Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Vi parlamentsarbejdet finansiel støtte til dette projekt af Volkswagen Stiftung (grant nr. 89 883) og det Europæiske Forskningsråd (grant aftale nr. 694410 - AEDNA). M.S.-S. anerkender støtte af DFG gennem GRK 2062.

Bemærk: En tidsplan for foranstaltninger i de forskellige sektioner er givet i de supplerende oplysninger (afsnit 1).
1. hak fabrikation
Bemærk: som substrater, brug silicium wafers (100 mm i diameter, 0.525 mm tykkelse) med en 50 nm tykke lag af siliciumdioxid eller glas dias (24 mm x 24 mm, no. 1,5; 22 mm x 50 mm, nr. 4). Afhængigt af programmet, kan andre størrelser og tykkelser være mere egnet.
<ol><li>Rengøring af substrater via en RCA ren proc...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

Bephore litografi er en robust og alsidig teknik for den mønstrede immobilisering af DNA eller RNA. Endnu, proceduren, der omfatter flere trin, som - hvis ændret - kan være en kilde til fejl eller reduceres systemets ydeevne.
Et afgørende skridt i fabrikation af Bephore chips er PEGylation af substrat, som giver biokompatibilitet af overfladen. Her er trinnet rengøring med en RCA procedure vigtigt, da det også aktiverer overflade for den efterfølgende silanisering. Under den faktiske PE...

Celle-gratis genekspression reaktioner er af stor interesse for forskellige anvendelser i biokemi, bioteknologiske og syntetisk biologi. Celle-fri udtryk for proteiner var medvirkende til fremstilling af ren protein prøver, som blev grundlaget for talrige undersøgelser i strukturbiologi. For eksempel, blev celle-fri systemer med succes brugt til udtryk for protein komplekser1 eller membran proteiner2, som er vanskelige at producere ved hjælp af celle-baseret udtryk. Navnlig, celle-fri genekspression reaktioner blev også brugt til at belyse strukturen af den genetiske kode, begyndende med de banebrydende eksperimenter af Nirenberg og Matthaei i 19613.
For nylig har der været en fornyet interesse i celle-gratis metoder inden for bioteknologi og syntetisk biologi4,5,6. Celle-fri systemer kan være forøget med ikke-biologiske forbindelser, og komponenter af forskellige biologiske oprindelse kan kombineres flere uden sammenligning7. Selv om celle-fri systemer har den tilsyneladende ulempe, at de ikke "vokse og dele", er det tænkeligt at forberede åben celle-fri bioreaktorer med grundlæggende metaboliske funktioner og lad dem syntetisere metabolitter når forsynet med enkel kulstof og energi indgange8. Inden for det nye syntetiske biologi lover celle-fri systemer at være en mere forudsigelig "kabinet" for gennemførelsen af syntetiske biologiske funktioner.
I øjeblikket, celle-fri gen expression reaktioner foretages enten ved hjælp af celle ekstrakter (fra forskellige kilder såsom bakterier, gær, insekter), eller omskrivning/oversættelse systemer, som var optimeret til forskellige applikationer (f.eks. prokaryote vs eukaryotisk genekspression, produktion af membranproteiner, osv.). En populær protokol til forberedelse af bakteriel celle ekstrakt (almindeligvis kaldt TXTL) blev leveret for nylig af V. Noireaux og kolleger9. Dens biofysiske egenskaber har været grundigt karakteriseret10, og TXTL systemet har været allerede anvendt med succes til at udføre en række komplekse biokemiske opgaver: fx samling af funktionelle Bakteriofager via celle-fri udtryk for phage genom11, syntesen af bakteriel protein filamenter12eller gennemførelsen af celle-fri gen kredsløb13,14.
Et andet system populære i celle-fri syntetisk biologi er den rene system, som er fremstillet af renset komponenter15,16. I forhold til TXTL systemet, indeholder det ikke nukleaser eller protein nedbrydning maskiner. Mens nedbrydning af lineære DNA er RNA molekyler eller proteiner mindre af et problem i den rene system, henfald veje er faktisk vigtigt for gennemførelsen af dynamiske funktioner. For at reducere effekten af exonuclease nedbrydning af lineære gen skabeloner i TXTL systemet (gennem RecBCD), har beskyttelse af slutningen GamS protein at blive tilføjede. Både TXTL og den rene system er kommercielt tilgængelige.
Et emne beslægtet nært med celle-fri biologi bekymringer undersøgelse af effekten af opdelingen på biokemiske reaktioner, og yderligere at skabe kunstige celle-lignende strukturer eller protocells17,18,,19 ,20. Forskning på kunstige celler involverer typisk indkapsling af en biokemisk reaktion system indersiden af vesikulære segmenter fremstillet af fosfolipider eller andre amphiphiles. Mens sådanne systemer hjælpe med at udforske fundamentale aspekter af opdelingen eller fremkomsten af celleforandringer og selvkopierende strukturer, de står over for de typiske problemer af lukkede systemer: i mangel af en fungerende stofskifte og passende membran transportmekanismer, det er svært at holde opdelte reaktioner kørende i længere tid - brændstof molekyler er brugt op og affaldsstoffer akkumulere.
Et interessant alternativ til opdelingen i sådan celle-efterligne rum er den rumlige organisering af genetisk materiale ved hjælp af photolithographic metoder. Immobilisering af "gener på en chip" var banebrydende ved Bar-Ziv-gruppen på Weizmann-instituttet for mere end ti år siden21. Blandt de store spørgsmål, der skulle løses var uspecifikke adsorption af DNA og den potentielle denaturering af proteiner på chip overflade. Bar-Ziv et al. udviklet en dedikeret fotolitografi modstå betegnes "Daisy", som var sammensat af en reaktiv terminal silan for immobilisering af modstå molekyler på siliciumdioxid overflader, en lang polyethylenglycol (PEG) spacer, der forsikrede biokompatibilitet, og en photocleavable headgroup, som blev omdannet til en reaktiv Amin ved bestråling med ultraviolet (UV) lys. Det har vist sig at Daisy kan bruges til at immobilisere gen-længde DNA molekyler (med længder af flere kilo-basepar (kbp)) på en chip overflade. Fra en polymer fysik synspunkt repræsenteret systemerne polymer pensler podet på et fast underlag. På grund af DNA polyelectrolyte karakter er kropsbygning af disse pensler stærkt påvirket af osmotisk og andre ion-specifikke effekter22,23.
Vigtigst af alt, har det vist sig at substrat-immobiliseret gener er stadig funktionel og kan være transskriberede og oversættes til RNA og protein. Gen pensler er tilgængelige for RNA polymeraser fra løsning24, og den komplekse makromolekylære blanding af omskrivning/oversættelse er ikke denatureret på overfladen. En af fordelene ved immobilisering af genetiske komponenter på et substrat er, at de kan betjenes i en åben mikrofluid reaktor system, der løbende leveres med små forløber molekyler og fra hvilke affaldsprodukter kan være fjernet25 , 26.
Vi har for nylig udviklet en variant af denne metode kaldes Bephore (for biokompatible elektronstråle og photoresist)27, som var baseret udelukkende på kommercielt tilgængelige komponenter og udnyttet sekvens-specifikke DNA streng invasion reaktioner for realiseringen af en enkel at implementere omstændelig litografi procedure til oprettelse af chip-baserede kunstige celler. En skematisk oversigt over proceduren er vist i figur 1. Det er baseret på DNA hårnål molekyler, der indeholder en photocleavable gruppe, der er immobiliseret på et biokompatibelt PIND lag. Photocleavage af hårnålen udsætter en enkeltstrenget fodfæste sekvens, gennem hvilke DNA molekyler af interesse (som indeholder den "fortrænger" DIS sekvens) kan være vedhæftet via fodfæste-medieret strand invasion.
Mens Bephore er potentielt enklere at gennemføre, Daisy tillader realiseringen af meget tætte og rene "gen pensler", som har fordele i visse anvendelser. I princippet, men kunne Daisy og Bephore litografi nemt kombineres. En beslægtet litografi metode udnytter DNA streng forskydning for strukturering DNA børster på guld var tidligere udviklet af Huang et al., men blev ikke udnyttet i forbindelse med celle-fri gen expression28,29.
I følgende protokol giver vi en detaljeret beskrivelse af produktionen af DNA børster for celle-fri genekspression ved hjælp af metoden Bephore. Vi beskriver hvordan gen chips er fabrikeret og demonstrere brugen af Multi-trins foto-litografi for den rumligt struktureret immobilisering af gener på en chip. Vi diskuterer også fabrikation af reaktion kamre og anvendelsen af mikrofluidik for udførelsen af på chip gen expression reaktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

Immobilisering af gener på lithographically strukturerede overflader giver studiet af opdelte gen expression processer i en åben mikrofluid bioreaktor system. I modsætning til andre tilgange til kunstige cellulære systemer, sådan en opsætning giver mulighed for en konstant forsyning med gen expression reagenser og samtidige dræning af affaldsprodukter. Dette letter gennemførelsen af celle-fri gen expression processer over længere perioder, hvilket er vigtigt for realiseringen af dynamiske gen regulerende feedbacksystemer. Her giver vi en detaljeret protokol for fabrikation af genetiske biochips ved hjælp af en simpel at bruge Litografisk teknik baseret på DNA streng forskydning reaktioner, som udelukkende bruger kommercielt tilgængelige komponenter. Vi giver også en protokol om integration af opdelte gener med en Polydimethylsiloxan (PDMS)-baseret mikrofluid system. Vi viser desuden, at systemet er kompatibelt med total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi, som kan bruges til direkte observation af molekylære interaktioner mellem DNA og molekyler, der indgår i blandingen, udtryk.

To-trins litografi: figur 5 viser resultatet af en Litografisk totrinsproces på glas dias med overlappende mønstre af fluorescently mærket DIS tråde.
Udtryk for en fluorescerende proteiner fra et gen pensel: figur 6 viser udtryk for de fluorescerende proteiner YPet fra immobiliseret DNA. På flere punkter i tid vi vurderet gen expression sats af delvis blegning de f...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Vi beskriver en simpel Litografisk metode for immobilisering af gen-længde DNA molekyler på en overflade, som kan bruges til at udføre celle-fri gen expression eksperimenter på biochips.

Funktionel overflade-immobilisering af gener ved hjælp af omstændelig Strand forskydning litografi

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

DNA-biochips er en attraktiv forskningsplatform for selvretisk biologi, der oprindeligt blev udviklet af BASF-gruppen, og som giver mulighed for drift af in vitro-genkredsløb over længere tid. Med denne protokol håber vi at gøre denne teknologi tilgængelig for en bredere vifte af forskere. Vores metode, der betegnes bephore litografi, repræsenterer en strategi for immobilisering af DNA baseret på DNA-strengforskydningsreaktionen.Styrken af denne teknik ligger i dens multi-trins litografiske evner, dens enkle reproducerbarhed, og den kommercielle tilgængelighed af alle komponenter. I lighed med andre biochip-løsninger kan bephore kombineres med forskellige teknologier. For eksempel kan funktionelle genbørster samles i mikrorum til proteinudtryk.Til at begynde, forberede en RCA blanding ved at blande fem dele vand med en del af en 30% ammoniak opløsning i et glas bægerglas. Varm blandingen til 70 grader Celsius på en varmeplade under omrøring. Når den når 70 grader Celsius, tilsæt en del 30% hydrogenperoxid.Derefter placere en 100 millimeter diameter silicium wafer i opløsningen, for at fjerne organisk materiale og partikler fra det. Efter 30 minutter, tage substratet ud, skyl det grundigt med vand fra en vaskeflaske, og tør det med en nitrogen pistol. Fortsæt straks med PEGylation af substratet.For at opnå dette, først fortyndes biotin-PEG-Silane i tør toluen til 5 milligram per milliliter, og vortex opløsningen, indtil det er godt blandet. Med underlaget placeret i et glas petriskål, langsomt pipette opløsningen på underlaget, der dækker hele overfladen, men undgå at lade opløsningen flyde over kanten. Når overfladen er dækket, lukke petriskålen, og derefter tilføje en ekstra dækning.Efter 30 minutter fjernes dækslet, og der tilsættes ca. 40 ml isopropylalkohol til petriskålen. Derefter tage ud substrat, skyl det igen grundigt med isopropyl alkohol, og tør det med en nitrogen pistol. Når det er tørt, opbevares underlaget i mørke, indtil det er nødvendigt.Forbered et substrat ved hjælp af en glasskærer eller en skalpel til at danne en centimeter med en centimeter stykker. Tilføj derefter et simpelt justeringsmærke ved at lave en kort ridse fra midten mod en kant af substratet. Blæse eventuelle små partikler ud chippen ved hjælp af en nitrogen pistol.Dernæst blandes to dråber af en to-komponent silikone lim, og anvende limen til overfladen af chippen, forlader området omkring spidsen af bunden blank. Der limen giver en hydrofob barriere, holde vandige løsninger på chippen. Dette letter efterfølgende vasketrin og reducerer mængden af DNA, der kræves til inkubationer.I et senere trin kan limen nemt skrælles af. I de følgende trin håndteres fotokleavable DNA kun i et gult lysmiljø. Dæk chippen med omkring 10 mikroliter af en bephore blanding ved stuetemperatur, og læg chippen i en kasse delvist fyldt med vand for at reducere fordampning.Efter en time vaskes chippen flere gange med PBS for at fjerne ubundet bephore mix. Dernæst tilsættes 10 mikroliter af passivation mix til chippen. Efter to timer vaskes chippen flere gange med PBS for at fjerne de ubundne passiveringsmidler.Skær en trykt fotomaske til den rigtige størrelse for at passe til en passende maskeholder. Sæt den i positionen af feltstoppet, og brug justeringsmærkerne til at justere masken i holderen. Når underlaget er placeret på mikroskopistadiet, skal du indsætte et rødt filter i belysningsstien og fokusere på underlagets overflade.Derefter navigere til regionen af substratet, som vil blive udsat. Sæt derefter maskeholderen i, bloker belysningen, og skift til UV-filteret. Ved lav lysintensitet skal du åbne lukkeren og bruge kameraet til hurtigt at fokusere masken på underlaget.Når underlaget nu er justeret, og masken er i fokus, skal du blokere lysvejen til kameraet og belyse underlaget ved en høj lysintensitet for den ønskede eksponeringstid. Efter eksponering fjernes prøven fra mikroskopet, og så meget buffer som muligt fjernes fra underlaget uden at tørre den. Derefter tilsættes 10 til 20 mikroliter af DNA med sekvensen til fastgørelse til overfladen.Anse substratet i en våd kasse for at holde det fra tørring, og inkuber DNA'et på underlaget i to timer ved stuetemperatur. For at observere det opdelte genekspression på et omvendt mikroskop skal de to dele af prøveholderen først forberedes separat. Start med at lime en bephore chip med en immobiliseret genbørste på chipholderen ved hjælp af dobbeltsidet tape.Dernæst tilsættes noget vakuumfedt omkring det centrale hul i den nederste del af holderen, og sæt spånholderen i. Saml nu den øverste del af holderen. Skær en tynd PDMS chip med rum så små som muligt, forlader en kanal åben til den ene side for senere at give mulighed for udveksling af affald og prækursor molekyler ved diffusion Næste, plasma-behandle et glas dække slip i bagsiden af PDMS chip med ilt plasma.Umiddelbart efter behandlingen skal PDMS-chippen placeres i midten af glasrutsjebanen, hvor rummene peger opad. Derefter bages glasset med PDMS i en time ved 70 grader Celsius. Kort før montering af hele prøveholderen skal glasdiasen behandles med PDMS-spånen som før.Derefter tilsættes nogle vakuum fedt omkring det store hul i den øverste holder, og placere glas dias med PDMS på det. Tryk forsigtigt glasset på fedtet. Fjern forsigtigt bufferen fra chippen, og vask den én gang med 10 mikroliter af selvudfoldelsessystem.Dernæst tilsættes 60 mikroliter af selvudfoldelsessystem på chippen, og fjern den tokomponent silikonelim fra kanterne. Nu skal du tilføje 20 mikroliter af ekspressionssystemet på PDMS. Når dråben er placeret på PDMS, skal du hurtigt kontrollere i stereoskopi mikroskopet, at rummene er våde og uden luftbobler.Hvis der er luftbobler, så prøv at vaske dem væk. For at samle de to stykker af holderen, og for at tilpasse kamre og DNA børster, arbejde under et stereoskopisk mikroskop. Immobilisere bundholderen med en griberarm, så de to skruer og vingesnøre vil være let tilgængelige med begge hænder.Sæt den øverste holder i den nederste holder, og sænk den, indtil det cellefrie udtrykssystemdråber sikringer. Kontroller derefter, at rummene og justeringsmærket er i et lignende område i XY-flyet. Skru vingenødderne op fra bunden, indtil de rører ved holderens nederste side.Mens du justerer rummene og chippen i XY-flyet, skal vingenuterne forsigtigt strammes. Dette trin kræver en vis erfaring og afhænger af prøveholderens konstruktion. PDMS må kun trykkes på chippen med let kraft.Derefter sprøjtes en svamp i antifordampningskabinettet med vand, og sæt holderen i kassen. Derefter fyldes en fem milliliter sprøjte med to-komponent silikone lim, og bruge den til at forsegle kassen. Endelig overføre boksen til et temperaturstyret mikroskop, og billede DNA børste og reaktionen ved hjælp af fluorescens mikroskopi.En to-trins litografisk proces, her udføres på en bephore glas dias, giver overlappende mønstre af fluorescerende mærket DNA-strenge. I denne demonstration af on-chip genekspression, er DNA immobiliseret i kammeret til venstre. Når det udsættes for udtryksblandingen, syntetiseres det gule fluorescerende protein YPet fra det immobiliserede DNA.For at vurdere aktiviteten af genekspressionssystemet observeres genoprettelsen af fluorescensen efter et blegningstrin. På to timer, fluorescens intensitet inddrives hurtigt. Efter fire og seks timer kom den dog ikke sig, hvilket indikerede, at reaktionen uden en ny forsyning af udtryksblandingen klarede sig omkring time fire.Selv om genekspression er begrænset i et lukket system, kan det opretholdes over længere perioder ved at forsyne ekspressionsrummene med yderligere prækursormolekyler via mikro-fluidics. Den bephore metode bruges til at immobilisere oligonukleotider eller gen længde DNA, som kan anvendes til at konstruere systemer af interagerende DNA børster til selvgenopret udtryk. Teknikken kan også anvendes til andre anvendelser i biofysik, såsom enkelt molekyle fluorescens undersøgelser.Efter at have set denne video, bør du være i stand til at fremstille bephore biochips fra vafler eller glas dias, og integrere dem i dine forskningsprojekter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillarkraft Litografi for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generering af Aligned Functional myocardievæv via microcontact printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy System for Funktionel Inddrivelse af hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Udvikling af en elektrokemisk DNA Biosensor at opdage en fødevarebårne patogenet

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Fokuseret Ionstrålithografi til etch Nano-arkitekturer i Mikroelektroderne

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

Cerebral blodflow-baseret hviletilstand funktionel forbindelse af den menneskelige hjerne ved hjælp af optisk diffus korrelation spektroskopi

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Generation og kvantitativ karakterisering af funktionelle og polariserede galde epitelcyster

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetisk replikering af root surface mikrostruktur ved hjælp af ændring af blød litografi

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering af dynamiske miljøforhold ved hjælp af en mikrofluidisk højoverførselsenhed

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...