Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Riconosciamo il centro per l'integrazione di NanoBio, l'Università di Tokyo. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzione per giovani scienziati (B) (26810046) per K.O. e parzialmente supportato da sovvenzione per ricerca promosso appositamente (25000005) con T.A. R.M. grazie Research Fellowships di Japan Society per la promozione della scienza (JSPS ) per giovani ricercatori e il programma per scuole laureate leader (GPLLI).

1. preparazione degli ospiti con gabbiacolla-R Tag
<ol><li>Preparare la soluzione di colla-NBD Caged.<ol>
<li>Sintetizzare Cagedcolla-NBD (Figura 1) seguendo le procedure precedentemente descritte20.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock di Cagedcolla-NBD (10 mM) a secco dimetilsolfossido (DMSO). Nota: Conservare la soluzione magazzino buio. La soluzione può essere diluita con amplificatori acquosi o terreni di colt...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. 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Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. 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K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Le indagini precedenti di luce-attivato traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule sono stati raggiunti utilizzando in gabbia NLS7,8,9. Come accennato in precedenza, questi metodi richiedono tecniche aggiuntive per incorporare le proteine NLS-etichettate nel citoplasma. Al contrario, nostro tag colla-R Cagedconsente non solo la traslocazione nucleare indotta da foto, ma anche l'assorbimento cellulare degli ...

Il nucleo delle cellule, che porta le informazioni genetiche, è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie tra cui il cancro e genetica disordini di1,2,3. Per consegna nucleare delle droghe, coniugazione di peptide tag come localizzazione nucleare (NLS) di segnali4,5,6 è stato ampiamente studiato. Tuttavia, al fine di ridurre gli effetti collaterali indesiderati, controllo spazio-temporale della traslocazione nucleare è necessario.
In precedenza, ha attivato luce traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule è stato raggiunto utilizzando in gabbia NLS7,8,9. NLS migra nel nucleo cellulare legandosi a proteine di trasporto citoplasmico6. Nei metodi segnalati, proteine ospite NLS in gabbia del cuscinetto sono direttamente incorporati nel citoplasma di microiniezione8 o espresso nelle celle di destinazione utilizzando un codice genetico espansione tecnica9. Pertanto, un metodo che si può raggiungere sia l'assorbimento cellulare e traslocazione nucleare foto-indotta è vantaggioso per applicazioni pratiche.
Qui, descriviamo la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag dendritiche colla molecolare in gabbia (Cagedcolla-R, Figura 1). Solubile in acqua molecolare Colle10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 cuscinetto più pendenti Gu+ sono stati sviluppati in precedenza, cui aderiscono strettamente al proteine11,12,13,14,15, 16,17, acidi nucleici18,19,20, fosfolipide membrane21e argilla nanosheets22,23 attraverso la Formazione di ponti più sale tra loro pendenti Gu+ e oxyanionic gruppi sugli obiettivi. I pendenti di Gu+ di Cagedcolla-R sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici, nitroveratryloxycarbonyl butirrato-sostituiti (BANVOC). Gli ospiti con etichettati Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e soggiorno in endosomi (Figura 2). Al momento photoirradiation, i gruppi NVOC BAdi Cagedcolla-R sono staccati per produrre una uncaged molecolare colla (Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu+ , che poi facilita la migrazione dell'ospite con tag nel citoplasma seguito dal nucleo della cellula (Figura 2). Il tag di colla-R Cagedpuò essere uncaged da esposizione a UV o due-fotone vicino infrarosso (NIR) luce senza serio fototossicità. Dimostriamo la consegna nucleare spatiotemporally controllata di ospiti macromolecolari, nonché ospiti della piccolo-molecola con CagedTag colla-R, utilizzando punti quantici (QD) ed un colorante fluorescente (nitrobenzoxadiazole; NBD), rispettivamente, come esempi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figura 1: Strutture schematiche di Cagedcolla-R. I pendenti di ioni (Gu+) guanidinium 9 Cagedcolla-r sono protetti da un gruppo di nitroveratryloxycarbonyl butirrato-sostituiti (BANVOC). I gruppi NVOC BAsono spaccati da irradiazione con UV o luce di due fotoni NIR. Il nucleo focale della colla Caged-R è funzionalizzato con nitrobenzoxadiazole (NBD) o dibenzocylooctyne (DBCO). Ristampato con il permesso di riferimento20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figura 2: Illustrazione schematica della traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti coniugato con un tag di Cagedcolla-R. L'ospite / coniugato colla-RCagedè ripreso in vita le cellule tramite endocitosi. Su photoirradiation, il tag di colla-R Cagedè uncaged cedere un tag colla-R Uncaged, che può facilitare la fuga endosomal dell'ospite con tag. Successivamente, l'ospite con tag migra nel nucleo cellulare. Ristampato con il permesso di riferimento20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

Il nucleo cellulare è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie. Qui, dimostriamo che la traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti usando in gabbia Tag colla molecolare (Cagedcolla-R), cui più pendenti di guanidinium ione (Gu+) sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici (butirrato-sostituiti nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gli ospiti con etichettati Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e rimangono in endosomi. Tuttavia, al momento photoirradiation, Cagedcolla-R è convertito in uncaged molecolare colla (Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu+ , che facilita la fuga endosomal e conseguente traslocazione nucleare degli ospiti. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery, poiché gli ospiti con tag possono migrare nel citoplasma seguito da nucleo cellulare solo quando photoirradiated. In gabbia Tag: colla-R in grado di fornire macromolecolari ospiti come punti quantici (QD) così come gli ospiti della piccolo-molecola. In gabbia Tag: colla-R può essere uncaged con non solo luce UV, ma anche luce di due fotoni vicino infrarosso (NIR), che possa penetrare in profondità nel tessuto.

Prima photoirradiation, Hep3B cellule incubate con Cagedcolla-NBD ha esibito l'emissione di fluorescenza punctate dal loro interno (λext = 488 nm; Figure 4A e 4C, verde). Un Micrografo analogo è stato ottenuto al momento di eccitazione a 543 nm per colorante rosso fluorescente (figure 4B e 4C, rosso), che indica che il Cagedcolla-NBD localizzata negli endosomi....

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Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Questo protocollo descrive la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag colla molecolare in gabbia. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery.

Spatiotemporally controllato traslocazione nucleare di ospiti in cellule viventi utilizzando colle molecolare in gabbia come tag fuse

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'area del parto dei farmaci, ad esempio come fornire un farmaco a uno specifico cellulare-granulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la traslocazione nucleare del gas può essere indotta dalla luce. A dimostrare la procedura saranno Rina Mogaki e Akio Arisaka i laureati del mio gruppo.Per iniziare a preparare la colla molecolare a gabbia legata a punti quantici sintetizzando la colla molecolare in gabbia legata alla dibenzociclottadina come descritto più dettagliatamente altrove. Preparare una soluzione di stock di 10 millimolare della colla molecolare in gabbia legata alla dibenzociclottadina in DMSO secco. Quindi preparare la colla molecolare in gabbia collegata a punti quantici facendo prima punti quantici funzionalizzati aseye.A tal fine aggiungere 100 microlitri di estere PEG4 NHS aseye micromolare in DMF a 400 microlitri di una soluzione DMF contenente 500 nanomolari di punti quantici rivestiti con piolo funzionalizzato all'ammina. Mescolare la miscela per un'ora a temperatura ambiente. Posizionare la soluzione risultante in una membrana di cellulosa rigenerata e dializzarla per 24 ore contro 800 ml di DMF.Successivamente diluire la soluzione stock di colla molecolare in gabbia collegata dibenzociclottadina a 50 micromolari con DMF e aggiungerne 200 microlitri alla soluzione post dialisi. Mescolare la miscela per tre ore a temperatura ambiente. Quindi dializzare la miscela risultante per 24 ore contro 800 ml di DMF fresco utilizzando una membrana di cellulosa rigenerata con il peso molecolare tagliato di 25000.Dopo 24 ore diluire la soluzione risultante a 200 nanomolari con DMF. Mantenere il carcinoma epatocellulare umano HEP3 B-cells nel mezzo essenziale minimo di Eagle contenente il 10%FBS in condizioni di coltura standard. Un giorno prima del seme dell'esperimento 5000 cellule B HEP3 in 200 microlitri di mezzo di coltura in ogni pozzo di uno scivolo di vetro a 8 camere.Quindi coprire lo scivolo e posizionarlo in un'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare le cellule due volte con 100 microlitri di PBS prerifabburto. Ad ogni pozzo dello scivolo a 8 camere aggiungere 200 microlitri di mezzo libero FBS contenenti 10 micromolari di una colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente.Dopo aver incubato per 3 ore rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare il campione cellulare due volte con 100 microlitri di PBS. Per visualizzare gli endosomi aggiungere 200 microlitri di mezzi di coltura contenenti 100 nanomolari di un colorante fluorescente rosso aggiuntivo come LysoTracker Red. Incubare il campione di cellule risultante per 20 minuti.Quindi rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare il campione di cellule due volte con 100 microlitri di PBS. Successivamente riportare le cellule a 200 microlitri del mezzo di coltura. Per indurre la traslocazione nucleare della colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente posizionare le cellule sotto una sorgente luminosa allo xeno da 100 watt dotata di un filtro passa banda da 365 nanometri.Esporre le cellule alla luce UV per 2 minuti. Durante questo periodo mantenere il campione della cella di controllo senza esposizione ai raggi UV al buio. Il coperchio dei substrati di vetro può essere tolto per un'efficiente esposizione ai raggi UV, tuttavia fai attenzione poiché l'esposizione prolungata alla luce UV può causare la morte cellulare.Per visualizzare i nuclei aggiungere un microlitro di macchia di Hoeschst al mezzo di coltura. Incubare il campione di cellule risultante per 10 minuti. Quindi posizionare il campione sul palco di un microscopio a scansione laser confocale.Registra le micrografie per la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente, il LysoTracker Red e la macchia nucleare. Come mostrato in precedenza, seminare 5000 cellule B HEP3 del carcinoma epatocellulare umano in ogni pozzo di uno scivolo da camera a 8 pozzi e coltura in condizioni standard per 24 ore. Fornire ai campioni cellulari 200 microlitri di terreno di coltura libero FBS contenente la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente.Incubare il campione di cellule risultante per 3 ore. Quindi rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare il campione di cellule due volte con 100 microlitri di PBS. Riportare le cellule a 200 microlitri di mezzo di coltura.Quindi soggetto a microscopia a scansione laser confocale campione e registrare le micrografie come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Come mostrato in precedenza, il seme 5000 cellule B HEP3 del carcinoma epatocellulare umano in ogni pozzo di uno scivolo da camera a 8 pozzi e coltura in condizioni standard per 24 ore. Fornire ai campioni cellulari 200 microlitri di terreno di coltura libero FBS contenenti 10 nanomolari della colla molecolare in gabbia collegata a punti quantici.Incubare il campione di cellule risultante per 3 ore. Quindi rimuovere il mezzo e risciacquare il campione di cellule due volte con 100 microlitri di PBS. Dopo il risciacquo le cellule le restituiscono a 200 microlitri di mezzo di coltura.Quindi posizionare la piastra sotto una sorgente luminosa allo xeno da 100 watt dotata di un filtro passa banda da 365 nanometri. Esporre il campione di cella alla luce UV per 2 minuti mantenendo i campioni di controllo al buio. Per visualizzare i nuclei aggiungere 1 microlitro di macchia di Hoechst al mezzo di coltura.Incubare il campione di cellule risultante per 10 minuti. Quindi immagini le cellule usando un microscopio a scansione laser confocale. Seminare il carcinoma epatocellulare umano CELLULE B HEP3 il giorno prima dell'esperimento a 5000 cellule per pozzo in una piastra di coltura di 96 pozzi.Quindi coprire le celle con 200 microlitri di mezzi di coltura e quindi posizionare la piastra in un'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo rimuovere il mezzo di coltura e risciacquare il campione di cellule due volte con 100 microlitri di PBS. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura libero FBS contenente la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente a concentrazioni che vanno da 0,1 a 100 micromolari.Incubare la piastra per 3 ore e quindi posizionare una piastra sotto la sorgente luminosa UV. Esporre il campione di cella alla luce UV per 2 minuti mantenendo i campioni di controllo al buio. Dopo l'esposizione ai raggi UV a 10 microlitri del reagente Cell Counting Kit-8 al mezzo di coltura e incubare il campione di cellule risultante per 2 ore.Quindi leggere l'assorbimento dei campioni a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastri. Prima della radiazione fotografica le cellule B HEP3 incubate con colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente mostrano emissione di fluorescenza punctate dall'interno, una micrografia analoga che mostra il LysoTracker Red indica che la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente era localizzata negli endosomi. Di conseguenza, l'emissione di fluorescenza assegnabile alla colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente è stata osservata al di fuori del nucleo cellulare prima della radiazione UV.Dopo le radiazioni UV, il fluorescente suggerisce che la colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente non è stata apposti ed è migrata nel citoplasma e nel nucleo cellulare. Tale traduzione nucleare della colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente può essere indotta sito selettivamente da 2 fotoni vicino alla luce infrarossa. La colla molecolare in gabbia tinta fluorescentmente in aree non irradiate non sfuggì agli endosomi e rimase come fluorescenza puncata.I tag di colla molecolare in gabbia dendritica possono anche fornire ospiti macromolecolari come punti quantici nel nucleo cellulare. Questi coniugati possono essere portati nelle cellule e dopo l'esposizione ai raggi UV per 2 minuti l'emissione di fluorescenza dei punti quantici può essere vista all'interno del nucleo. Dopo questo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della terapia genica per esplorare il trattamento a basso effetto collaterale.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Ricerca

Chimica

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Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

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