Name: spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

NanoBio entegrasyonu için Tokyo Üniversitesi Merkezi anıyoruz. Bu eser için genç bilim adamları (B) (26810046) K.O. Grant-in-Aid tarafından desteklenen ve Grant-in-Aid tarafından özel olarak terfi için araştırma (25000005) ta RM sayesinde araştırma bursu Japonya Derneği promosyon, bilim (JSP'ler için kısmen destekleniyor ) genç bilim adamları ve önde gelen Enstitüler (GPLLI) için Program için.

1. hazırlanması konuklar kafeslitutkal-R ile Etiketler
<ol><li>Kafeslitutkal-NBD çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Kafeslitutkal-NBD (Şekil 1) aşağıdaki yordamlar yukarıda açıklanan20sentez.</li>
		<li>Kafeslitutkal-NBD (10 mM) Kuru dimetil sülfoksit (DMSO) içinde stok çözeltisi hazırlamak. Not: stok çözüm karanlıkta saklamak. Çözüm sulu arabellekleri veya hücre kültür medya kullanımı üzerine ile ...

<ol>
	<li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene+therapy+comes+of+age.">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li><li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+for+Cancer:+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going.">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li><li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENE+THERAPY:+Twenty-First+Century+Medicine.">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li><li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences.">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry &amp; Biology. 9, 943-948 (2002).</li><li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus.">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals.">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li><li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Go+in!+Go+out!+Inducible+control+of+nuclear+localization.">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li><li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells.">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li><li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation.">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li><li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanidinium-based+&amp;#34;molecular+glues&amp;#34;+for+modulation+of+biomolecular+functions.">Guanidinium-based &amp;#34;molecular glues&amp;#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li><li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer:+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization.">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li><li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+&amp;#34;Molecular+Glue&amp;#34;+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin.">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &amp;#34;Molecular Glue&amp;#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue:+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids.">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li><li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies.">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+glues+for+manipulating+enzymes:+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues.">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li><li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes.">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li><li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+Photoswitch:+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions.">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li><li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization.">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li><li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+Bioorthogonal+1,3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues.">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li><li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells.">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li><li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue:+Activation+of+Ion+Permeation.">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder.">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li><li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets:+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants.">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li><li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., G&#252;ttler, T., G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes.">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Kl&#225;n, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology:+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy.">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li></ol>

Önceki araştırmalar, ışık tetiklemeli translocation proteinlerin hücre çekirdeği içine kafesli NLS7,8,9kullanılarak elde edilmiştir. Daha önce belirtildiği gibi bu yöntemler NLS öğesini proteinler sitoplazma dahil etmek için ek teknikler gerektirir. Buna ek olarak, bizim kafeslitutkal-R etiketi sadece nükleer translocation fotoğraf kaynaklı aynı zamanda misafir hücresel alımını sağlar. Bu ö...

Genetik bilgi taşıyan, hücre çekirdeği en önemli organellerin hücre altı ilaç dağıtım hedefi farklı gen çoğaltma modülasyon beri biridir ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisinde etkili ve genetik ifadesidir 1,2,3bozuklukları. Gibi nükleer yerelleştirme sinyalleri (NLS)4,5,6 yaygın olarak araştırılması için nükleer teslimat ilaçların peptid konjugasyon Etiketler. Ancak, istenmeyen yan etkileri azaltmak için nükleer translocation kronolojik zamanmekansal kontrolü gereklidir.
Daha önce ışık tetiklemeli translocation proteinlerin hücre çekirdeği içine kafesli NLS7,8,9kullanılarak elde edilmiştir. NLS içine hücre çekirdeği sitoplazmik taşıma proteinleri6bağlama yaparak geçirir. Bildirilen yöntemlerde kafesli NLS taşıyan Konuk proteinler doğrudan mikroenjeksiyon8 tarafından sitoplazma dahil veya genetik kod genişleme teknik9kullanarak hedef hücrelerde dile getirdi. Bu nedenle, hücresel alımı ve nükleer translocation fotoğraf kaynaklı elde edebilirsiniz bir yöntem pratik uygulamalar için avantajlıdır.
Burada, nükleer translocation ışık tetiklemeli dendritik kafesli moleküler tutkal (kafeslitutkal-R, Şekil 1) Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Suda çözünen moleküler tutkallar10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , birden çok Gu+ kolye taşıyan 23 daha önce hangi sıkıca proteinler11,12,13,14,-15uygun geliştirilmiştir, 16,17, nükleik asitler18,19,20, fosfolipid membranlar21ve kil nanosheets22,23 üzerinden Gu+ kolye ve oxyanionic gruplarını temel hedefleri arasında birden fazla tuz köprüleri oluşumu. Kafeslitutkal-R Gu+ kolye bir anyonik photocleavable grup bütrat yerine nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) tarafından korunmaktadır. Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar kapladığı yaşam içine hücreleri ile endositoz've konaklama endosomes (Şekil 2). Photoirradiation, kafeslitutkal-R BANVOC grupları öğesini Konuk göç kolaylaştıran birden çok Gu+ kolye, taşıyan bir kokulum moleküler tutkal (Uncagedtutkal-R) vermeye ayrılır hücre çekirdeği (Şekil 2) tarafından takip sitoplazma. Kafeslitutkal-R etiket UV veya iki fotonlu yakın kızılötesi (Nur) ışık ciddi fototoksisite olmadan maruz kokulum olabilir. Biz spatiotemporally kontrollü nükleer teslimat makromoleküllerin konuklar hem de kuantum nokta (QDs) ve floresan boya (nitrobenzoxadiazole; kullanarak küçük molekül konuklar kafeslitutkal-R etiketlerle göstermek NBD), sırasıyla, örnek olarak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Resim 1: Şematik yapıları kafeslitutkal-r. 9 guanidinium iyon (Gu+) kolyeler kafeslitutkal-r bütrat yerine nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) grubu tarafından korunmaktadır. BANVOC grupları ile UV veya iki fotonlu nur ışık tarafından i ciddi. Kafeslitutkal-R odak özünü nitrobenzoxadiazole (NBD) veya dibenzocylooctyne (DBCO) ile functionalized. Başvuru20izni ile yayımlanmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Resim 2: Işık tetiklemeli nükleer translocation Konuk şematik gösterimi Birleşik bir kafeslitutkal-R etiketiyle. Konuk /kafeslitutkal-R eşlenik yaşam içine alınır endositoz ile hücre. Photoirradiation, kafeslitutkal-R endosomal kaçış tagged Konuk kolaylaştırabilir bir Uncagedtutkal-R etiketi verim kokulum etikettir. Daha sonra tagged Konuk hücre çekirdeği geçirir. Başvuru20izni ile yayımlanmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azide-PEG4-NHS ester</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 ITK</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q21521MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>TOR-3K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>7425-RC25K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-chambered glass substrate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>155411JP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s minimal essential medium (EMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30406.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffer saline (D-PBS)</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>045-29795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Lonza Walkersville</td>
			<td>PA-3015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>H342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Carl-Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td>Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon light source</td>
			<td>Asahi Spectra</td>
			<td>LAX-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax Paradigm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporally controlled nuclear translocation of guests in living cells using caged molecular glues as photoactivatable tags

Hücre çekirdeği en önemli organellerin hücre altı ilaç dağıtım hedefi farklı gen çoğaltma modülasyon beri biridir ve ifade çeşitli hastalıkların tedavisinde etkilidir. Burada, biz ışık tetiklemeli nükleer translocation kullanarak Konuk moleküler tutkal (kafeslitutkal-R) Etiketler olan birden çok guanidinium iyon (Gu+) kolyeler anyonik photocleavable grupla (bütrat yerine korunur, Kafesli göstermek nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar kapladığı yaşam içine endositoz ile hücre ve endosomes içinde kalır. Ancak, photoirradiation, kafeslitutkal-R endosomal kaçış ve konukların sonraki nükleer translocation kolaylaştırır birden çok Gu+ kolye, taşıyan kokulum moleküler tutkal (Uncagedtutkal-R) dönüştürülür. Tagged konuklar hücre çekirdeği tarafından takip sitoplazma içine geçirebilirsiniz bu yana bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici sadece photoirradiated. Kafesli Tutkal-R Etiketler kuantum nokta (QDs) gibi makromoleküllerin Konuklar küçük molekül konuklar yanı sıra teslim edebilirsiniz. Kafesli Tutkal-R Etiketler sadece UV ışık aynı zamanda derin doku nüfuz edebilir iki fotonlu yakın kızılötesi (Nur) ışık ile kokulum olabilir.

Photoirradiation önce onların iç punctate floresan emisyon kafeslitutkal-NBD ile inkübe Hep3B hücreleri sergilenen (λext 488 = nm; Rakamlar 4A ve 4 C, yeşil). Benzer bir test uyarma, 543 üzerine elde edildi kafeslitutkal-NBD endosomes içinde lokalize gösteren nm kırmızı-floresan boya (rakamlar 4B ve 4 C, kırmızı). Buna göre floresans emisyon <sup...

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags at JoVE.com

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Bu iletişim kuralı ışık tetiklemeli nükleer translocation kafesli moleküler tutkal Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici.

Spatiotemporally Photoactivatable etiketleri kafesli moleküler tutkallar kullanılarak canlı hücreler Konuk nükleer Translocation kontrollü

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Bu yöntem, belirli bir hücresel granüler bir ilaç teslim nasıl gibi ilaç teslimat alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, gazın nükleer translokasyonunun ışıkla indüklenebilen olmasıdır. Prosedürü gösteren Rina Mogaki ve Akio Arisaka benim grup yüksek lisans öğrencileri olacaktır.Başka bir yerde daha ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kafesli moleküler tutkal bağlı dibenzocyclooctyne sentezleyerek kuantum nokta bağlantılı kafes moleküler tutkal hazırlamak için. Kuru DMSO'da kafesli moleküler tutkal bağlantılı dibenzocyclooctyne'nin 10 milimolar stok çözeltisini hazırlayın. Sonra ilk aseye fonksiyonel kuantum nokta yaparak kuantum nokta bağlantılı kafesli moleküler tutkal hazırlamak.Bunu başarmak için DMF'de 125 mikromolar aseye PEG4 NHS esterinden 100 mikrolitre, amin fonksiyonel peg ile kaplanmış 500 nanomolar kuantum noktaiçeren bir DMF çözeltisinin 400 mikrolitresine ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca karışımı karıştırın. Elde edilen çözeltiyi rejenere selüloz membranına yerleştirin ve 800 ml DMF'ye karşı 24 saat diyalize alın.Sonraki dmf ile 50 mikromolar için kafesli moleküler tutkal bağlı dibenzocyclooctyne stok çözeltisi seyreltmek ve sonrası diyaliz çözeltisine 200 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında üç saat boyunca karışımı karıştırın. Daha sonra 25000 moleküler ağırlığı kesilmiş bir rejenere selüloz membran kullanarak taze DMF 800 ml karşı 24 saat boyunca ortaya çıkan karışımı diyaliz.24 saat sonra dmf ile 200 nanomolar elde edilen çözelti seyreltmek. Standart kültür koşullarında %10 FBS içeren Eagle'ın minimal esansiyel ortamda insan hepatosellüler karsinomu HEP3 B-hücrelerini koruyun. Bir gün önce deney tohum 5000 HEP3 B-hücreleri kültür 200 mikrolitre 8 odalı cam slayt her kuyuiçine.Sonra slayt kapağı ve 24 saat boyunca bir kuvöz içine yerleştirin. Ertesi gün kültür ortamını kaldırın ve hücreleri önceden ısıtılmış 100 mikrolitre pbs ile iki kez durula. 8 odalı slayt her kuyuiçin bir floresan boyalı kafesli moleküler tutkal 10 mikromografi içeren FBS serbest orta 200 mikrolitre ekleyin.3 saat kuluçkadan sonra kültür ortamını çıkarın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durula. Endozomları görselleştirmek için LysoTracker Red gibi ek bir kırmızı floresan boya 100 nanomolar içeren kültür medya 200 mikrolitre ekleyin. Ortaya çıkan hücre örneğini 20 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra kültür ortamını çıkarın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durulayın. Daha sonra hücreleri kültür ortamının 200 mikrolitresine geri döndürün. Floresanboya ile dolmuş kafesli moleküler yapıştırıcının nükleer translokasyona neden olması için hücreleri 365 nanometre bandpass filtreyle donatılmış 100 watt'lık bir kson ışık kaynağının altına yerleştirin.Hücreleri 2 dakika UV ışığına maruz bırakın. Bu süre boyunca karanlıkta UV maruz kalmadan kontrol hücresi örneğini tutun. Cam yüzeylerin kapağı verimli UV ışınlarına maruz kalmak için çıkarılabilir ancak UV ışığına uzun süre maruz kalma hücre ölümüne neden olabileceğinden dikkatli olun.Çekirdekleri görselleştirmek için kültür ortamına bir mikrolitre Hoeschst lekesi ekleyin. Ortaya çıkan hücre örneğini 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra örneği bir konfokal lazer tarama mikroskobu sahnesine yerleştirin.Floresan boyalı kafesli moleküler tutkal, LysoTracker Kırmızı ve nükleer leke için mikrograflar kaydedin. Daha önce gösterildiği gibi, tohum 5000 insan hepatosellüler karsinom HEP3 B-hücreleri her kuyu içine 8 kuyu odası slayt ve kültür standart koşullar altında 24 saat. Hücre örneklerini floresan boyalı kafesli moleküler tutkal içeren 200 mikrolitre FBS serbest kültür ortamı ile tedarik edin.Ortaya çıkan hücre örneğini 3 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra kültür ortamını çıkarın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durulayın. Hücreleri 200 mikrolitre kültür ortamına döndürün.Daha sonra örnek konfokal lazer tarama mikroskobu tabi ve eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi mikrograflar kaydedin. Daha önce gösterildiği gibi tohum 5000 insan hepatosellüler karsinom HEP3 B-hücreleri her kuyu içine 8 kuyu odası slayt ve kültür standart koşullar altında 24 saat. Hücre örneklerini 200 mikrolitre FBS serbest kültür ortamı içeren kuantum nokta bağlantılı kafesli moleküler tutkal 10 nanomolar ile tedarik edin.Ortaya çıkan hücre örneğini 3 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra orta yıkın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durulayın. Duruladıktan sonra hücreler 200 mikrolitre kültür ortamına geri dönerler.Daha sonra plakayı 365 nanometre bandpass filtreile donatılmış 100 watt'lık bir xenon ışık kaynağının altına yerleştirin. Kontrol örneklerini karanlıkta tutarak hücre örneğini 2 dakika UV ışığına maruz bırakın. Çekirdekleri görselleştirmek için kültür ortamına 1 mikrolitre Hoechst lekesi ekleyin.Ortaya çıkan hücre örneğini 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra hücreleri bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntü. Tohum insan hepatosellüler karsinom HEP3 B-hücreleri bir gün önce deney de 5000 hücreleri de bir 96 iyi kültür plaka içine.Daha sonra 200 mikrolitre kültür ortamı ile hücreleri kaplayın ve sonra 24 saat boyunca bir kuvözde plaka yerleştirin. Ertesi gün kültür ortamını çıkarın ve hücre örneğini 100 mikrolitre PBS ile iki kez durula. Daha sonra 0,1 ila 100 mikromolar arasında değişen konsantrasyonlarda floresan boyalı kafesli moleküler tutkal içeren FBS serbest kültür ortamı 200 mikrolitre ekleyin.3 saat boyunca plaka kuluçka ve sonra UV ışık kaynağı nın altına bir plaka yerleştirin. Kontrol örneklerini karanlıkta tutarak hücre örneğini 2 dakika UV ışığına maruz bırakın. Hücre Sayma Kiti-8 reaktifinin 10 mikrolitresinde UV maruziyetini takiben kültür ortamına ve ortaya çıkan hücre örneğini 2 saat kuluçkaya yatırın.Sonra bir mikroplaka okuyucu kullanarak 450 nanometre de örneklerin emilimini okuyun. Fotoğraf radyasyonu HEP3 B-hücreleri floresan boyalı kafesli moleküler tutkal ile kuluçkadan önce iç floresan emisyon punctate lysoTracker Kırmızı gösteren benzer bir mikrograf floresan boyalı kafesli moleküler tutkal endozozos lokalize olduğunu gösterir. Buna göre floresan boyalı kafesli moleküler tutkal atayan floresan emisyon UV radyasyonu öncesinde hücre çekirdeği dışında gözlenmiştir.UV radyasyonundan sonra floresan boyalı kafesli moleküler yapıştırıcının kafessiz olarak sitoplazmaya ve hücre çekirdeğine geçirilir. Floresan boyalı kafesli moleküler tutkal böyle bir nükleer çeviri kızılötesi ışık yakın 2-foton tarafından seçici site indüklenebilir. Floresan boyalı kafesli moleküler tutkal ışınsız alanlarda endozoslardan kaçmadı ve floresan delinme olarak kaldı.Dendritik kafesli moleküler tutkal etiketleri de hücre çekirdeğiiçine kuantum nokta gibi makromoleküler misafirler sunabilir. Bu konjugates hücrelere alınabilir ve UV maruziyetinden sonra 2 dakika boyunca kuantum noktalarının floresan salınımı çekirdeğin içinde görülebilir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, gen terapisi alanında araştırmacıların düşük yan etki tedavisini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

RAFT kontrollü Polimerizasyon yoluyla Tri-bileşenli Floresan Glycopolymers uyduruk ve Etkin Hazırlık

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

EOB-DTPA ve Ga (III) Complex Araştırmalar Onun<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radyoaktif Analog

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Elektron taşıma yaşayan biyofilmler ile karakterize

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Laser-heating and Radiance Spectrometry for the Study of Nuclear Materials in Conditions Simulating a Nuclear Power Plant Accident

Lazer-Isıtma ve bir nükleer santral kazası simüle Radiance spektrometresi çalışma koşullarında nükleer malzeme için

Major and severe accidents have occurred three times in nuclear power plants (NPPs), at Three Mile Island (USA, 1979), Chernobyl (former USSR, 1986) and ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Photoredox yüzük-açılış polimerizasyon O- Carboxyanhydrides Ni/Zn kompleksleri tarafından aracılı ile kontrol

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Kuru buz katı CO2 kaynak olarak kullandığını mühürlü damarlarının Orta basınç elde

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Işık odaklı moleküler motorlar yüzeylerde tek moleküler görüntüleme için

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...