Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Мы признаем центр для NanoBio интеграции, Университет Токио. Эта работа была поддерживается за счет целевых субсидий для молодых ученых (B) (26810046) К.О и частично поддерживается субсидий специально поощрять исследований (25000005) т.а. R.M. Спасибо исследовательские стипендии Японии общества для поощрения науки (JSP ) для молодых ученых и программы для ведущих выпускник школ (GPLLI).

1. Подготовка гостей с клеткеклей R Теги
<ol><li>Готовят раствор клея-NBD Caged.<ol>
<li>Синтезировать Cagedклей-NBD (рис. 1) после ранее описанные процедуры20.</li>
		<li>Подготовьте Стоковый раствор Cagedклей-NBD (10 мм) в сухом диметилсульфоксида (ДМСО). Прим...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences.">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry &amp; Biology. 9, 943-948 (2002).</li><li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus.">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals.">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li><li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Go+in!+Go+out!+Inducible+control+of+nuclear+localization.">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium-based+&amp;#34;molecular+glues&amp;#34;+for+modulation+of+biomolecular+functions.">Guanidinium-based &amp;#34;molecular glues&amp;#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li><li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer:+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization.">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li><li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+&amp;#34;Molecular+Glue&amp;#34;+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin.">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &amp;#34;Molecular Glue&amp;#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue:+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids.">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li><li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies.">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+glues+for+manipulating+enzymes:+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues.">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li><li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes.">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Photoswitch:+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions.">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li><li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Предыдущие исследования-срабатывает транслокации белка в ядре клетки были достигнуты с помощью NLS клетке7,8,9. Как упоминалось ранее, эти методы требуют дополнительных методов включения NLS-тегами белков в цитоплазме. В противоположност?...

Клеточное ядро, которое несет генетическую информацию, является одним из наиболее важных органеллы как цель субцеллюлярные доставки лекарств, с модуляции гена репликации и выражение является эффективным для лечения различных заболеваний, включая рак и генетических расстройства,1,2,3. Для доставки ядерного оружия, наркотиков спряжение пептида теги, такие, как широко исследована ядерной локализации сигналов (NLS)4,5,6 . Однако для того чтобы уменьшить нежелательные побочные эффекты, пространственно-временных контроль ядерных транслокации является необходимым.
Ранее был достигнут свет срабатывает транслокации белка в ядре клетки, с помощью NLS клетке7,8,9. NLS мигрирует в ядре клетки путем связывания белков цитоплазматического транспорта6. В сообщаемых методов гость белки, принимая клетке NLS непосредственно включены в цитоплазме микроинъекции8 или выраженные в целевой ячейки, используя метод расширения генетического кода9. Таким образом метод, который можно достичь клеточного поглощения и фото индуцированной ядерной транслокации выгодно для практического применения.
Здесь мы описываем свет срабатывает ядерной транслокации гостей в живых клеток с помощью тегов дендритных клетках молекулярный клей (Cagedклей-R, рис. 1). Водорастворимые клеи молекулярной10,11,12,13,14,,1516,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , принимая несколько ГУ+ подвески ранее разработаны, который жестко придерживаться белков11,12,13,14,15, 16,17, нуклеиновые кислоты18,19,20, фосфолипидов мембран21и глины nanosheets22,23 через формирование нескольких соли мостов между их подвески ГУ+ и oxyanionic группами на цели. ГУ+ подвески Cagedклей-R защищены анионные photocleavable группой, бутират замещенных nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Гости, отмеченных Cagedклей-R учитываются живых клеток через эндоцитоза и пребывания в endosomes (рис. 2). После хлорином БаNVOC групп Cagedклей-R отсоединены приносить отключенную молекулярный клей (Uncagedклей-R) перевозящих несколько ГУ+ подвески, которая затем способствует миграции тегами гостя в цитоплазме, следуют клеточного ядра (рис. 2). Cagedклей-R тег может быть отключенную под воздействием УФ или два Фотон ближней ИК-области спектра (NIR) света без серьезных Фототоксичность. Мы демонстрируем spatiotemporally контролируемых ядерных поставок макромолекулярных гостей, а также мелкомолекулярных гостей с Cagedклей-R теги, использование квантовых точек (QDs) и флуоресцентные краски (nitrobenzoxadiazole; NBD), соответственно, в качестве примеров.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Рисунок 1: Схема структуры Cagedклей-р. 9 Гуанидиновые Ион (ГУ+) подвески Cagedклей-r защищены группой бутират замещенных nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Группы NVOC Барасщепляется при облучении УФ или два Фотон NIR света. Суть фокуса Cagedклей-R функционализированных с nitrobenzoxadiazole (NBD) или dibenzocylooctyne (DBCO). Перепечатано с разрешения ссылки20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Рисунок 2: Схематическое изображение света срабатывает ядерной транслокации гостей конъюгированных с тегом клей-R Caged. Гость /Cagedклей-R конъюгата учитывается живых клеток через эндоцитоз. После хлорином клей-R тег Cagedотключенную приносить тег клей-R Uncaged, который может облегчить побег от англ тегами гостя. Впоследствии помеченный гость мигрирует в ядре клетки. Перепечатано с разрешения ссылки20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

Клеточное ядро является одним из наиболее важных органеллы как цель субцеллюлярные доставки лекарств, после модуляции гена репликации и выражение является эффективным для лечения различных заболеваний. Здесь мы демонстрируем, что свет срабатывает ядерной транслокации гостей с помощью клетке Теги молекулярный клей (Cagedклей-R), анионные photocleavable группой (бутират замещенных защищены которого несколько подвески Ион (ГУ+) Гуанидиновые nitroveratryloxycarbonyl; Ба NVOC). Гости, отмеченных Cagedклей-R учитываются живых клеток через эндоцитоза и остаются в endosomes. Однако после хлорином, Cagedклей-R преобразуется в отключенную молекулярный клей (Uncagedклей-R) проведение нескольких ГУ+ подвески, которая облегчает побег от англ и последующих ядерных транслокации гостей. Этот метод является перспективным для доставки лекарств сайт селективные таргетинг, поскольку тегами гости могут мигрировать в цитоплазме, следуют клеточного ядра только при photoirradiated. В клетке Клей-R Теги могут доставить макромолекулярных гостей, таких как квантовых точек (QDs) а также мелкомолекулярных гостей. В клетке Клей-R Теги могут быть отключенную с не только УФ-излучения, но и двух Фотон ближней ИК-области спектра (NIR) света, который может глубоко проникают в ткани.

Перед хлорином, Hep3B клетки инкубировали с Cagedклей-NBD выставлены пунктата флуоресценции выбросов от их интерьер (λext = 488 нм; 4A цифры и 4 C, зеленый). Аналогичных Микрофотография был получен после возбуждения в 543 Нм для красно Люминесцентн?...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Этот протокол описывает свет срабатывает ядерной транслокации гостей в живых клеток с помощью тегов клетке молекулярный клей. Этот метод является перспективным для сайта селективные таргетинг доставки лекарств.

Spatiotemporally контролируемых ядерных транслокации гостей в живых клеток с помощью клетке молекулярный клей как Photoactivatable Теги

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области доставки лекарств, например, как доставить препарат в конкретный клеточно-гранулированный. Основным преимуществом этой техники является то, что ядерная транслокация газа может быть вызвана светом. Демонстрация процедуры будет Рина Могаки и Акио Arisaka аспирантов из моей группы.Для начала подготовить квантовую точку связаны клетки молекулярного клея путем синтеза в клетке молекулярного клея связаны дибензоциклоктин, как описано более подробно в другом месте. Приготовьте 10-миллиметровый стоковый раствор клетчатого молекулярного клея, связанного дибензоциклоктином в сухом ДМСО. Затем подготовьйте квантовую точку, связанную с молекулярным клеем в клетке, сначала сделав айе функционализированными квантовыми точками.Для достижения этой цели добавьте 100 микролитров 125 микромолящих aseye PEG4 NHS ester в DMF до 400 микролитров раствора DMF, содержащего 500 наномолярных квантовых точек, которые покрыты функциональной колышек амина. Перемешать смесь в течение одного часа при комнатной температуре. Поместите полученный раствор в регенерированную целлюлозную мембрану и обиализуете его в течение 24 часов против 800 мл DMF.Далее разбавить фондовый раствор клетчатого молекулярного клея, связанного дибензоциклооктином с 50 микромоляном с DMF и добавить 200 микролитров его в раствор постдиалярия. Перемешать смесь в течение трех часов при комнатной температуре. Затем диализировать полученную смесь в течение 24 часов против 800 мл свежего DMF с помощью регенерирующей целлюлозной мембраны с молекулярной массой отрезанной 25000.Через 24 часа разбавить полученный раствор до 200 наномоляр с DMF. Поддерживайте гепатоцеллюлярную карциному HEP3 B-клеток в минимальной необходимой среде Орла, содержащей 10%FBS в стандартных культурных условиях. За день до эксперимента семя 5000 HEP3 B-клеток в 200 микролитров культуры среды в каждый колодец 8 камерных стеклянных слайдов.Затем накройте слайд и поместите его в инкубатор в течение 24 часов. На следующий день удалить культуру среды и промыть клетки дважды с 100 микролитров предварительно разогретых PBS. К каждому колодецу 8 камерного слайда добавляют 200 микролитров свободной среды FBS, содержащей 10 микромолейных флуоресцентно окрашенных клетчатых молекулярных клеев.После инкубации в течение 3 часов удалить культуру среды и промыть образец клетки в два раза с 100 микролитров PBS. Для визуализации эндосомы добавляют 200 микролитров культурных медиа, содержащих 100 наномоляров дополнительного красного флуоресцентного красителя, такого как LysoTracker Red. Инкубировать полученный образец клетки в течение 20 минут.Затем удалите культурную среду и дважды промойте образец клетки 100 микролитров PBS. После этого возвращают клетки к 200 микролитров среды культуры. Для индуцирования ядерной транслокации флуоресцентно окрашенного молекулярного клея в клетке поместите клетки под 100-ваттный ксеноновый источник света, оснащенный 365-нанометровым фильтром.Подвергайте клетки ультрафиолетовому свету в течение 2 минут. В течение этого времени держите образец контрольной ячейки без уф-облучения в темноте. Крышка стеклянных субстратов может быть сняты для эффективного воздействия УФ однако будьте осторожны, как длительное воздействие УФ-излучения может привести к гибели клеток.Для визуализации ядер добавьте один микролитер пятна Hoeschst в культурную среду. Инкубировать полученный образец клетки в течение 10 минут. Затем поместите образец на стадии конфокального лазерного сканирующего микроскопа.Запись микрографов для флуоресцентно окрашенные клетке молекулярного клея, LysoTracker красный, и ядерное пятно. Как было показано ранее, семя 5000 человека гепатоцеллюлярной карциномы HEP3 B-клеток в каждый колодец 8 хорошо камерный слайд и культуры в стандартных условиях в течение 24 часов. Поставка образцов клеток с 200 микролитров FBS свободной среды культуры, содержащей флуоресцентно окрашенные клетке молекулярного клея.Инкубировать полученный образец клетки в течение 3 часов. Затем удалите культурную среду и дважды промойте образец клетки 100 микролитров PBS. Верните клетки к 200 микролитров среды культуры.Затем при условии образца конфокального лазерного сканирования микроскопии и записи микрографов, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Как было показано ранее семян 5000 человека гепатоцеллюлярной карциномы HEP3 B-клеток в каждом колодец 8 хорошо камеры слайд и культуры в стандартных условиях в течение 24 часов. Поставка образцов клеток с 200 микролитров FBS свободной среды культуры, содержащей 10 наномоляр квантовой точки связаны клетке молекулярного клея.Инкубировать полученный образец клетки в течение 3 часов. Затем удалите среду и промыть образец клетки дважды с 100 микролитров PBS. После полоскания клетки возвращают их в 200 микролитров культурной среды.Затем поместите пластину под 100-ваттный ксенон источник света оснащен 365 нанометровый фильтр bandpass. Подвергайте образец клетки ультрафиолетовому свету в течение 2 минут, сохраняя контрольные образцы в темноте. Для визуализации ядер добавьте 1 микролитер пятна Hoechst в культурную среду.Инкубировать полученный образец клетки в течение 10 минут. Затем изображение клеток с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Семя человека гепатоцеллюлярной карциномы HEP3 B-клеток за день до эксперимента на 5000 клеток на а в 96 хорошо культуры пластины.Затем накройте клетки 200 микролитров культурных средств массовой информации, а затем поместите пластину в инкубатор в течение 24 часов. На следующий день удалить культуру среды и промыть образец клетки в два раза с 100 микролитров PBS. Затем добавьте 200 микролитров свободной культуры FBS, содержащих флуоресцентно окрашенный молекулярный клей в клетках в концентрациях от 0,1 до 100 микромолей.Инкубировать пластину в течение 3 часов, а затем поместить пластину под источником УФ-излучения. Подвергайте образец клетки ультрафиолетовому свету в течение 2 минут, сохраняя контрольные образцы в темноте. После воздействия УФ-излучения на 10 микролитров реагента Cell Counting Kit-8 в культурную среду и инкубировать полученный образец клетки в течение 2 часов.Затем прочитайте поглощение образцов на 450 нанометров с помощью микропластицы читателя. Перед фотоизлучением HEP3 B-клетки, инкубированные флуоресцентно окрашенным молекулярным клеем, демонстрируют панктатное излучение флуоресценции из интерьера, аналогичный микрограф, показывающий LysoTracker Red, указывает на то, что флуоресцентно окрашенный молекулярный клей был локализован в эндосомах. Соответственно, флуоресцентное излучение, присваиваемое флуоресцентно окрашенному молекулярному клею в клетке, наблюдалось вне ядра клетки до УФ-излучения.После УФ-излучения флуоресцентные предполагает, что флуоресцентно окрашенный в клетку молекулярный клей был незагрязв и мигрировал в цитоплазму и ядро клетки. Такой ядерный перевод флуоресцентно окрашенного молекулярного клея в клетке может быть индуцирован сайтом выборочно 2-фотоном вблизи инфракрасного света. Флуоресцентно окрашенный молекулярный клей в клетке в необлученных областях не избежал эндосом и остался в качестве прокола флуоресценции.Дендритные клетки молекулярного клея теги могут также доставить макромолекулярных гостей, таких как квантовые точки в ядро клетки. Эти конъюгации могут быть приняты в клетки и после УФ-облучения в течение 2 минут флуоресценции излучения квантовых точек можно увидеть в ядре. После этого развития этот метод проложил путь для исследователей в области генной терапии для изучения низкого лечения побочных эффектов.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Легким и эффективным Подготовка Tri-компонентов флуоресцентных гликополимеров помощью плот контролируется полимеризации

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Радиоактивной и Количественная клеточном уровнях фосфоинозитидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании-Flow мерцаний

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Секвенирование растений стены Heteroxylans Использование ферментативной, химической (метилирование) и физический (масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс) Методики

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Исследования по Ga (III) комплекса EOB-DTPA и ее<sup&gt; 68</sup&gt; Ga радиоактивной Аналоговый

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Характеризуя переноса электронов через биоплёнки жизни

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

Лазер Отопление и сияние-спектрометрии для изучения ядерных материалов в условиях имитации аварии на атомной электростанции

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

На месте Выявление и количественная оценка одноклеточного наночастиц оксидов металлов, с использованием ядерных рентгенофлуоресцентного анализа

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Под контролем Photoredox кольцо открытие полимеризации O- Carboxyanhydrides при посредничестве Ni/Zn комплексы

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Достижение умеренного давления в герметичных сосудов с помощью сухого льда в качестве источника твердых CO2

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Свет driven молекулярные моторы на поверхностях для одного Молекулярное воображение

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...