Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

ونعترف مع الامتنان الدعم المالي لهذا المشروع "ستيفتونغ فولكس واجن" (منحة رقم 89 883) و "مجلس البحوث الأوروبي" (اتفاق منحة رقم 694410-عدنا). س. م. س. وتسلم الدعم المقدم من DFG من خلال GRK 2062.

ملاحظة: يرد جدولاً زمنياً للخطوات المذكورة في الأقسام المختلفة في المعلومات التكميلية (القسم 1).
1-رقاقة تلفيق
ملاحظة: كركائز، استخدام رقائق السليكون (بقطر 100 ملم، والسماكة مم 0.525) مع طبقة سميكة 50 نانومتر من ثاني أكسيد السيليكون أو الشرائح الزجاجية (24 ملم × 24 مم، ?...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

الطباعة الحجرية بيفر تقنية قوية وتنوعاً لتجميد منقوشة من الحمض النووي الريبي أو. حتى الآن، الإجراء الذي يتضمن العديد من الخطوات، التي-إذا تغيرت--يمكن أن تكون مصدرا للفشل أو تخفيض أداء النظام.
هو خطوة حاسمة في تصنيع رقائق بيفوري بيجيلاتيون الركازة، الذي يوفر في توافق مع الحي...

الخلية الحرة التعبير الجيني ردود الفعل ذات أهمية كبيرة لمختلف التطبيقات في الكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية. وكان التعبير الخلية خالية من البروتينات مفيدة لإعداد عينات البروتين النقي، التي كانت الأساس للعديد من الدراسات في علم الأحياء الهيكلية. على سبيل المثال، نظم خالية من الخلية بنجاح واستخدمت للتعبير عن البروتين المجمعات1 أو غشاء بروتينات2، التي يصعب أن تنتج باستخدام تعبير يستند إلى الخلية. جدير بالذكر أن الخلية خالية من التعبير الجيني ردود الفعل واستخدمت أيضا توضيح بنية الشفرة الجينية، بدءاً من التجارب الرائدة واسطة Nirenberg ومأتى في عام 19613.
في الآونة الأخيرة، كان هناك اهتمام جديد بأساليب الخلية الحرة في مجال التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية4،،من56. ويمكن زيادة أنظمة الخلية خالية مع المركبات غير البيولوجية، ومكونات أصل بيولوجي متنوعة يمكن دمجها بسهولة أكبر7. على الرغم من أن أنظمة الخلية الحرة قد عيب واضح أن لم يفعلوا "تنمو وتقسيم"، تصور لإعداد مفتوحة المفاعلات الحيوية الخلية خالية مع الوظائف الأيضية الأساسية والسماح لهم بتجميع نواتج الأيض عند تزويدها بالطاقة والكربون بسيطة 8من المدخلات. في هذا المجال الناشئ من البيولوجيا التركيبية، وعد أنظمة الخلية الحرة لتكون أكثر قابلية للتنبؤ "هيكل" للتنفيذ الوظائف البيولوجية الاصطناعية.
حاليا، وردود فعل التعبير الجيني الخلية الحرة تنفذ أما باستخدام الخلية مقتطفات (من مصادر مختلفة مثل البكتيريا والخميرة والحشرات)، أو نظم الترجمة/النسخ التي تم الأمثل لتطبيقات مختلفة (مثلاً، بدائية مقابل التوكسينات التعبير الجيني، إنتاج بروتينات الغشاء، إلخ). بروتوكول شعبية للتحضير لاستخراج الخلايا البكتيرية (يسمى عادة تكستل) قدمت مؤخرا نويرو خامسا وزملاء العمل9. خصائصه الفيزيائية تتميز دقيق10، والنظام تكستل بالفعل استخدمت بنجاح لتنفيذ سلسلة من المهام المعقدة البيوكيميائية: مثلاً، جمعية bacteriophages الوظيفية عن طريق الخلية الحرة التعبير عن الجينوم بالعاثية11أو تخليق البروتين البكتيري خيوط12تنفيذ الجين الخلية الحرة الدوائر13،14.
نظام آخر شعبية في البيولوجيا التركيبية الخلية الحرة هو نظام الصرفة، التي يتم تشكيلها من مكونات المنقي15،16. مقارنة بنظام تكستل، أنه لا يحتوي على نوكليسيس أو إليه تدهور البروتين. بينما تدهور خطي الحمض الخلوي الصبغي، جزيئات الرنا أو البروتينات أقل من قضية في نظام الصرفة، ومسارات تسوس هامة فعلا لتنفيذ مهام الديناميكية. من أجل التقليل من تأثير تدهور [ااكسونوكلس] قوالب الجينات الخطي في النظام تكستل (عن طريق ريكبكد)، قد البروتين التجمع حماية نهاية المراد إضافتها. تكستل ونظام الصرفة متوفرة تجارياً.
موضوع ارتباطاً وثيقا بشواغل بيولوجيا الخلية الحرة دراسة أثر التقسيم في التفاعلات الكيميائية الحيوية، وكذلك إنشاء هياكل تشبه الخلية الاصطناعية أو بروتوسيلس17،18،19 ،20. البحث عن خلايا اصطناعية ينطوي عادة على تغليف نظام رد الفعل البيوكيميائية داخل مقصورات حويصلية مصنوعة من فوسفوليبيدات أو أمفيفيليس أخرى. بينما مثل هذه الأنظمة تساعد على استكشاف الجوانب الأساسية للتقسيم، أو ظهور سيلولاريتي وهياكل ذاتية، يواجهون مشاكل نموذجية من النظم المغلقة: في غياب الأيض بالأداء والمناسبة غشاء آليات النقل، من الصعب أن تبقى مجزأة ردود الفعل قيد التشغيل لفترات طويلة من الزمن--تستخدم جزيئات الوقود وتتراكم النفايات.
بديل لاهتمام للتجزيء داخل هذه المقصورات محاكاة الخلية هو تنظيم المواد الجينية باستخدام أساليب فوتوليثوغرفيك المكانية. التثبيت من "الجينات على رقاقة" كان رائدا من قبل فريق بار-زيف في معهد وايزمان منذ أكثر من عشر سنوات21. وكان من بين القضايا الرئيسية التي يتعين حلها الامتزاز غير محددة من الحمض النووي وتمسخ المحتملة من البروتينات على سطح الرقاقة. شريط-زيف et al. وضعت مقاومة التصويرية مخصص يسمى "زهرة الأقحوان"، الذي كان يتألف من رد الفعل سيلاني الطرفية للتثبيت جزيئات مقاومة على الأسطح ثاني أكسيد السيليكون، فاصل طويل البولي إثيلين غليكول (شماعة) التي أكدت توافق مع الحياة، وهيدجروب فوتوكليفابل، التي تم تحويلها إلى أمين رد الفعل عند التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية). فقد ثبت أنه يمكن استخدام ديزي شل طول الجينات جزيئات الحامض النووي (مع أطوال عدة كيلو قاعدة أزواج (kbp)) على سطح رقاقة. من وجهة نظر فيزياء البوليمرات، تمثيل النظم فرش البوليمرات المطعمة على ركيزة صلبة. نظراً لطبيعة بولييليكتروليتي الحمض النووي، تكيف هذه الفرش تأثرا شديدا ناضح وغيرها من الآثار الخاصة بايون،من2223.
الأهم من ذلك، فقد ثبت أن جينات معطلة الركيزة فعالة ويمكن أن يدون وترجمتها إلى الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات. فرش الجينات موجوداً لرنا بولمرس من حل24، وهو خليط الجزيئات المعقدة للترجمة/النسخ لا التشويه والتحريف في السطح. إحدى الميزات للتثبيت مكونات الوراثية على الركازة هو أن أنها يمكن أن تعمل في إطار نظام مفاعل موائع جزيئية مفتوحة التي يتم توفيرها بشكل مستمر مع جزيئات صغيرة السلائف ومن منتجات النفايات التي يمكن أن تكون إزالة25 , 26.
ونحن مؤخرا بوضع البديل من هذا الأسلوب الذي يطلق عليه بيفوري (لشعاع الإلكترون متوافق حيويا ومقاوم الضوء)27، التي تستند حصرا إلى المكونات المتاحة تجارياً والمستخدمة الخاصة بتسلسل الحمض النووي حبلا ردود الفعل للغزو أعمال الطباعة الحجرية متعددة الخطوات البسيطة لتنفيذ إجراء لإنشاء خلايا اصطناعية القائم على رقاقة. ويرد في الشكل 1نظرة تخطيطية للإجراء. ويستند على الحمض النووي دبوس الجزيئات التي تحتوي على مجموعة فوتوكليفابل، التي هي معطلة على طبقة شماعة متوافق حيويا. فوتوكليفاجي دبوس الكشف عن تسلسل تويهولد واحد-الذين تقطعت بهم السبل، من خلال الحمض النووي الذي يمكن جزيئات فائدة (التي تحتوي على تسلسل ديس "إلى تشريد") المرفقة عن طريق غزو حبلا تويهولد بوساطة.
في حين يحتمل أن تكون أبسط لتنفيذ بيفر، ديزي يسمح أعمال كثيفة جداً ونظيفة "فرش الجينات"، التي لديها مزايا في تطبيقات معينة. من حيث المبدأ، ولكن الطباعة الحجرية ديزي وبيفوري يمكن بسهولة دمج. أسلوب الطباعة الحجرية ذات الصلة استخدام فرش التشرد حبلا الحمض النووي لهيكلة الحمض النووي في الذهب وقد وضعته سابقا هوانغ et al.، ولكن لم تستخدم في سياق تعبير الجينات الخلية الحرة28،29.
في البروتوكول التالي نقدم وصفاً مفصلاً لإنتاج الحمض النووي فرش للتعبير الجيني خالية من الخلية باستخدام الأسلوب بيفوري. يصف لنا كيف رقائق المورثات ملفقة وإثبات استخدام صور متعددة خطوة-الطباعة الحجرية للتثبيت مكانياً منظم للجينات على شريحة. نناقش أيضا تلفيق رد فعل الدوائر وتطبيق ميكروفلويديكس للقيام بردود فعل التعبير الجيني على شريحة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

يسمح التثبيت جينات على السطوح ليثوجرافيكالي منظم دراسة الجينات المجزأة عمليات التعبير في نظام مفاعل حيوي موائع جزيئية مفتوحة. على النقيض من النهج الأخرى نحو النظم الخلوية مصطنعة، يسمح هذا إعداد لإمداد متواصل مع الكواشف التعبير الجيني وتجفيف متزامنة من منتجات النفايات. وهذا يسهل تنفيذ عمليات التعبير الجيني الخلية الحرة على مدى فترات طويلة من الزمن، هو أمر مهم لتحقيق نظم التغذية المرتدة التنظيمية الجينات الحيوية. هنا نقدم بروتوكول مفصل لتلفيق الوراثية بيوتشيبس استخدام بسيط باستخدام معدني أسلوب استناداً إلى ردود فعل التشرد حبلا الحمض النووي، الذي يستخدم حصرا المكونات المتوفرة تجارياً. نحن نقدم أيضا بروتوكول على إدماج الجينات المجزأ مع بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)-على أساس نظام موائع جزيئية. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أن النظام متوافق مع انعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية، التي يمكن أن تستخدم للمراقبة المباشرة للتفاعلات الجزيئية بين الحمض النووي والجزيئات الواردة في مزيج التعبير.

الطباعة الحجرية خطوتين: يبين الشكل 5 نتيجة لعملية من خطوتين معدني على شريحة زجاجية مع تداخل أنماط من خيوط ديس المسمى فلوريسسينتلي.
التعبير بروتين فلوري من فرشاة جينات: الشكل 6 يوضح التعبير عن البروتين الفل?...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

يصف لنا إجراء معدني بسيط للتثبيت جزيئات الحمض النووي الجيني-طول على سطح، التي يمكن استخدامها للقيام بتجارب تعبير الجينات الخلية الحرة في بيوتشيبس.

تجميد سطح الوظيفية للجينات باستخدام الطباعة الحجرية التشرد حبلا متعددة الخطوات

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

الدنا biochips هي منصة بحثية جذابة للبيولوجيا الذاتي إعادة التركيبية، وضعت أصلا من قبل مجموعة BASF، والذي يسمح لتشغيل الدوائر الجينية في المختبر على مدى فترات طويلة من الزمن. ومن خلال هذا البروتوكول، نأمل أن نجعل هذه التكنولوجيا متاحة لمجموعة أوسع من الباحثين. وتمثل طريقتنا، التي يطلق عليها "الطباعة الحجرية" "Bephore"، استراتيجية لشل حركة الحمض النووي استناداً إلى تفاعل إزاحة حبلا الحمض النووي.تكمن قوة هذه التقنية في قدراتها الحجرية متعددة الخطوات ، وقابلية تكرارها البسيطة ، والتوافر التجاري لجميع المكونات. على غرار حلول التراكم الأحيائي الأخرى، يمكن الجمع بين البيفور والتكنولوجيات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن تجميع فرش الجينات الوظيفية داخل مقصورات صغيرة للتعبير البروتيني.للبدء، إعداد خليط RCA عن طريق خلط خمسة أجزاء من الماء مع جزء واحد من محلول الأمونيا 30٪ في كوب زجاجي. سخني الخليط إلى 70 درجة مئوية على طبق ساخن أثناء التحريك. بمجرد أن تصل إلى 70 درجة مئوية، إضافة جزء واحد 30٪ بيروكسيد الهيدروجين.ثم ضع رقاقة سيليكون قطرها 100 ملليمتر في المحلل ، لإزالة المواد العضوية والجسيمات منه. بعد 30 دقيقة ، أخرج الركيزة ، اشطفها جيدًا بالماء من زجاجة غسيل ، وجففها ببندقية النيتروجين. المضي قدما على الفور مع PEGylation الركيزة.لتحقيق ذلك، أولا تخفيف البيوتين-PEG-سيلان في toluene الجافة إلى 5 ملليغرام لكل ملليلتر، ودوامة الحل حتى يتم خلطها بشكل جيد. مع الركيزة وضعت في طبق بيتري الزجاج، ماصة ببطء الحل على الركيزة، وتغطي السطح كله، ولكن تجنب السماح للمحلول بالتدفق على الحافة. بمجرد تغطية السطح، أغلق طبق بيتري، ثم أضف غطاء إضافي.بعد 30 دقيقة، وإزالة الغطاء، وإضافة ما يقرب من 40 ملليلتر من الكحول الأيزوبروبيل إلى طبق بيتري. ثم أخرج الركيزة، شطف مرة أخرى تماما مع الكحول ايزوبروبيل، وتجفيفه مع بندقية النيتروجين. عندما تجف، تخزين الركيزة في الظلام حتى الحاجة إليها.إعداد الركيزة باستخدام قاطع الزجاج أو مشرط لتشكيل سنتيمتر واحد في قطعة سنتيمتر واحد. ثم، إضافة علامة محاذاة بسيطة عن طريق جعل الصفر قصيرة من المركز نحو حافة الركيزة. انفخ أي جزيئات صغيرة من الرقاقة باستخدام مسدس النيتروجين.بعد ذلك، اخلطي قطرتين من غراء سيليكون مكونين، وطبق الغراء على سطح الشريحة، تاركا المنطقة المحيطة بطرف الخدش فارغا. هناك الغراء يوفر حاجز رهاب الماء، والحفاظ على حلول مائي على رقاقة. وهذا يسهل خطوات الغسيل اللاحقة، ويقلل من كمية الحمض النووي المطلوبة للحضانات.في خطوة لاحقة، يمكن بسهولة مقشر الغراء قبالة. في الخطوات التالية، يتم التعامل مع الحمض النووي القابل للضوء فقط في بيئة الضوء الأصفر. غطي الرقاقة بنحو 10 ميكرولترات من خليط bephore في درجة حرارة الغرفة، ووضع الشريحة في مربع مملوءة جزئيا بالماء للحد من التبخر.بعد ساعة واحدة، وغسل رقاقة عدة مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي مزيج غير منضم bephore. بعد ذلك، أضف 10 ميكروليترات من مزيج التخميل إلى الشريحة. بعد ساعتين، قم بغسل الشريحة عدة مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة عوامل التخميل غير المنضمة.قص قناع صورة مطبوعة إلى الحجم المناسب من أجل احتواء حامل قناع مناسب. إدراجه في موضع توقف الحقل، واستخدام علامات المحاذاة لمحاذاة القناع في الحامل. مع الركيزة وضعت على مرحلة المجهر، إدراج مرشح أحمر في مسار الإضاءة، والتركيز على سطح الركيزة.ثم انتقل إلى منطقة الركيزة التي سيتم كشفها. بعد ذلك، أدخل حامل القناع، ومنع الإضاءة، وتغيير إلى مرشح الأشعة فوق البنفسجية. في شدة الإضاءة المنخفضة، افتح الغالق واستخدم الكاميرا للتركيز بسرعة على القناع على الركيزة.مع الركيزة الانحياز الآن والقناع في التركيز، ومنع مسار الضوء إلى الكاميرا، وإضاءة الركيزة في شدة الضوء عالية لوقت التعرض المطلوب. بعد التعرض، وإزالة العينة من المجهر، وإزالة بعناية أكبر قدر ممكن من العازلة من الركيزة دون تجفيفه. ثم، إضافة 10 إلى 20 ميكرولترات من الحمض النووي مع تسلسل للتعلق إلى السطح.ضع الركيزة في صندوق رطب لمنعه من التجفيف ، واحتضان الحمض النووي على الركيزة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. من أجل مراقبة التعبير الجيني المجزأ على مجهر مقلوب ، أولاً إعداد بشكل منفصل جزأين من حامل العينة. ابدأ بلصق شريحة من الـ bephore بفرشاة جين معطلة على حامل الشريحة، باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجهين.بعد ذلك، إضافة بعض الشحوم حول فراغ ثقب المركزية من الجزء السفلي من حامل، وإدراج حامل رقاقة. الآن تجميع الجزء العلوي من حامل. قطع رقاقة PDMS رقيقة مع مقصورات صغيرة قدر الإمكان، وترك قناة مفتوحة إلى جانب واحد للسماح في وقت لاحق لتبادل النفايات والجزيئات السلائف عن طريق نشر التالي، البلازما علاج زلة غطاء زجاجي في الجانب الخلفي من رقاقة PDMS مع بلازما الأكسجين.بعد العلاج مباشرة، ضع شريحة PDMS في وسط الشريحة الزجاجية، مع توجيه المقصورات لأعلى. ثم، خبز الزجاج مع PDMS لمدة ساعة واحدة في 70 درجة مئوية. قبل وقت قصير من تجميع حامل العينة بأكملها، البلازما علاج الشريحة الزجاجية مع رقاقة PDMS كما كان من قبل.ثم، إضافة بعض الشحوم فراغ حول ثقب كبير من حامل أعلى، ووضع الشريحة الزجاجية مع PDMS على ذلك. اضغط بلطف على الزجاج على الشحوم. إزالة المخزن المؤقت بعناية من رقاقة، وغسلها مرة واحدة مع 10 ميكرولترات من نظام إعادة التعبير الذاتي.بعد ذلك، إضافة 60 ميكرولترات من نظام إعادة التعبير الذاتي على رقاقة، وإزالة الغراء سيليكون مكونين من الحواف. الآن، إضافة 20 ميكرولترات من نظام التعبير إلى PDMS. بعد وضع القطرة على PDMS ، تحقق بسرعة في المجهر المجسم أن المقصورات رطبة بشكل جيد وبدون فقاعات الهواء.إذا كان هناك فقاعات الهواء، في محاولة لغسلها بعيدا. لتجميع قطعتين من حامل، ومحاذاة الغرف وفرش الحمض النووي، والعمل تحت المجهر مجسمة. قم بشل حامل القاع بذراع ممسكة بحيث يمكن الوصول بسهولة إلى المسمارين والجناحين بكلتا يديه.إدراج حامل أعلى في حامل أسفل، وخفضه حتى الخلايا خالية من نظام التعبير الصمامات. ثم تحقق للتأكد من أن المقصورات وعلامة المحاذاة في منطقة مشابهة في مستوى XY. من أسفل، المسمار حتى wingnuts حتى أنها تلمس الجانب السفلي من حامل.أثناء محاذاة المقصورات والرقاقة في الطائرة XY، قم بتشدّد الجناحين برفق. هذه الخطوة تتطلب بعض الخبرة، ويعتمد على بناء حامل العينة. يجب الضغط على PDMS على الشريحة فقط بقوة لطيفة.بعد ذلك، رش إسفنجة في حاوية مضادة للتبخر بالماء، وأدخل الحامل في الصندوق. ثم، ملء حقنة خمسة ملليلتر مع اثنين من مكونات السيليكون الغراء، واستخدامها لختم مربع. وأخيرا، نقل مربع إلى مجهر درجة الحرارة التي تسيطر عليها، وصورة فرشاة الحمض النووي والتفاعل باستخدام المجهر الفلوريس.عملية حجرية من خطوتين، يتم تنفيذها هنا على شريحة زجاجية من نوع bephore، تسفر عن أنماط متداخلة من خيوط الحمض النووي المسمى الفلورسنت. في هذه المظاهرة للتعبير الجيني على رقاقة، يتم شل الحمض النووي في الغرفة على اليسار. عندما يتعرض لمزيج التعبير، يتم تصنيع البروتين الفلورسنت الأصفر YPet من الحمض النووي غير المُشلَّل.لتقييم نشاط نظام التعبير الجيني ، يلاحظ استرداد الفلوريس بعد خطوة التبييض. في ساعتين، تعافت شدة الفلوريسنسي بسرعة. ومع ذلك، بعد أربع وست ساعات، فإنه لم يتعافى، مشيرا إلى أنه من دون إمدادات جديدة من مزيج التعبير، توقف التفاعل حول ساعة أربعة.وعلى الرغم من أن التعبير الجيني محدود في نظام مغلق، إلا أنه يمكن الحفاظ عليه على مدى فترات زمنية أطول من خلال تزويد مقصورات التعبير بجزيئات السلائف الإضافية عن طريق السوائل الدقيقة. طريقة bephore يستخدم لشل oligonucleotides أو الحمض النووي طول الجينات، والتي يمكن تطبيقها لبناء نظم من فرش الحمض النووي التفاعل للتعبير الذاتي إعادة الجينات. ويمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتطبيقات أخرى في الفيزياء الحيوية، مثل دراسات الفلور الجزيء المفرد.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرة على تصنيع البيوت bephore من رقائق أو الشرائح الزجاجية، ودمجها في مشاريع البحوث الخاصة بك.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

توليد الأنسجة الانحياز عضلة القلب من خلال طباعة وظيفية Microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

نظام العلاج الروبوتية مرآة للانتعاش وظيفية للأسلحة مفلوج

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

تطوير Biosensor الكهروكيميائية الحمض النووي للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

تخطيط الاشعه الايونيه المركزة لحفر نانو-البنيات في ميكرواقطاب

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

الدماغ تدفق الدم القائم على الراحة الدولة الاتصال الوظيفي للدماغ البشري باستخدام الطيف ية الارتباط المنتشر البصري

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

التوصيف الكمي واللثي للأكياس الظهارية الظهارية الوظيفية والمستقطبة

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

محاكاة حيوية النسخ المتماثل من الجذر السطح المجهري باستخدام تغيير من الطباعة الحجرية لينة

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...