP3 B-תאים לתוך כל באר של 8 שקופית תא היטב ותרבות בתנאים סטנדרטיים במשך 24 שעות. לספק את דגימות התא עם 200 microliters של מדיום תרבות חינם FBS המכיל את דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי.הדגירה את דגימת התא וכתוצאה מכך במשך 3 שעות. לאחר מכן להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. להחזיר את התאים 200 microliters של מדיום תרבות.לאחר מכן בכפוף לדגום מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקל ולתקליט את המיקרוגרפים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. כפי שהוצג בעבר זרע 5000 קרצינומה hepatocellular אנושי HEP3 B-תאים לתוך כל באר של 8 שקופית תא היטב ותרבות בתנאים סטנדרטיים במשך 24 שעות. לספק את דגימות התא עם 200 microliters של אמצעי תרבות חופשית FBS המכיל 10 nanomolar של נקודה קוונטית מקושר דבק מולקולרי בכלוב.הדגירה את דגימת התא וכתוצאה מכך במשך 3 שעות. לאחר מכן להסיר את המדיום ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. לאחר שטיפה התאים להחזיר אותם 200 microliters של מדיום תרבות.לאחר מכן מניחים את הצלחת תחת מקור אור קסנון של 100 וואט המצויד במסנן בנדפס 365 ננומטר. חשוף את דגימת התא לאור UV במשך 2 דקות שמירה על דגימות הבקרה בחושך. כדי לדמיין את הגרעינים להוסיף 1 microliter של כתם Hoechst למדיום התרבות.דגירה מדגם התא וכתוצאה מכך במשך 10 דקות. לאחר מכן תדמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל. זרע את קרצינומה hepatocellular האנושי HEP3 B-תאים יום לפני הניסוי ב 5000 תאים לתוך צלחת תרבות 96 היטב.לאחר מכן לכסות את התאים עם 200 microliters של מדיה תרבות ולאחר מכן למקם את הצלחת באינקובטור במשך 24 שעות. למחרת להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבות חינם FBS המכיל את הדבק המולקולרי הכלוא שננטב בפלורסנט בריכוזים הנעים בין 0.1 ל -100 מיקרומולרים.דגירה את הצלחת במשך 3 שעות ולאחר מכן מניחים צלחת תחת מקור אור UV. חשוף את דגימת התא לאור UV במשך 2 דקות שמירה על דגימות הבקרה בחושך. בעקבות חשיפה UV ב 10 microliters של ערכת ספירת תאים-8 reagent למדיום התרבות דגירה מדגם התא וכתוצאה מכך במשך 2 שעות.לאחר מכן לקרוא את ספיגת הדגימות ב 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלסטיק. לפני קרינת צילום HEP3 B-תאים דגירה עם תערוכות דבק מולקולרי צבועות פלואורסצנטיות תערוכות punctate פליטת פלואורסצנטיות מן הפנים מיקרוגרף אנלוגי מראה את אדום LysoTracker מציין כי דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי היה מקומי אנדוזומים. בהתאם לכך, פליטת הפלואורסצנטיות הניתנת לדבק המולקולרי הצרוב בפלורסנט נצפתה מחוץ לגרעין התא לפני קרינת UV.לאחר קרינת UV הפלואורסצנט מרמז כי דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי היה uncaged והיגר לתוך הציטופלסמה ואת גרעין התא. תרגום גרעיני כזה של דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי יכול להיות המושרה באתר באופן סלקטיבי על ידי 2-פוטון ליד אור אינפרא אדום. הדבק המולקולרי הנוהורסנטי באזורים שאינם מוקרנים לא ברח מה אנדוזומים ונשאר פלואורסצנטיות מנוקבת.תגי הדבק המולקולריים הנדריגטיים בכלוב יכולים גם לספק לאורחים מקרומולקולריים כגון נקודות קוונטיות לתוך גרעין התא. אלה conjugates ניתן לקחת לתוך התאים ולאחר חשיפה UV במשך 2 דקות פליטת פלואורסצנטיות של נקודות קוונטיות ניתן לראות בתוך הגרעין. לאחר התפתחות זו טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הריפוי הגנטי לחקור טיפול בתופת לוואי נמוכה.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

הכנה קלילה ויעילה של Glycopolymers פלורסנט Tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

חקירות על קומפלקס Ga (III) של EOB-DTPA ו שלה<sup&gt; 68</sup&gt; Ga radiolabeled Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

אפיון תחבורה אלקטרון דרך חיים Biofilms

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

לייזר-חימום, ספקטרומטר Radiance לחקר חומרים גרעיניים בתנאים הדמיית תאונת הגרעין

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

נשלט Photoredox הפילמור טבעת-פתיחה של O- Carboxyanhydrides מתווכת על-ידי Ni/Zn מתחמי

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

להשגת לחצים מתונה בכלי אטום באמצעות קרח יבש כמקור2 CO מוצק

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

מונחי-אור המנועים המולקולריים על משטחים עבור יחיד הדמיה מולקולרית

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...