Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Nous reconnaissons le soutien financier à ce projet par la Fondation Volkswagen (subvention no 89 883) et l’European Research Council (subvention contrat n° 694410 - AEDNA). M.S.-S. reconnaît la prise en charge par la DFG par GRK 2062.

Remarque : Un calendrier pour les étapes décrites dans les différentes sections est donné dans les informations complémentaires (article 1).
1. Fabrication de la puce
Remarque : comme substrats, utilisation plaquettes de silicium (100 mm de diamètre, 0,525 mm d’épaisseur) avec une couche épaisse de 50 nm de dioxyde de silicium ou de lames de verre (24 mm x 24 mm, n° 1,5 ; 22 mm x 50 mm, n ° 4). Selon l’application, autres tailles et épaisseurs peuven...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

Bephore lithographie est une technique robuste et polyvalente pour l’immobilisation à motifs d’ADN ou d’ARN. Pourtant, la procédure comprend plusieurs étapes, ce qui - si changé - peuvent être une source de l’échec ou réduit les performances du système.
Une étape cruciale dans la fabrication de puces de Bephore est la PEGylation du substrat, qui fournit la biocompatibilité de la surface. Ici, l’étape de nettoyage avec une procédure RCA est important, car il active égalem...

Les réactions sont d’un grand intérêt pour diverses applications en biochimie, biotechnologie, biologie synthétique et l’expression des gènes sans cellule. Acellulaire expression de protéines a contribué à la préparation des échantillons de protéines pures, qui faisaient l’objet de nombreuses études en biologie structurale. Par exemple, des systèmes acellulaires ont été utilisés avec succès pour l’expression des protéines complexes1 ou membrane protéines2, qui sont difficiles à produire en utilisant expression basés sur les cellules. Notamment, acellulaire réactions ont également été utilisées pour élucider la structure du code génétique, commençant par les expériences révolutionnaires par Nirenberg et Matthaei en 19613l’expression des gènes.
Récemment, il y a eu un regain d’intérêt pour les méthodes acellulaire en biotechnologie et biologie synthétique4,5,6. Des systèmes acellulaires peuvent être augmentés avec les composés non biologiques, et des composants de diverses origines biologiques peuvent être combinés plus facilement7. Même si des systèmes acellulaires ont l’inconvénient évident qu’ils ne sont pas « cultiver et diviser », il est concevable de préparer ouverts acellulaire bioréacteurs avec fonctions métaboliques de base et leur faire synthétiser des métabolites lorsqu’il est fourni avec l’énergie et de carbone simple entrées8. Dans le domaine émergent de la biologie synthétique, systèmes acellulaires promettent d’être un « châssis » plus prévisible pour la mise en œuvre des fonctions biologiques synthétiques.
Actuellement, les réactions d’expression de gène acellulaires sont effectuées soit à l’aide des extraits cellulaires (à partir de différentes sources telles que les bactéries, les levures, les insectes), ou qui ont été optimisés pour différentes applications (p. ex., des systèmes de transcription/traduction procaryotes et eucaryotes expression génique, production de protéines membranaires, etc.). Un protocole populaire pour la préparation d’extrait de cellule bactérienne (communément appelé TXTL) a été fourni récemment par V. Noireaux et collaborateurs9. Ses propriétés biophysiques ont été soigneusement caractérisés10, et le système TXTL a été déjà utilisé avec succès pour effectuer une série de tâches biochimiques complexes : par exemple, l’Assemblée des bactériophages fonctionnelle via acellulaire expression du génome phagique11, la synthèse des protéines bactériennes filaments12ou la mise en œuvre du gène acellulaire circuits13,14.
Un autre système populaire en biologie synthétique acellulaire est le pur, qui est reconstituée à partir des composantes purifiées15,16. Par rapport au système TXTL, il ne contient pas de nucléases ou mécanisme de dégradation des protéines. Alors que la dégradation de l’ADN linéaire, molécules d’ARN ou de protéines est moins un problème dans le système pur, voies de décomposition sont réellement importants pour la mise en œuvre des fonctions dynamiques. Afin de réduire l’effet de la dégradation de l’exonucléase de modèles linéaires de gène dans le système TXTL (par RecBCD), la protéine de GamS-protection de fin doit être ajouté. Le TXTL tant le système pur sont disponibles dans le commerce.
Un sujet étroitement lié aux préoccupations acellulaire biologie l’étude de l’effet de cloisonnement sur les réactions biochimiques et outre la création de structures artificielles de cellules ou protocells17,18,19 ,,20. Recherche sur les cellules artificielles implique généralement l’encapsulation d’un système de réaction biochimique à l’intérieur des compartiments vésiculaires de phospholipides ou autres amphiphiles. Tandis que ces systèmes aident à explorer les aspects fondamentaux de la compartimentation, ou l’émergence de la cellularité et structures auto-réplication, ils font face à des problèmes typiques des systèmes fermés : en l’absence d’un métabolisme efficace et approprié mécanismes de transport de membrane, il est difficile de garder des réactions compartimentées en cours d’exécution pendant de longues périodes de temps - molécules de carburant ont été utilisés et les déchets s’accumulent.
Une alternative intéressante à la compartimentation à l’intérieur de ces compartiments cellulaires-imitant est l’organisation spatiale du matériel génétique à l’aide de méthodes photolithographiques. Immobilisation des « gènes sur une puce » a été lancée par le groupe Bar-Ziv à l’Institut Weizmann, il y a plus de dix ans21. Parmi les grandes questions qui devaient être résolues ont été l’adsorption non spécifique de l’ADN et l’éventuelle dénaturation des protéines à la surface de la puce. Bar-Ziv et coll. a développé une résistance photolithographie dédiée appelée « Daisy », qui était composé d’un silane terminal réactif pour l’immobilisation des molécules sur les surfaces de dioxyde de silicium, résister à un intercalaire longue de polyéthylèneglycol (PEG) qui a assuré biocompatibilité et une tête de PHOTOCLIVABLES, qui a été transformé en une amine réactive lors de l’irradiation avec la lumière ultraviolette (UV). Il a été démontré que Daisy peut être utilisé pour immobiliser les molécules d’ADN gène-longueur (avec des longueurs de plusieurs kilo paires de bases (KPB)) sur une surface de puce. D’un point de vue de polymère physique, les systèmes représentant brosses polymère greffés sur un substrat solide. En raison de la nature de polyélectrolyte de l’ADN, la conformation de ces brosses est fortement affectée par osmotique et autres effets spécifiques à ion22,23.
Surtout, il a été démontré que substrat immobilisée gènes sont encore fonctionnels et peuvent être transcrit et traduit en ARN et des protéines. Brosses de gène sont accessibles pour les ARN polymérases de solution24, et le mélange complexe macromoléculaire de la transcription/traduction n’est pas dénaturé à la surface. Un des avantages de l’immobilisation des composantes génétiques sur un substrat est qu’ils peuvent être utilisés dans un système de réacteur ouvert microfluidique qui est fourni en continu avec des molécules précurseurs de petite et de quels produits de déchets peut être enlevé25 , 26.
Nous avons récemment mis au point une variante de cette méthode, appelée Bephore (par faisceau d’électrons Biocompatible et résine photosensible)27, qui reposait exclusivement sur les composants disponibles dans le commerce et utilisé des réactions spécifiques séquence ADN brin invasion pour la réalisation d’une procédure de simple-to-implement Lithographie plusieurs étapes pour la création de cellules artificielles à base de puce. Un aperçu schématique de la procédure est illustré à la Figure 1. Il est issu des molécules d’épingle à cheveux ADN contenant un groupe PHOTOCLIVABLES, qui sont immobilisées sur une couche de PEG biocompatible. Photoclivage de l’épingle expose une séquence simple brin pied, à travers lequel l’ADN molécules d’intérêt (qui contient la séquence DIS « DEPLACEMENT ») peuvent être jointe par l’invasion brin induite par le pied.
Alors que Bephore est potentiellement plus simple à mettre en œuvre, Daisy permet la réalisation de très dense et très propre « brosses à gène », qui a des avantages dans certaines applications. En principe, cependant, lithographie de Daisy et Bephore pourrait être facilement combiné. Une méthode connexe Lithographie utilisant déplacement brin ADN pour structurer les ADN brosses sur l’or a été précédemment développé par Huang et al., mais n’était pas utilisé dans le cadre d’expression de gène acellulaire28,29.
Dans le protocole suivant, nous fournir qu'une description détaillée de la production d’ADN brushes pour l’expression des gènes sans cellule à l’aide de la méthode Bephore. Les auteurs décrivent comment les puces sont fabriqués et démontrent l’utilisation de plusieurs étape photo-Lithographie pour l’immobilisation structurée spatialement de gènes sur une puce. Nous discutons également la fabrication des chambres de réaction et l’application de microfluidique pour l’exécution des réactions d’expression génique sur puce.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

Immobilisation des gènes sur les surfaces lithographically structurés permet l’étude du gène compartimentée processus d’expression dans un système de bioréacteur microfluidique ouvert. Contrairement aux autres approches vers des systèmes cellulaires artificielles, une telle installation permet un approvisionnement continu avec les réactifs d’expression de gène et simultanée, l’évacuation de déchets produits. Cela facilite la mise en œuvre des processus d’expression de gène acellulaire sur de longues périodes de temps, ce qui est important pour la réalisation de systèmes de rétroaction réglementaire de gène dynamique. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la fabrication de biopuces génétiques en utilisant une technique lithographique de simple-to-use issue des réactions de déplacement de brin de l’ADN, qui utilise exclusivement des composants disponibles dans le commerce. Nous fournissons également un protocole sur l’intégration des gènes compartimentées avec un polydiméthylsiloxane (PDMS)-basé système microfluidique. De plus, nous montrons que le système est compatible avec la microscopie de fluorescence (FRBR) de réflexion totale interne, qui peut être utilisée pour l’observation directe des interactions moléculaires entre l’ADN et les molécules contenues dans le mélange d’expression.

Lithographie en deux étapes : la Figure 5 montre le résultat d’un procédé lithographique en deux étapes sur une lame de verre qui se chevauchent de patrons de fluorescent étiquetés DIS brins.
Expression d’une protéine fluorescente de la brosse de gène : la Figure 6 illustre l’expression de la protéine fluorescente YPet d’ADN immobilisée. À plusieur...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Nous décrivons une procédure simple lithographique pour l’immobilisation des molécules d’ADN gène-longueur sur une surface, ce qui peut être utilisée pour réaliser des expériences d’expression de gène acellulaire sur biopuces.

Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Les biopuces d’ADN sont une plate-forme de recherche attrayante pour la biologie auto-resythique, développée à l’origine par le groupe BASF, qui permet l’exploitation de circuits génétiques in vitro sur de longues périodes de temps. Avec ce protocole, nous espérons mettre cette technologie à la disposition d’un plus large éventail de chercheurs. Notre méthode, appelé lithographie bephore, représente une stratégie pour l’immobilisation de l’ADN basée sur la réaction de déplacement des brins d’ADN.La force de cette technique réside dans ses capacités lithographiques en plusieurs étapes, sa simple reproductibilité et la disponibilité commerciale de tous les composants. Comme d’autres solutions de biopuces, bephore peut être combiné avec différentes technologies. Par exemple, les brosses génétiques fonctionnelles peuvent être assemblées dans des micro-compartiments pour l’expression des protéines.Pour commencer, préparez un mélange RCA en mélangeant cinq parties d’eau avec une partie d’une solution d’ammoniac à 30 % dans un bécher en verre. Chauffer le mélange à 70 degrés Celsius sur une plaque chaude en remuant. Une fois qu’il atteint 70 degrés Celsius, ajouter une partie 30% peroxyde d’hydrogène.Ensuite, placez une plaquette de silicium de 100 millimètres de diamètre dans la solution, pour enlever les matières organiques et les particules de lui. Après 30 minutes, sortir le substrat, le rincer abondamment à l’eau d’une bouteille de lavage et le sécher à l’aide d’un pistolet à azote. Procédez immédiatement à la pegylation du substrat.Pour ce faire, d’abord diluer la biotine-PEG-Silane en toluène sec à 5 milligrammes par millilitre, et vortex la solution jusqu’à ce qu’elle soit bien mélangée. Avec le substrat placé dans une boîte de Pétri en verre, pipette lentement la solution sur le substrat, couvrant toute la surface, mais éviter de permettre à la solution de couler sur le bord. Une fois la surface couverte, fermer la boîte de Pétri, puis ajouter un couvercle supplémentaire.Après 30 minutes, retirer le couvercle et ajouter environ 40 millilitres d’alcool d’isopropylique à la boîte de Pétri. Ensuite, sortez le substrat, rincez-le à nouveau à fond avec de l’alcool d’isopropyle et séchez-le à l’aide d’un pistolet à azote. Lorsqu’il est sec, conserver le substrat dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit nécessaire.Préparer un substrat à l’aide d’un coupeur de verre ou d’un scalpel pour former des morceaux d’un centimètre sur un centimètre. Ensuite, ajoutez une simple marque d’alignement en faisant une courte égratignure du centre vers un bord du substrat. Soufflez toutes les petites particules de la puce à l’aide d’un pistolet à azote.Ensuite, mélangez deux gouttelettes d’une colle en silicone à deux composants et appliquez la colle à la surface de la puce, en laissant la zone autour de la pointe de l’égratignure vide. Là, la colle fournit une barrière hydrophobe, en gardant des solutions aqueuses sur la puce. Cela facilite les étapes de lavage subséquentes et réduit la quantité d’ADN nécessaire aux incubations.Dans une étape ultérieure, la colle peut être facilement épluchée. Dans les étapes suivantes, l’ADN photocléavable n’est manipulé que dans un environnement de lumière jaune. Couvrir la puce d’environ 10 microlitres d’un mélange de bephore à température ambiante et placer la puce dans une boîte partiellement remplie d’eau pour réduire l’évaporation.Après une heure, laver la puce plusieurs fois avec PBS pour enlever tout mélange de bephore non lié. Ensuite, ajoutez 10 microlitres du mélange de passivation à la puce. Après deux heures, lavez la puce plusieurs fois avec PBS pour enlever les agents de passivation non liés.Coupez un masque photo imprimé à la taille appropriée afin de s’adapter à un porte-masque approprié. Insérez-le à la position de l’arrêt de champ, et utilisez les marques d’alignement pour aligner le masque dans le support. Avec le substrat placé sur le stade de microscopie, insérez un filtre rouge dans le chemin d’éclairage, et concentrez-vous sur la surface du substrat.Ensuite, naviguez vers la région du substrat qui sera exposée. Ensuite, insérez le porte-masque, bloquez l’éclairage et changez pour le filtre UV. À faible intensité lumineuse, ouvrez l’obturateur et utilisez la caméra pour concentrer rapidement le masque sur le substrat.Avec le substrat maintenant aligné et le masque au point, bloquer le chemin de lumière à la caméra, et illuminer le substrat à une intensité lumineuse élevée pour le temps d’exposition désiré. Après l’exposition, retirer l’échantillon du microscope et retirer soigneusement le plus de tampon possible du substrat sans le sécher. Ensuite, ajoutez 10 à 20 microlitres d’ADN avec la séquence d’attachement à la surface.Placez le substrat dans une boîte humide pour l’empêcher de sécher et incubez l’ADN sur le substrat pendant deux heures à température ambiante. Afin d’observer l’expression du gène compartimenté sur un microscope inversé, préparez d’abord séparément les deux parties du porte-échantillon. Commencez par coller une puce bephore avec une brosse à gènes immobilisée sur le support de la puce, à l’aide de ruban adhésif à double face.Ensuite, ajoutez un peu de graisse sous vide autour du trou central de la partie inférieure du support, et insérez le support de la puce. Assemblez maintenant la partie supérieure du support. Couper une puce PDMS mince avec des compartiments aussi petits que possible, laissant un canal ouvert d’un côté pour permettre plus tard l’échange de déchets et de molécules précurseurs par diffusion Ensuite, plasma-traiter un glissement de couverture en verre dans le côté arrière de la puce PDMS avec du plasma d’oxygène.Immédiatement après le traitement, placez la puce PDMS au centre de la glissière de verre, les compartiments pointant vers le haut. Ensuite, cuire le verre avec le PDMS pendant une heure à 70 degrés Celsius. Peu de temps avant l’assemblage de l’ensemble du support de l’échantillon, traitez le glissière en verre avec la puce PDMS comme avant.Ensuite, ajoutez un peu de graisse sous vide autour du grand trou du support supérieur, et placez la glissière en verre avec le PDMS sur elle. Presser délicatement le verre sur la graisse. Retirez soigneusement le tampon de la puce et lavez-le une fois avec 10 microlitres de système d’auto-ré-expression.Ensuite, ajoutez 60 microlitres de système d’auto-ré-expression sur la puce, et retirez la colle en silicone à deux composants des bords. Maintenant, ajoutez 20 microlitres du système d’expression sur le PDMS. Après avoir placé la gouttelette sur le PDMS, vérifiez rapidement au microscope stéréoscopique que les compartiments sont bien mouillés et sans bulles d’air.S’il y a des bulles d’air, essayez de les laver. Pour assembler les deux pièces du support, et pour aligner les chambres et les brosses à ADN, travaillez au microscope stéréoscopique. Immobiliser le support inférieur avec un bras de pince de sorte que les deux vis et les extrémités des ailes seront facilement accessibles avec les deux mains.Insérez le support supérieur dans le support inférieur et abaissez-le jusqu’à ce que les gouttelettes du système de libre expression cellulaire fusionnent. Ensuite, vérifiez que les compartiments et la marque d’alignement sont dans une région similaire dans le plan XY. Par le bas, vissez les extrémités des ailes jusqu’à ce qu’elles touchent le côté inférieur du support.Tout en alignant les compartiments et la puce dans le plan XY, serrez doucement les extrémités des ailes. Cette étape nécessite une certaine expérience et dépend de la construction du porte-échantillon. Le PDMS ne doit être pressé sur la puce qu’avec une force douce.Ensuite, vaporisez une éponge dans l’enceinte anti-évaporation avec de l’eau, et insérez le support dans la boîte. Ensuite, remplissez une seringue de cinq millilitres avec de la colle en silicone à deux composants et utilisez-la pour sceller la boîte. Enfin, transférez la boîte à un microscope à température contrôlée, et imagez la brosse à ADN et la réaction à l’aide de microscopie de fluorescence.Un processus lithographique en deux étapes, ici effectué sur une lame de verre bephore, donne des modèles qui se chevauchent de brins d’ADN étiquetés fluorescentement. Dans cette démonstration de l’expression du gène sur puce, l’ADN est immobilisé dans la chambre à gauche. Lorsqu’elle est exposée au mélange d’expression, la protéine fluorescente jaune YPet est synthétisée à partir de l’ADN immobilisé.Pour évaluer l’activité du système d’expression génique, la récupération de la fluorescence est observée après une étape de blanchiment. À deux heures, l’intensité de fluorescence s’est rapidement rétablie. Toutefois, après quatre et six heures, il ne s’est pas rétabli, ce qui indique que sans un nouvel approvisionnement du mélange d’expression, la réaction s’est terminée vers l’heure quatre.Bien que l’expression des gènes soit limitée dans un système fermé, elle peut être soutenue sur de plus longues périodes en fournissant aux compartiments d’expression des molécules précurseurs supplémentaires par micro-fluidité. La méthode du bephore est utilisée pour immobiliser les oligonucléotides ou l’ADN de longueur de gène, qui peuvent être appliqués pour construire des systèmes de brosses à ADN en interaction pour l’expression autorégénique. La technique peut également être utilisée pour d’autres applications en biophysique, telles que des études de fluorescence à molécule unique.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de fabriquer des biopuces bephore à partir de gaufrettes ou de toboggans en verre, et de les intégrer dans vos projets de recherche.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Recherche

Bio-ingénierie

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capillaire de travail lithographie pour l&#39;ingénierie tissulaire cardiaque

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Système de thérapie robotique Miroir pour la récupération fonctionnelle des bras hémiplégique

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Lithographie focalisée de faisceau d'ion à Etch Nano-architectures dans des microélectrodes

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

Connectivité fonctionnelle de l’état de repos basée sur le flux sanguin cérébral du cerveau humain à l’aide de la spectroscopie optique de corrélation diffuse

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Génération et caractérisation quantitative des kystes épithéliales biliaires fonctionnels et polarisés

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Réplication biomimétique de la microstructure de surface racine à l’aide de l’altération de la lithographie douce

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...