Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

우리는 NanoBio 통합, 도쿄의 대학에 대 한 중심을 인정합니다. 이 작품은 특정 여 대 한 젊은 과학자 (B) (26810046)를 ko로 부분적으로에서 및 지원 특정 특별히 승진 연구 (25000005)에 대 한 T.A. R.M. 덕분에 일본 사회 연구 장학 과학 (JSP의 승진에 대 한 ) 젊은 과학자와 최고의 대학원 (GPLLI) 프로그램에 대 한.

1. 준비 갇힌접착제-R와 함께 고객님의 태그
<ol><li>우리에 갇힌접착제 NBD 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>우리에 갇힌접착제-NBD (그림 1) 다음 절차를 앞에서 설명한20음성 합성.</li>
		<li>우리에 갇힌접착제-NBD (10mm) 건조 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 재고 솔루션을 준비 합니다. 참고: 어둠 속에서 재고 솔루션을 저장 합니다. 솔...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. 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Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. 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K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵으로의 이전 조사 갇힌된 NLS7,,89를 사용 하 여 달성 되었습니다. 앞에서 설명 했 듯이, 이러한 방법을 세포질에 NLS 태그 단백질 통합을 추가 기술 해야 합니다. 반면, 우리의 우리에 갇힌접착제-R 태그 사진 유도 핵 전 좌 뿐만 아니라 손님 들의 세포질 통풍 관을 수 있습니다. 이 우?...

유전 정보를 전달, 세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 암 등 다양 한 질병 치료에 효과적 이며 유전 장애1,2,3. 약물의 핵 전달, 펩 티 드의 활용 태그 같은 핵 지 방화 신호 (NLS)4,,56 광범위 하 게 조사 되었습니다. 그러나, 원치 않는 부작용을 줄이기 위해 핵 전 좌의 spatiotemporal 제어 필요 하다.
이전, 빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵에 갇힌된 NLS7,,89를 사용 하 여 달성 되었습니다. NLS 세포질 수송 단백질6에 바인딩하여 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 보고 방법에 갇힌된 NLS 베어링 이용 단백질 직접 microinjection8 세포질에 통합 또는 유전자 코드 확장 기법9를 사용 하 여 대상 셀에 표현. 따라서, 세포질 통풍 관 및 사진 유도 핵 전 좌를 얻을 수 있는 방법을 실용적인 응용 프로그램에 대 한 유리 하다.
여기, 우리 수지상 갇힌된 분자 접착제 (우리에 갇힌접착제-R, 그림 1) 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 빛 트리거 설명 합니다. 수용 성 분자 접착제10,11,12,13,14,15,16,,1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 여러 번+ 펜 던 트 베어링 이전 개발 되었습니다는 단단히 단백질11,12,13,,1415, 준수 16,17, 핵 산18,,1920, 인지질 막21및 찰 흙 nanosheets22,23 통해는 그들의 구+ 펜 던 트 및 대상에 oxyanionic 그룹 사이의 여러 염 다리의 형성. 우리에 갇힌접착제-R의 구+ 펜 던 트 음이온 photocleavable 그룹, 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC)에 의해 보호 됩니다. 우리에 갇힌접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 및 endosomes (그림 2)에서 세포. Photoirradiation에 바NVOC 그룹의 우리에 갇힌접착제-R는 uncaged 분자 접착제 (Uncaged접착제-R) 여러 번+ 펜 던 트를 들고 다음 태그 이용의 마이그레이션을 용이 하 게 하를 떨어뜨려합니다 에 세포질 세포 핵 (그림 2)에 의해 따라. 우리에 갇힌접착제-R 태그는 UV 또는 심각한 phototoxicity 없이 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛에 노출에 의해 갇힌 수입니다. 양자 점 (QDs) 및 형광 염료 (nitrobenzoxadiazole;를 사용 하 여 우리에 갇힌접착제-R 태그, 작은 분자의 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 spatiotemporally 제어 핵 전달 설명 NBD), 예제로 각각.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> 우리에 갇힌접착제-R.의 도식 구조를 그림 1: 9 guanidinium 이온 (+번) 펜 던 트 우리에 갇힌접착제-R의 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) 그룹에 의해 보호 됩니다. BANVOC 그룹은 UV 또는 2 광자 NIR 빛 조사에 의해 죽 습. 우리에 갇힌접착제-R의 초점 핵심은 공업화 nitrobenzoxadiazole (NBD) 또는 dibenzocylooctyne (DBCO). 참조20허가 매 판. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> 그림 2: 고객님의 핵 전 좌 빛 발생의 개요 그림 우리에 갇힌접착제-R 태그 활용. 손님이우리에 갇힌접착제-R 공액 생활으로 채택 / 셀 통해 endocytosis. Photoirradiation에 우리에 갇힌접착제-R 태그는 태그의 endosomal 탈출을 용이 하 게 수 한 Uncaged접착제-R 태그를 감 금. 그 후, 태그 이용 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 참조20허가 매 판. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 다양 한 질병 치료에 효과적입니다. 여기, 우리를 사용 하 여 고객님의 핵 전 좌 빛 트리거 갇힌 분자 접착제 (갇힌접착제-R) 태그, 그 여러 guanidinium 이온 (+번) 펜 던 트 (낙 산 염 대신 음이온 photocleavable 그룹에 의해 보호 됩니다 설명 nitroveratryloxycarbonyl; 바 NVOC)입니다. 우리에 갇힌접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 세포 및 endosomes. 그러나, photoirradiation, 시 우리에 갇힌접착제-R uncaged 분자 접착제 (Uncaged접착제-R) 여러 번+ 펜 던 트를 들고 endosomal 탈출 및 손님 들의 후속 핵 전 좌 용이로 변환 됩니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속 때문에 태그 손님 세포질 세포 핵 다음으로 마이그레이션할 수 있습니다 경우에만 photoirradiated. 갇힌 접착제-R 태그는 작은 분자 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 양자 점 (QDs) 등을 제공할 수 있습니다. 갇힌 접착제-R 태그는 자외선 뿐만 아니라 조직에 깊이 침투 수 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛으로 갇힌 수입니다.

Photoirradiation, 전에 우리에 갇힌접착제 NBD와 incubated Hep3B 세포 전시 그들의 내부에서 punctate 형광 방출 (λext = 488 nm; 그림 4A 고 4 C, 녹색). 유사한 현미경 사진 543에서 여기에 얻은 우리에 갇힌접착제 NBD는 endosomes에 지역화 나타내는 빨간색 형광 염료 (그림 4B , 4c, 빨간색)에 대 한 ...

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Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

이 프로토콜에 갇힌된 분자 접착제 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌를 빛 트리거 설명 합니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속입니다.

Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

이 방법은 특정 세포 과립에 약물을 전달하는 방법과 같은 약물 전달 영역에서 핵심 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 가스의 핵 전좌가 빛에 의해 유도될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 그룹의 졸업생 인 리나 모가키와 아리사카 아키오입니다.다른 곳에서 자세히 설명된 바와 같이 케이지 분자 접착제를 합성하여 양자점 연계 케이지 분자 접착제를 준비하기 시작한다. 건조 DMSO에 있는 caged 분자 접착제 연결된 dibenzocyclooctyne의 10 밀리머 스톡 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 먼저 aseye 기능화 퀀텀닷을 만들어 서 케이지 분자 접착제를 연결 한 퀀텀닷을 준비합니다.이를 달성하기 위해 DMF에 125 마이크로 몰라 아세아이 PEG4 NHS 에스테르의 100 마이크로 리터를 Amine 기능화 페그로 코팅된 양자 점의 500 나노 몰라를 포함하는 DMF 용액의 400 마이크로 리터에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 생성된 용액을 재생셀룰로오스 멤브레인에 배치하고 800ml의 DMF에 대해 24시간 동안 투석합니다.다음으로 dMF를 사용하여 디벤조사이클로오틴과 연결된 케이지 분자 접착제의 스톡 솔루션을 희석하고 투석 후 용액에 200 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 3시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 그런 다음 25000의 분자량이 잘린 재생셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 신선한 DMF 800ml에 대해 24 시간 동안 생성된 혼합물을 투석합니다.24시간 후 DMF를 사용하여 200 나노몰러로 생성된 용액을 희석시켰습니다. 표준 배양 조건하에서 10%의 FBS를 함유하는 이글의 최소한의 필수 배지에서 인간 간세포 암종 HEP3 B 세포를 유지하십시오. 실험 전 하루 전에 5000 HEP3 B 세포는 배양 배지의 200 마이크로리터에서 8 개의 챔버 유리 슬라이드의 각 우물로.그런 다음 슬라이드를 덮고 24 시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 배양 배지를 제거하고 미리 따뜻워진 PBS 의 100 마이크로리터로 세포를 두 번 헹구는 다. 8 개의 챔버 슬라이드의 각 우물에 형광으로 염색 된 분자 접착제의 10 마이크로 몰라를 포함하는 FBS 무료 배지 200 마이크로 리터를 추가합니다.3시간 동안 배양후 배양 배지를 제거하고 PBS의 100마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는다. 내모를 시각화하기 위해 LysoTracker Red와 같은 추가 적색 형광 염료의 100 나노 몰라를 포함하는 배양 매체의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 결과 셀 샘플을 20분 동안 배양합니다.그런 다음 배양 배지를 제거하고 PBS의 100 마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는 다. 그 후 세포를 배양 배지의 200 마이크로리터로 되돌려 보입니다. 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제의 핵 전역을 유도하기 위해 세포는 365 나노미터 밴드패스 필터를 장착한 100와트 크세논 광원 아래에 배치한다.세포를 UV 광에 2분 동안 노출시다. 이 시간 동안 어둠 속에서 UV 노출없이 제어 셀 샘플을 유지합니다. 유리 기판의 뚜껑은 효율적인 UV 노출을 위해 벗을 수 있지만 UV 광에 장기간 노출되면 세포 사멸을 일으킬 수 있으므로주의하십시오.핵을 시각화하려면 배양 배지에 Hoeschst 얼룩의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 결과 셀 샘플을 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 단계에 샘플을 배치합니다.형광으로 염색 된 분자 접착제, LysoTracker 빨간색 및 핵 얼룩에 대한 현미경 그래프를 기록합니다. 앞서 나타난 바와 같이, 종자 5000 인간 간세포 암종 HEP3 B 세포는 24시간 동안 표준 조건하에서 8개의 잘 챔버 슬라이드 및 배양의 각 우물으로 한다. 형광으로 염색된 분자 접착제를 포함하는 FBS 자유 배양 배지의 200 마이크로리터를 세포 샘플을 공급한다.결과 셀 샘플을 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배양 배지를 제거하고 PBS의 100 마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는 다. 배양 배지의 200 마이크로 리터로 세포를 반환합니다.그런 다음 샘플 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법의 적용을 받으며 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 현미경 을 기록한다. 이전에 도시된 시드와 같이 종자 5000 인간 간세포 암종 HEP3 B 세포는 24시간 동안 표준 조건하에서 8개의 잘 챔버 슬라이드 및 배양의 각 우물으로 한다. 양자점 연결 된 분자 접착제의 10 나노 몰라를 포함 하는 FBS 무료 배양 배지의 200 마이크로 리터와 세포 샘플을 공급.결과 셀 샘플을 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 중간을 제거하고 PBS의 100 마이크로 리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는 다. 세포를 헹구고 배양 배지의 200 마이크로 리터로 돌려보도록 한다.그런 다음 365 나노미터 밴드패스 필터가 장착된 100와트 크세논 광원 아래에 플레이트를 놓습니다. 세포 샘플을 UV 광에 2분 동안 노출하여 대조군 샘플을 어둠 속에서 유지합니다. 핵을 시각화하려면 배양 배지에 Hoechst 얼룩의 마이크로리터 1을 추가합니다.결과 셀 샘플을 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다. 인간 간세포 암 HEP3 B 세포를 96 개의 잘 배양 플레이트로 잘 당 5000 세포에서 실험 전날 종자.그런 다음 200 마이크로리터의 배양 매체로 세포를 덮은 다음 24 시간 동안 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 날 배양 배지를 제거하고 PBS의 100 마이크로리터로 세포 샘플을 두 번 헹구는 다. 그런 다음 0.1에서 100 마이크로몰라에 이르는 농도에서 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제를 함유한 FBS 자유 배양 배지 200마이크로리터를 첨가한다.플레이트를 3시간 동안 배양한 다음 UV 광원 아래에 접시를 놓습니다. 세포 샘플을 UV 광에 2분 동안 노출하여 대조군 샘플을 어둠 속에서 유지합니다. 세포 계수 키트-8 시약의 10 마이크로리터에서 UV 노출에 이어 배양 배지에 대한 시약을 배양하고 결과 세포 샘플을 2시간 동안 배양한다.그런 다음 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450 나노미터에서 샘플의 흡수를 읽습니다. 사진 방사선 전에 HEP3 B 세포는 형광으로 염색된 분자 접착제로 배양되어 내부에서 형광 방출을 천박하게 하여 LysoTracker Red를 나타내는 유사 현미경 그래프는 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제가 내분에서 국소화되었다는 것을 나타낸다. 이에 따라 형광염색된 분자 접착제에 할당가능한 형광 방출은 UV 방사선 이전에 세포 핵 외부에서 관찰되었다.UV 방사선 후에 형광은 형광으로 염색된 분자 접착제가 세포질과 세포 핵으로 감금되고 이동되었다는 것을 건의합니다. 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제의 이러한 핵 번역은 적외선 근처의 2-광자에 의해 선택적으로 부위를 유도할 수 있다. 비조사 부위에 형광으로 염색된 케이지 분자 접착제는 내분에서 벗어나지 않았고 형광을 천공하는 것으로 남아 있었다.수지상 케이지 분자 접착제 태그는 양자점과 같은 거대 분자 손님을 세포 핵으로 전달할 수도 있습니다. 이러한 컨쥬게이트는 세포로 채택될 수 있으며 UV 노출 후 2분 동안 양자점의 형광 방출은 핵 내에서 볼 수 있다. 이 개발 후이 기술은 낮은 부작용 치료를 탐구하는 유전자 치료의 분야에서 연구원을위한 길을 포장.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

RAFT 중합 제어를 통해 트라이 구성 요소 형광 Glycopolymers의 손쉬운 및 효율적인 준비

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

연구

화학

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

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EOB-DTPA와의 조지아 (III) 단지에 대한 조사 그것<sup&gt; (68)</sup&gt; 조지아 방사성 표지 된 아날로그

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

특성화 생활 Biofilms 통해 전자 전송

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

레이저 열 및 빛 분석 조건에서 핵 물질의 연구에 대 한 원자력 발전소 사고 시뮬레이션

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

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제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

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O-Carboxyanhydrides Ni/Zn 단지 중재의 Photoredox 반지 개통 중 합 제어

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

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단단한 CO2 원본으로 드라이 아이스를 사용 하 여 밀봉된 용기에 적당 한 압력을 달성

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

빛 주도 분자 모터 표면에 단일 분자 이미징

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...