Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Vi erkänner centrum för NanoBio Integration, University of Tokyo. Detta arbete var stöds av bidrag för unga forskare (B) (26810046) att K.O. och delvis stöds av bidrag för speciellt främjat forskning (25000005) att T.A. R.M. tack Forskning Stipendier Japan samhällets för främjande av vetenskap (JSPS ) för unga forskare och Program för ledande forskarskolor (GPLLI).

1. beredning av gäster med burlim-R Taggar
<ol><li>Förbereda Cagedlim-NBD lösning.<ol>
<li>Syntetisera Cagedlim-NBD (figur 1) efter de tidigare beskrivna förfaranden-20.</li>
		<li>Förbereda en stamlösning av Cagedlim-NBD (10 mM) i torr dimetyl sulfoxid (DMSO). Obs: Förvara stamlösning i mörkret. Lösningen kan spädas med aqueous buffertar eller cell kulturmassmedia vid användning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bere...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences.">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry &amp; Biology. 9, 943-948 (2002).</li><li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus.">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals.">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li><li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Go+in!+Go+out!+Inducible+control+of+nuclear+localization.">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium-based+&amp;#34;molecular+glues&amp;#34;+for+modulation+of+biomolecular+functions.">Guanidinium-based &amp;#34;molecular glues&amp;#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li><li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer:+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization.">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li><li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+&amp;#34;Molecular+Glue&amp;#34;+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin.">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &amp;#34;Molecular Glue&amp;#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue:+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids.">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li><li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies.">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+glues+for+manipulating+enzymes:+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues.">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li><li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes.">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Photoswitch:+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions.">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li><li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Tidigare undersökningar av ljus-utlöst flyttning av proteiner i cellkärnan har uppnåtts med bur NLS7,8,9. Som tidigare nämnts, kräver dessa metoder ytterligare tekniker för att införliva de NLS-märkta proteinerna i cytoplasman. Däremot kan vår Cagedlim-R tag inte bara foto-inducerad translokationen i cellkärnan, utan även cellernas upptag av gästerna. Funktionen av taggen Cagedlim-R är förde...

Cellkärnan, som bär den genetiska informationen, är en av de viktigaste organeller som subcellulär drog-leverans mål, sedan modulering av genen replikering och uttryck är effektiv för behandling av olika sjukdomar inklusive cancer och genetiska sjukdomar i1,2,3. För nukleära leverans av läkemedel, Konjugation av peptid taggar såsom cellkärnelokalisering signaler (NLS)4,5,6 allmänt har undersökts. För att minska oönskade bieffekter, krävs dock spatiotemporal kontroll av translokationen i cellkärnan.
Tidigare, ljus-utlöst flyttning av proteiner i cellkärnan har uppnåtts med bur NLS7,8,9. NLS migrerar in i cellkärnan genom bindning till cytoplasmiska transport proteiner6. I de rapportera metoderna, är gäst proteiner med bur NLS direkt införlivas i cytoplasman av Mikroskop8 eller uttryckt i målcellerna använder en genetisk kod expansion teknik9. En metod som kan uppnå både cellernas upptag och foto-inducerad translokationen i cellkärnan är därför fördelaktigt för praktiska tillämpningar.
Häri, beskriver vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med hjälp av dendritiska bur molekylär lim (Cagedlim-R, figur 1) Taggar. Vattenlösliga molekylär lim10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 med flera Gu+ hängen har tidigare utvecklats, som tätt följa proteiner11,12,13,14,15, 16,17, nukleinsyror18,19,20, fosfolipid membran21och lera nu22,23 genom den bildandet av flera salt broar mellan deras Gu+ hängen och oxyanionic grupper på mål. Gu+ Hängen av Cagedlim-R skyddas av en anjoniska photocleavable grupp, butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC). Gäster med Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och vistelse i endosomes (figur 2). Vid photoirradiation, är BANVOC grupperna av Cagedlim-R fristående för att ge en uncaged molekylär lim (Uncagedlim-R) bär flera Gu+ hängen, vilket då underlättar migreringen av märkta gästen i cytoplasman följt av cellkärnan (figur 2). Taggen Cagedlim-R kan vara uncaged av exponering för UV- eller två-photon nära infrarött (NIR) ljus utan allvarliga fototoxicitet. Vi visar den spatiotemporally kontrollerade kärn leveransen av makromolekylära gäster samt småmolekylär gäster med Cagedlim-R taggar, som använder kvantprickar (QDs) och ett fluorescerande färgämne (nitrobenzoxadiazole; NBD), respektive, som exempel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figur 1: Schematisk strukturer av Cagedlim-R. 9 guanidinium ion (Gu+) Hängen av Cagedlim-R skyddas av en butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) grupp. BANVOC grupperna klyvs av bestrålning med UV- eller två-photon NIR ljus. Focal kärnan i Cagedlim-R är functionalized med antingen nitrobenzoxadiazole (NBD) eller dibenzocylooctyne (DBCO). Omtryckt med tillåtelse från referens20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figur 2: Schematisk illustration av ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster konjugerat med ett Cagedlim-R tag. Gästen /Cagedlim-R konjugat tas i levande celler via endocytos. Vid photoirradiation är Cagedlim-R taggen uncaged ge en Uncagedlim-R tagg, som kan underlätta endosomal flykten av märkta gästen. Därefter migrerar märkta gästen in i cellkärnan. Omtryckt med tillåtelse från referens20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

Cellkärnan är en av de viktigaste organeller som subcellulär drog-leverans mål, sedan modulering av genen replikering och uttryck är effektiv för behandling av olika sjukdomar. Här visar vi ljus-utlöst translokationen i cellkärnan i gäster som använder bur molekylär lim (Cagedlim-R) Taggar, vars flera guanidinium ion (Gu+) hängen skyddas av en anjoniska photocleavable grupp (butyrate-substituerade nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gäster med Cagedlim-R etiketten tas i levande celler via endocytos och förbli i endosomes. Dock är Cagedlim-R vid photoirradiation omvandlas uncaged molekylär lim (Uncagedlim-R) bär flera Gu+ hängen, som underlättar endosomal fly och efterföljande translokationen i cellkärnan av gästerna. Denna metod är lovande för webbplats-selektiva kärnvapen-targeting drogen leverans, eftersom de taggade gästerna kan migrera in i cytoplasman följt av cellkärnan endast när photoirradiated. Caged Lim-R taggar kan leverera makromolekylära gäster såsom kvantprickar (QDs) samt småmolekylär gäster. Caged Lim-R taggar kan vara uncaged med UV-ljus men också två-photon nära infrarött (NIR) ljus, som kan tränga djupt in i vävnaden.

Innan photoirradiation, uppvisade Hep3B cellerna inkuberas med Cagedlim-NBD punktuell fluorescens utsläpp från sin inre (λext = 488 nm. Figurerna 4A och 4 C, grön). En liknande Mikrograf erhölls vid magnetiseringen på 543 nm för röd fluorescerande färgämne (figurerna 4B och 4 C, röd), som anger att Cagedlim-NBD lokaliserade i endosomes. Följaktligen f...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Det här protokollet beskriver ljus-utlöst translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med bur molekylär lim-taggar. Denna metod är lovande för webbplats-selektiva kärnvapen-targeting drogen leverans.

Spatiotemporally kontrollerade translokationen i cellkärnan gäster i levande celler med bur molekylär lim som Photoactivatable Taggar

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågan i området för drug delivery, såsom hur man levererar ett läkemedel till en specifik cellulär-granulat. Den största fördelen med denna teknik är att kärn-flyttning av gas kan framkallas genom ljus. Demonstrera förfarandet kommer att Rina Mogaki och Akio Arisaka grad eleverna från min grupp.För att börja förbereda quantum dot länkade bur molekylära lim genom att syntetisera bur molekylärt lim länkade dibenzocyklokulet som beskrivs mer i detalj någon annanstans. Förbered en 10 millimolar stamlösning av buren molekylära lim länkade dibenzocyclooctyne i torr DMSO. Förbered sedan kvantpricken kopplat bur molekyllim genom att först göra aseye funktionaliserade kvantprickar.För att åstadkomma detta lägga till 100 mikroliter av 125 mikromolar aseye PEG4 NHS ester i DMF till 400 mikroliter av en DMF lösning som innehåller 500 nanomolar av kvantprickar som är belagda med amin funktionaliserad peg. Rör om blandningen i en timme i rumstemperatur. Placera den resulterande lösningen i ett regenererat cellulosamembran och dialysa den i 24 timmar mot 800 ml DMF.Nästa späda stamlösningen av bur molekylära lim länkade dibenzocyclooctyne till 50 mikromolar med DMF och lägga till 200 microliters av det till post dialys lösningen. Rör om blandningen i tre timmar i rumstemperatur. Sedan dialyser den resulterande blandningen i 24 timmar mot 800 ml färsk DMF med hjälp av ett regenererat cellulosamembran med molekylvikten avskuren från 25000.Efter 24 timmar späd den resulterande lösningen till 200 nanomolar med DMF. Upprätthålla mänskliga hepatocellular carcinom HEP3 B-celler i Eagle's minimala väsentliga medium som innehåller 10%FBS under standard odlingsförhållanden. En dag före experimentet utsäde 5000 HEP3 B-celler i 200 mikroliter av kultur medium i varje brunn av en 8 kammarglas slide.Täck sedan täck bilden och placera den i en inkubator i 24 timmar. Nästa dag ta bort odlingsmediet och skölj cellerna två gånger med 100 mikroliter av förvuppvade PBS. Till varje brunn av 8 kammade slide lägga 200 mikroliter av FBS fria medium som innehåller 10 mikromolar av en fluorescerande färgade bur molekylärt lim.Efter inkubering i 3 timmar ta bort odlingsmediet och skölj cellprovet två gånger med 100 mikroliter PBS. För att visualisera endosomerna lägga till 200 mikroliter av kultur media som innehåller 100 nanomolar av en ytterligare röd fluorescerande färgämne som LysoTracker Red. Inkubera det resulterande cellprovet i 20 minuter.Ta sedan bort odlingsmediet och skölj cellprovet två gånger med 100 mikroliter PBS. Därefter retur cellerna till 200 microliters av kulturmedium. Att inducera kärn flyttning av fluorescerande färgade molekyllim placera cellerna under en 100 watt xenon ljuskälla utrustad med en 365 nanometer bandpass filter.Utsätt cellerna för UV-ljus i 2 minuter. Under denna tid hålla kontrollcellen provet utan UV-exponering i mörker. Locket på glassubstraten kan tas bort för effektiv UV-exponering dock försiktighet som långvarig exponering för UV-ljus kan orsaka celldöd.För att visualisera kärnorna tillsätt en mikroliter av Hoeschst-fläcken till odlingsmediet. Inkubera det resulterande cellprovet i 10 minuter. Placera sedan provet på scenen i ett konfokallascanningmikroskop.Spela in mikrografer för fluorescerande färgade molekyllim lim, LysoTracker Red, och nukleära fläcken. Som tidigare visats, utsäde 5000 mänskliga hepatocellular carcinom HEP3 B-celler i varje brunn av en 8 väl kammare slide och kultur under standardförhållanden för 24 timmar. Förse cellproverna med 200 mikroliter av FBS fria odlingsmedium som innehåller det fluorescerande färgade molekyllimlimmet.Inkubera det resulterande cellprovet i 3 timmar. Ta sedan bort odlingsmediet och skölj cellprovet två gånger med 100 mikroliter PBS. Återgå cellerna till 200 mikroliter av odlingsmedium.Sedan föremål för prov confocal laserscanning mikroskopi och spela in mikrografer som beskrivs i den medföljande text protokollet. Som tidigare visat utsäde 5000 mänskliga hepatocellulära carcinom HEP3 B-celler i varje brunn av en 8 väl kammare slide och kultur under standardförhållanden för 24 timmar. Förse cellproverna med 200 mikroliter av FBS fritt odlingsmedium som innehåller 10 nanomolar av det kvantprickade burmolekyllimet.Inkubera det resulterande cellprovet i 3 timmar. Ta sedan bort mediet och skölj cellprovet två gånger med 100 mikroliter PBS. Efter sköljning cellerna tillbaka dem till 200 mikroliter av odlingsmedium.Placera sedan plattan under en 100 watts xenon ljuskälla utrustad med en 365 nanometer bandpass filter. Exponera cellprovet för UV-ljus i 2 minuter med hålla kontrollproverna i mörker. För att visualisera kärnorna lägga 1 mikroliter av Hoechst fläcken till odlingsmediet.Inkubera det resulterande cellprovet i 10 minuter. Sedan bild cellerna med hjälp av en confocal laser scanning mikroskop. Utsäde den mänskliga hepatocellular carcinom HEP3 B-celler dagen före experimentet på 5000 celler per väl in i en 96 väl kultur tallrik.Täck sedan cellerna med 200 mikroliter av odlingsmedia och sedan placera plattan i en inkubator i 24 timmar. Nästa dag ta bort odlingsmediet och skölj cellprovet två gånger med 100 mikroliter PBS. Tillsätt sedan 200 mikroliter av FBS fria odlingsmedium som innehåller det fluorescerande färgade molekylära limmet i koncentrationer från 0,1 till 100 mikromolar.Inkubera plattan i 3 timmar och placera sedan en platta under UV-ljuskällan. Exponera cellprovet för UV-ljus i 2 minuter med hålla kontrollproverna i mörker. Efter UV-exponering vid 10 mikroliter av Cell Counting Kit-8-reagensen mot odlingsmediet och inkubera det resulterande cellprovet i 2 timmar.Läs sedan upptaget av proverna vid 450 nanometer med hjälp av en mikroplattläsare. Innan foto strålning HEP3 B-celler inkuberas med fluorescently färgade bur molekylärt lim utställningar punktat fluorescens utsläpp från det inre en analog mikrograf som visar LysoTracker Red anger att fluorescerande färgade bur molekylärt lim var lokaliserad i endosomes. Följaktligen fluorescens utsläpp assignable till fluorescently färgade bur molekylära lim observerades utanför cellkärnan före UV-strålning.Efter UV-strålning fluorescerande tyder på att fluorescerande färgade bur molekylärt lim var uncaged och migrerade in i cytoplasman och cellkärnan. Sådan kärn- översättning av det fluorescently färgade molekylära limmet kan framkallas platsen selektivt vid 2-photon nära infrarött ljus. Det fluorescerande färgade molekylära limmet i icke bestrålade områden flydde inte från endosomesna och återstod som punctatefluorescens.Dendritiska bur molekylära lim taggar kan också leverera makromolekylära gäster såsom kvantprickar i cellkärnan. Dessa konjugater kan tas upp i cellerna och efter UV-exponering i 2 minuter kan fluorescensutsläppet av kvantprickarna ses inom kärnan. Efter denna utveckling denna teknik banade väg för forskare inom området genterapi att utforska låg biverkning behandling.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Facile och effektiv framställning av Tri-komponent fluorescerande Glycopolymers via RAFT styrda Polymerisation

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiomärkning och kvantifiering av cellulära nivåerna av fosfoinositider från High Performance Liquid Chromatography kopplade Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sekvensering av växt Wall Heteroxylans Använda enzym, Chemical (metylering) och fysiska (masspektrometri, kärnmagnetisk resonans) Tekniker

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Undersökningar på Ga (III) komplex av EOB-DTPA och dess<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radiomärkt Analog

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Karaktärisera elektrontransport genom levande biofilmer

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

Laser-värme och Radiance Spectrometry för studiet av kärnmaterial i villkor simulera en kärnkraftsolyckan

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Upptäckt och enda Cell kvantifiering av metalloxid nanopartiklar med nukleära Microprobe analys

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Kontrollerade Photoredox ringa-öppning polymerisation av O- Carboxyanhydrides medieras av Ni/Zn komplex

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Att uppnå måttligt tryck i slutna kärl med torr-is som en Solid CO2 källa

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Ljus-driven molekylära motorer på ytor för enstaka molekylär avbildning

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...