Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Vi erkjenner sentrum for NanoBio integrasjon, Universitetet i Tokyo. Dette arbeidet ble støttet av Grant-in-Aid for unge forskere (B) (26810046) til K.O. og støttes delvis av Grant-in-Aid for spesielt forfremmet forskning (25000005) å T.T. RM Takk Research stipend i Japan Society for fremme av vitenskap (Javaserver ) for unge forskere og programmet for ledende utdannet skoler (GPLLI).

1. utarbeidelse av gjestene burlim-R koder
<ol><li>Forberede Cagedlim-NBD løsning.<ol>
<li>Syntetisere Cagedlim-NBD (figur 1) følgende prosedyrer beskrevet tidligere20.</li>
		<li>Forberede en lagerløsning av Cagedlim-NBD (10 mM) i tørr dimethyl sulfoxide (DMSO). Merk: Lagre lager løsningen i mørket. Løsningen kan fortynnes med vandig buffere eller celle kultur medier på bruk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede <s...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences.">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry &amp; Biology. 9, 943-948 (2002).</li><li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus.">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals.">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li><li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Go+in!+Go+out!+Inducible+control+of+nuclear+localization.">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium-based+&amp;#34;molecular+glues&amp;#34;+for+modulation+of+biomolecular+functions.">Guanidinium-based &amp;#34;molecular glues&amp;#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li><li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer:+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization.">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li><li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+&amp;#34;Molecular+Glue&amp;#34;+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin.">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &amp;#34;Molecular Glue&amp;#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue:+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids.">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li><li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies.">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+glues+for+manipulating+enzymes:+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues.">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li><li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes.">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Photoswitch:+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions.">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li><li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Tidligere undersøkelser av lys-utløst translokasjon av proteiner til cellekjernen har oppnådd bruker bur NLS7,8,9. Som nevnt tidligere, krever metodene flere teknikker for å innlemme NLS-merket proteiner i cytoplasma. I kontrast, kan vår Cagedlim-R koden ikke bare Foto-indusert kjernefysiske translokasjon, men også mobilnettet opptak av gjestene. Denne funksjonen av Cagedlim-R koden er fordelaktig for...

Cellekjernen, som bærer genetisk informasjon, er en av de viktigste organelles som subcellular narkotikarelaterte levering mål, siden modulering av genet replikering og uttrykket er effektive for behandling av ulike sykdommer, inkludert kreft og genetiske lidelser1,2,3. Kjernefysisk levering av narkotika, Bøyning av peptid koder som kjernefysisk lokalisering signaler (NLS)4,5,6 har blitt mye undersøkt. For å redusere uønskede bivirkninger, er imidlertid spatiotemporal kontroll over kjernefysiske translokasjon nødvendig.
Tidligere er lys-utløst translokasjon av proteiner til cellekjernen oppnådd med bur NLS7,8,9. NLS overfører til cellekjernen ved binding til cytoplasmatiske transport proteiner6. I rapporterte metoder, gjest proteiner bærer bur NLS direkte innlemmet i cytoplasma av microinjection8 eller uttrykt i målcellene bruker en genetisk kode ekspansjon teknikk9. Derfor er en metode som kan oppnå både mobilnettet opptak og foto-indusert kjernefysiske translokasjon fordelaktig for praktiske anvendelser.
Her beskriver vi lys-utløst kjernefysiske translokasjon av gjester i levende celler ved hjelp av dendrittiske bur molekylær lim (Cagedlim-R, figur 1) koder. Vannløselige molekylær lim10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 bærer flere Gu+ anheng er tidligere utviklet, som strengt overholder proteiner11,12,13,14,15, 16,17, nukleinsyrer18,19,20, phospholipid membraner21og leire nanosheets22,23 gjennom den dannelsen av flere salt broer mellom Gu+ anheng og oxyanionic grupper på målene. Gu+ anheng av Cagedlim-R er beskyttet av en anionic photocleavable, butyrate-substituert nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gjestene merket med Cagedlim-R er tatt opp til levende celler via endocytose og opphold i endosomes (figur 2). På photoirradiation, er BANVOC gruppene av Cagedlim-R frittliggende for å gi en uncaged molekylær lim (Uncagedlim-R) bærer flere Gu+ anheng, som så forenkler overføringen av merket gjestene i cytoplasma etterfulgt av cellekjernen (figur 2). Cagedlim-R koden kan være uncaged av eksponering for UV eller to-fotonet (NIR) røyken uten alvorlige Phototoksisitet. Vi viser spatiotemporally kontrollert kjernefysiske levering av macromolecular gjester samt små molekyl gjestene Cagedlim-R koder, kvante prikker (QDs) og en fluorescerende farge (nitrobenzoxadiazole; NBD), henholdsvis som eksempler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figur 1: Skjematisk strukturer av Cagedlim-R. 9 guanidinium ion (Gu+) anhengene Cagedlim-r er beskyttet av en butyrate-substituert nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) gruppe. BANVOC gruppene er kløyvde av bestråling med UV eller to-fotonet NIR lys. Fokal kjernen av Cagedlim-R er functionalized nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Gjengitt med tillatelse fra referanse20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figur 2: Skjematisk illustrasjon av lys-utløst kjernefysiske translokasjon av gjester konjugert med en Cagedlim-R kode. Gjesten /Cagedlim-R konjugert er tatt til levende celler via endocytose. På photoirradiation er Cagedlim-R taggen uncaged å gi en Uncagedlim-R-kode, som kan lette endosomal rømning av merket gjestene. Deretter overfører merket gjestene til cellekjernen. Gjengitt med tillatelse fra referanse20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

Cellekjernen er en av de viktigste organelles som subcellular narkotikarelaterte levering mål, siden modulering av genet replikering og uttrykket er effektive for behandling av ulike sykdommer. Her viser vi lys-utløst kjernefysiske translokasjon av Gjester som bruker bur molekylær lim (burlim-R) koder, som flere guanidinium ion (Gu+) anheng er beskyttet av en anionic photocleavable gruppe (butyrate-substituert nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gjestene merket med Cagedlim-R er tatt opp til levende celler via endocytose og forblir i endosomes. Men på photoirradiation konverteres Cagedlim-R til uncaged molekylær lim (Uncagedlim-R) bærer flere Gu+ anheng, som forenkler endosomal rømme og påfølgende kjernefysiske translokasjon av gjestene. Denne metoden er lovende for området-selektiv kjernefysiske målretting stoffet levering, siden merket gjestene kan overføre til cytoplasma etterfulgt av cellekjernen bare når photoirradiated. Bur Lim-R tags kan levere macromolecular Gjester som kvante prikker (QDs) og små-molekylet gjester. Bur Lim-R tags kan uncaged ikke bare UV lys, men også to-fotonet (NIR) røyken, som kan trenger dypt inn i vev.

Før photoirradiation, Hep3B celler inkubert med Cagedlim-NBD utstilt vises punctate fluorescens utslipp fra sitt interiør (λext = 488 nm; Tallene 4A og 4 C, grønn). En tilsvarende mikroskop-bilde ble innhentet på eksitasjon på 543 nm for rød-fluorescerende farge (tall 4B og 4 C, rød), som indikerer at Cagedlim-NBD lokalisert i endosomes. Følgelig fluores...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Denne protokollen beskriver lys-utløst kjernefysiske translokasjon av gjester i levende celler ved hjelp av bur molekylær lim koder. Denne metoden er lovende for området-selektiv kjernefysiske målretting stoffet levering.

Spatiotemporally kontrollert kjernefysiske translokasjon av gjester i levende celler med bur molekylær lim som Photoactivatable Tags

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål på området av narkotikalevering, for eksempel hvordan du leverer et stoff til en bestemt cellulær-granulær. Den største fordelen med denne teknikken er at kjernefysisk translokasjon av gass kan induseres av lys. Demonstrere prosedyren vil være Rina Mogaki og Akio Arisaka grad studenter fra min gruppe.For å begynne å forberede quantum dot koblet bur molekylær lim ved å syntetisere bur molekylær lim knyttet dibenzocyclooctyne som beskrevet i mer detalj andre steder. Forbered en 10 millimolar lagerløsning av burmolekylærlimet koblet dibenzocyclooctyne i tørr DMSO. Deretter forberede quantum dot knyttet bur molekylær lim ved først å lage aseye funksjonaliserte kvanteprikker.For å oppnå dette legge til 100 mikroliter av 125 mikromolar aseye PEG4 NHS ester i DMF til 400 mikroliter av en DMF-løsning som inneholder 500 nanomolar av kvanteprikker som er belagt med aminfunksjonalisert pinne. Rør blandingen i en time ved romtemperatur. Plasser den resulterende oppløsningen i en regenerert cellulosemembran og dialyser den i 24 timer mot 800 ml DMF.Deretter fortynne lagerløsningen av burmolekylærlim knyttet dibenzocyclooctyne til 50 mikromos med DMF og tilsett 200 mikroliter av det til postdialyseløsningen. Rør blandingen i tre timer ved romtemperatur. Deretter dialyser den resulterende blandingen i 24 timer mot 800 ml fersk DMF ved hjelp av en regenerert cellulosemembran med molekylvekten avskåret av 25000.Etter 24 timer fortynne den resulterende løsningen til 200 nanomolar med DMF. Opprettholde menneskelig hepatocellulært karsinom HEP3 B-celler i Eagle minimal essensielle medium som inneholder 10% FBS under standard kulturforhold. En dag før eksperimentet frø 5000 HEP3 B-celler i 200 mikroliter kultur medium inn i hver brønn av en 8 kamret glass lysbilde.Dekk deretter lysbildet og legg den i en inkubator i 24 timer. Neste dag fjerner du kulturmediet og skyll cellene to ganger med 100 mikroliter forhåndsoppvarmede PBS. Til hver brønn av de 8 kamret lysbilde legge til 200 mikroliter av FBS gratis medium som inneholder 10 mikromos av en fluorescerende farget bur molekylær lim.Etter inkubering i 3 timer, fjern kulturmediet og skyll celleprøven to ganger med 100 mikroliter PBS. For å visualisere endosomene legger du til 200 mikroliter kulturmedier som inneholder 100 nanomolar av et ekstra rødt fluorescerende fargestoff som LysoTracker Red. Inkuber den resulterende celleprøven i 20 minutter.Fjern deretter kulturmediet og skyll celleprøven to ganger med 100 mikroliter PBS. Deretter returnerer cellene til 200 mikroliter av kulturmediet. For å indusere kjernefysisk translokasjon av fluorescerende farget bur molekylær lim plassere cellene under en 100 watt xenon lyskilde utstyrt med en 365 nanometer bandpass filter.Utsett cellene for UV-lys i 2 minutter. I løpet av denne tiden holde kontrollcelleprøven uten UV-eksponering i mørket. Lokket på glasssnedstrene kan tas av for effektiv UV-eksponering, men vær forsiktig da langvarig eksponering for UV-lys kan forårsake celledød.For å visualisere kjernene, legg til en mikroliter Hoeschst flekk til kulturmediet. Inkuber den resulterende celleprøven i 10 minutter. Plasser deretter prøven på scenen av et konfokal laserskanningsmikroskop.Registrer mikrografene for det fluorescerende fargede burmolekyllimet, LysoTracker Red og atomflekken. Som tidligere vist, frø 5000 humant hepatocellulært karsinom HEP3 B-celler i hver brønn av en 8 brønnkammer lysbilde og kultur under standard forhold i 24 timer. Forsyne celleprøvene med 200 mikroliter fbs frie kulturmedium som inneholder fluorescerende farget burmolekylærlim.Inkuber den resulterende celleprøven i 3 timer. Fjern deretter kulturmediet og skyll celleprøven to ganger med 100 mikroliter PBS. Returner cellene til 200 mikroliter kulturmedium.Deretter kan du prøve konfokal laserskanning mikroskopi og registrere mikrografene som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Som tidligere vist frø 5000 humant hepatocellulært karsinom HEP3 B-celler i hver brønn av en 8 brønnkammer lysbilde og kultur under standardforhold i 24 timer. Forsyne celleprøvene med 200 mikroliter fbs frie kulturmedium som inneholder 10 nanomolar av kvanteprikken koblet burmolekylærlim.Inkuber den resulterende celleprøven i 3 timer. Fjern deretter mediet og skyll celleprøven to ganger med 100 mikroliter PBS. Etter skylling cellene returnere dem til 200 mikroliter av kultur medium.Plasser deretter platen under en 100 watt xenon lyskilde utstyrt med en 365 nanometer bandpass filter. Utsett celleprøven for UV-lys i 2 minutter for å holde kontrollprøvene i mørket. For å visualisere kjernene, legg til 1 mikroliter Hoechst-flekk til kulturmediet.Inkuber den resulterende celleprøven i 10 minutter. Deretter bilde cellene ved hjelp av en confocal laser skanning mikroskop. Seed den menneskelige hepatocellulære karsinom HEP3 B-celler dagen før eksperimentet på 5000 celler per godt inn i en 96 brønn kultur plate.Dekk deretter cellene med 200 mikroliter kulturmedier og legg deretter platen i en inkubator i 24 timer. Neste dag fjerner du kulturmediet og skyll celleprøven to ganger med 100 mikroliter PBS. Tilsett deretter 200 mikroliter med FBS frie kulturmedium som inneholder fluorescerende farget burmolekylærlim ved konsentrasjoner fra 0,1 til 100 mikromos.Inkuber platen i 3 timer, og plasser deretter en plate under UV-lyskilden. Utsett celleprøven for UV-lys i 2 minutter for å holde kontrollprøvene i mørket. Etter UV-eksponering ved 10 mikroliter av Cell Counting Kit-8-reagensen til kulturmediet og inkubere den resulterende celleprøven i 2 timer.Les deretter absorpsjonen av prøvene ved 450 nanometer ved hjelp av en mikroplateleser. Før fotostråling HEP3 B-celler inkubert med fluorescerende farget bur molekylær lim viser punktat fluorescens utslipp fra interiøret en analog mikrograf som viser LysoTracker Red indikerer at fluorescerende farget bur molekylærlim ble lokalisert i endosomene. Derfra ble fluorescensutslippet som kunne tildeles det fluorescerende fargede burmolekyllimet observert utenfor cellekjernen før UV-stråling.Etter UV-stråling antyder fluorescerende at fluorescerende farget bur molekylært lim ble urørt og migrert inn i cytoplasma og cellekjernen. En slik kjernefysisk oversettelse av fluorescerende farget bur molekylærlim kan induseres stedet selektivt av 2-foton nær infrarødt lys. Det fluorescerende fargede burmolekylære limet i ikke-bestrålte områder unnslapp ikke fra endosomene og forble som punktatfluorescens.Den dendrittiske burmolekylære limkodene kan også levere makromolekylære gjester som kvanteprikker inn i cellekjernen. Disse konjugatene kan tas opp i cellene, og etter UV-eksponering i 2 minutter kan fluorescensutslippet av kvanteprikkene ses i kjernen. Etter denne utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen genterapi for å utforske lav bivirkningsbehandling.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Lettvinte og effektiv Utarbeidelse av Tri-komponent Fluorescent Glycopolymers via RAFT-kontrollerte Polymerisering

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomerking og Kvantifisering av Cellular Nivåer av Phosphoinositides ved HPLC-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av Plant Wall Heteroxylans Bruke enzymic, Chemical (Metylering) og fysiske (massespektrometri Nuclear Magnetic Resonance) Teknikker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Undersøkelser på Ga (III) Kompleks av EOB-DTPA og dens<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radiomerket Analog

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Karakterisere elektronet Transport gjennom levende biofilm

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

Laser-oppvarming og utstråling massespektrometri for studier av kjernefysisk materiale i forhold simulere en kjernekraftverk ulykke

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Gjenkjennings- og enkeltcelle kvantifisering av metalloksid nanopartikler kjernefysiske Microprobe analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Kontrollert Photoredox Ring-åpning polymerisering av O- Carboxyanhydrides formidlet av Ni/Zn komplekser

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Oppnå moderat press i forseglet fartøy bruker tørris som en Solid CO2

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Lys-drevet molekylær motorer på overflater for enkelt molekylær Imaging

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...