Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

אנו להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית עבור פרויקט זה על-ידי Stiftung של פולקסווגן (גרנט מס 89 883) המועצה האירופית למחקר (גרנט הסכם מס ' 694410 - AEDNA). טרשת נפוצה-S. מאשר תמיכה מאת DFG דרך GRK 2062.

הערה: לוח זמנים עבור השלבים בסעיפים שונים הוא נתון המידע הנוסף (סעיף 1).
1. שבב פבריקציה נוספת
הערה: כמו מצעים, שימוש סיליקון (קוטר 100 מ מ, 0.525 מ מ עובי) עם 50 ננומטר שכבה עבה של צורן דו-חמצני או שקופיות זכוכית (24 מ מ x 24 מ מ, 1.5 מס; 22 מ מ x 50 מ מ, מס ' 4.). בהתאם ליישום, בעוביים ו?...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

ליתוגרפיה Bephore היא טכניקה חזקה ופסיביות לאימוביליזציה עם תבנית ה-DNA או RNA. ובכל זאת, הפרוצדורה כוללת מספר שלבים אשר - אם משתנה - עשוי להיות מקור לכישלון או מופחתת הביצועים של המערכת.
שלב חיוני בייצור שבבי Bephore הוא PEGylation של המצע, אשר מספק את התאימות של פני השטח. . הנה, הצעד ניקוי עם...

תא-ביטוי גנים תגובות הן עניין רב ליישומים שונים, ביוכימיה, ביוטכנולוגיה, ביולוגיה סינתטית חינם. תא ללא ביטוי של חלבונים היה אינסטרומנטלי עבור הכנת דגימות חלבון טהור, אשר היו בסיס מחקרים רבים בביולוגיה מבנית. למשל, מערכות ללא תא בהצלחה שימשו עבור הביטוי של חלבון מתחמי1 או קרום חלבונים2, אשר הם קשה לייצר שימוש בביטוי מבוססת-תא. ראוי לציין, התא ללא ביטוי גנים תגובות שימשו גם להבהיר את המבנה של הקוד הגנטי, החל הניסויים פורצי דרך על-ידי נירנברג Matthaei 19613.
לאחרונה, יש כבר עניין מחודש בשיטות ללא תאים, ביוטכנולוגיה, ביולוגיה סינתטית-4,-5,-6. מערכות ללא תא ניתן בתוספת עם תרכובות הלא-ביולוגיים, רכיבים מגוונים ממקור ביולוגי ניתן לשלב בקלות רבה יותר7. אף-על-פי מערכות ללא תא יש החיסרון לכאורה הם אינם "גדלים ומתחלקים", זה מתקבל על הדעת להכין ריאקטורים ללא תא פתוח עם פונקציות בסיסיות מטבולית ולתת להם לסנתז מטבוליטים כאשר מסופק עם פחמן פשוטה ואנרגיה תשומות8. בתוך השדה המתעוררים של ביולוגיה סינתטית, מערכות ללא תא מבטיחה להיות צפוי יותר "מארז" ליישום של תפקודים ביולוגיים סינתטי.
כיום, ללא תא ג'ין ביטוי תגובות מבוצעות או באמצעות תא תמציות (ממקורות שונים כגון חיידקים, שמרים, חרקים), או מערכות תרגום/תמלול אשר היו אופטימיזציה עבור יישומים שונים (למשל, prokaryotic לעומת האיקריוטים ביטוי גנים, הפקה של חלבוני ממברנה, וכו '). פרוטוקול פופולרי עבור הכנת תמצית תא החיידק (הפטרוני TXTL) סופק לאחרונה על ידי Noireaux (פ') ועמיתים9. תכונותיו biophysical מאופיין ביסודיות10, מערכת TXTL כבר שימש בהצלחה לבצע סדרה של משימות מורכבות הביוכימי: למשל, ההרכבה של bacteriophages פונקציונלי ויה תא ללא ביטוי של הגנום phage11, הסינתזה של חלבון חיידקי חוטים12או היישום של הגן ללא תא מעגלים13,14.
מערכת אחרת מבוקש ב ביולוגיה סינתטית ללא תא היא מערכת טהור, אשר הוא מחדש של רכיבי מטוהרים15,16. בהשוואה למערכת TXTL, הוא אינו מכיל nucleases או חלבון השפלה מכונות. תוך השפלה של DNA ליניארי, מולקולות RNA או חלבונים הוא פחות בעיה במערכת טהור, מסלולים עששת חשובים למעשה עבור מימוש פונקציות דינמיות. כדי להפחית את האפקט של אקסונוקלאז השפלה של ג'ין ליניארי תבניות למערכת TXTL (דרך RecBCD), החלבון GamS הגנה על קצה צריך להתווסף. גם את TXTL וגם מערכת טהור זמינים מסחרית.
נושא קשור קשר הדוק ל ביולוגיה תא ללא דאגות המחקר של ההשפעה של מידור על תגובות ביוכימיות, נוסף על הקמת מבנים דמויי-תא מלאכותיים או protocells17,18,19 ,20. מחקר על תאים מלאכותיים כוללת בדרך כלל את ומגעים מערכת התגובה הביו בתוך תאי vesicular זני פוספוליפידים או חומרים פעילי שטח אחרים. בעוד מערכות כאלה לעזור לחקור את ההיבטים הבסיסיים של מידור, או הופעתה של cellularity ומבנים המשכפלת, הם עומדים בפני בעיות טיפוסיות של מערכות סגורות: בהיעדר של מטבוליזם של תפקוד והולמים מנגנוני הובלה ממברנה, קשה לשמור על תגובות ממודר פועל במשך פרקי זמן ארוכים - מולקולות הדלק משמשים ולצבור הפסולת.
אלטרנטיבה מעניינת מידור בתוך תאים מחקה תא כזה הוא הארגון המרחבי של חומר גנטי בשיטות photolithographic. קיבעון של "גנים על שבב" היה חלוץ על ידי קבוצת בר-זיו במכון ויצמן לפני יותר מעשר שנים21. בין הנושאים העיקריים היו צריכים להיפתר היו של ספיחה שאינם ספציפיים של ה-DNA, את פוטנציאל דנטורציה של חלבונים על פני שבב. . בר-זיו ואח פיתח להתנגד פוטוליתוגרפיה ייעודי כינה "דייזי", אשר היה מורכב silane מסוף תגובתי על הנייח של מולקולות להתנגד על משטחים צורן דו-חמצני, כרווח ארוך פוליאתילן גליקול (PEG) זה מובטח הביו, headgroup photocleavable, אשר הוסב על אמין תגובתי על הקרנה עם אור אולטרה סגול (UV). הוכח כי דייזי יכול לשמש כדי לשתק גנים באורך במולקולות דנ א (באורכים של קילו מספר בסיסי-זוגות (kbp)) על משטח השבב. פולימר פיזיקה נקודת מבט, ייצג המערכות מברשות פולימר הושתל על גבי מצע מוצק. בשל אופיו polyelectrolyte של ה-DNA, שיאשר מברשות אלה מושפע בחוזקה תופעות ספציפיות יון ואחרים22,23.
והכי חשוב, זה הוכח כי הגנים המצע. מרותק למיטה עדיין מתפקד, יכולים להיות משועתקים, תרגום לתוך RNA וחלבון. ג'ין מברשות נגישים עבור ה-RNA polymerases מ פתרון24, לא שפגע בסימני את התערובת macromolecular תרגום/תמלול על פני השטח. אחד היתרונות של קיבעון של רכיבים גנטיים על מצע הוא כי הם יכול להיות מופעל בכל מערכת הכור microfluidic פתוח ברציפות המסופק עם מולקולות קטנות קודמן ומן אילו מוצרים פסולת יכול להיות שהוסרו25 , 26.
לאחרונה פיתחנו וריאציה של שיטה זו כינה Bephore (עבור קרינה מסתיימים ו photoresist)27, אשר היה מבוסס באופן בלעדי על רכיבים זמינים מסחרית, מנוצל ספציפיים רצף DNA סטרנד הפלישה תגובות עבור מימוש הליך ליתוגרפיה שקודמים פשוטה כדי ליישם את הקמת מבוססי שבב תאים מלאכותיים. מבט סכמטי של התהליך מוצג באיור1. הוא מבוסס על מולקולות דנ א סיכת ראש המכיל קבוצת photocleavable, אשר נמצאים ותשמרו על שכבה פג מסתיימים. Photocleavage של הסיכה חושף רצף מקום אחיזה לרגל חד-גדילי, דרך איזה DNA מולקולות עניין (המכיל את רצף דיס "והותירו") יכול להיות המחוברים באמצעות גדיל בתיווך מקום אחיזה לרגל הפלישה.
בעוד Bephore הוא שעשוי להיות פשוט ליישם, דייזי מאפשר את מימוש מאוד צפוף ונקי "ג'ין מברשות", אשר יש יתרונות ביישומים מסוימים. עקרונית, עם זאת, ליתוגרפיה Bephore ודייזי יכולים לשלב בקלות. שיטת ליתוגרפיה קשורים ניצול DNA הזחה סטרנד להבניית DNA מברשות על זהב קודם לכן פותחה על ידי הואנג. et al., אך היה מנוצל לא בהקשר של הגן ללא תא ביטוי28,29.
בפרוטוקול הבא אנו מספקים שתיאור מפורט של הייצור של ה-DNA מברשות על ביטוי גנים תא ללא שימוש בשיטת Bephore. אנו מתארים כיצד האסימונים ג'ין מיוצרים, מדגימים את השימוש רב שלבי פוטוליתוגרפיה לאימוביליזציה במרחב מובנית של גנים על שבב. נדון גם הזיוף של תגובת תאי והיישום של מיקרופלואידיקה להופעה של ג'ין על שבב ביטוי תגובות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

קיבעון של גנים על משטחים lithographically מובנה מאפשר המחקר של ג'ין ממודר ביטוי תהליכים במערכת ביוריאקטור microfluidic פתוח. בניגוד גישות אחרות כלפי מערכות סלולריות מלאכותי, כזו מלכודת מאפשר אספקה רציפה עם ריאגנטים ביטוי גנים וניקוז סימולטני של חומרי פסולת. זה מקל על ביצוע תהליכי ביטוי הגן ללא תא במשך תקופות זמן, וזה חשוב עבור מימוש מערכות משוב רגולטוריות ג'ין דינמי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט הזיוף של biochips גנטי בטכניקה פשוטה לשימוש ליטוגרפית בהתבסס על DNA סטרנד תגובות הדחק, המשתמשת אך ורק רכיבים זמינים מסחרית. אנו מספקים גם פרוטוקול על האינטגרציה של גנים ממודר polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic מערכת מבוססת. יתר על כן, אנו מראים כי המערכת הוא תואם עם מיקרוסקופ גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF), אשר יכול לשמש בהתבוננות ישירה של אינטראקציות מולקולרי בין DNA מולקולות הכלול המיקס ביטוי.

ליתוגרפיה בשני שלבים: איור 5 מראה התוצאה של תהליך בן שני שלבים ליטוגרפיה על משטח זכוכית עם דפוסים של גדילי דיס fluorescently שכותרתו חופפים.
הביטוי של חלבון פלואורסצנטי של מברשת ג'ין: איור 6 מדגים את הביטוי של החלב...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

שבבי DNA הם פלטפורמת מחקר אטרקטיבית לביולוגיה סינתטית עצמית, שפותחה במקור על ידי קבוצת BASF, המאפשרת תפעול מעגלי גנים במבחנה לאורך פרקי זמן ממושכים. עם פרוטוקול זה, אנו מקווים להפוך את הטכנולוגיה הזו לזמינה למגוון רחב יותר של חוקרים. השיטה שלנו, הנדונה ליתוגרפיה של בפור, מייצגת אסטרטגיה לשתק את הדנ"א בהתבסס על תגובת עקירת גדילי הדנ"א.עוצמתה של טכניקה זו טמונית ביכולות הליתוגרפיות הרב-שלבית שלה, בשחזור הפשוט שלה ובזמינות המסחרית של כל הרכיבים. בדומה לפתרונות ביו-שבב אחרים, ניתן לשלב את bephore עם טכנולוגיות שונות. לדוגמה, מברשות גנים פונקציונליות ניתן להרכיב בתוך מיקרו תאים לביטוי חלבון.כדי להתחיל, להכין תערובת RCA על ידי ערבוב מים חמישה חלקים עם חלק אחד של תותב אמוניה 30% ב זכוכית. מחממים את התערובת ל-70 מעלות צלזיוס על צלחת חמה תוך כדי ערבוב. ברגע שהוא מגיע 70 מעלות צלזיוס, להוסיף חלק אחד 30% מי חמצן.לאחר מכן מניחים רקיק סיליקון בקוטר 100 מ"מ לתוך הפתרון, כדי להסיר ממנו חומר אורגני וחלקיקים. לאחר 30 דקות, מוציאים את המצע, שוטפים אותו ביסודיות במים מבקבוק כביסה, ומייבשים אותו באקדח חנקן. מיד להמשיך עם PEGylation של המצע.כדי להשיג זאת, תחילה לדלל ביוטין-PEG-Silane בטולואן יבש ל 5 מיליגרם למיליליטר, ומערבולת הפתרון עד שהוא מעורבב היטב. עם המצע ממוקם צלחת פטרי זכוכית, לאט pipette הפתרון על המצע, מכסה את כל פני השטח, אבל להימנע לאפשר את הפתרון לזרום מעבר לקצה. לאחר המשטח מכוסה, לסגור את צלחת פטרי, ולאחר מכן להוסיף כיסוי נוסף.לאחר 30 דקות, להסיר את הכיסוי, ולהוסיף כ 40 מיליליטר של אלכוהול isopropyl לצלחת פטרי. ואז להוציא את המצע, לשטוף אותו שוב ביסודיות עם אלכוהול isopropyl, ולייבש אותו עם אקדח חנקן. כאשר יבש, לאחסן את המצע בחושך עד שהוא נחוץ.הכן מצע באמצעות חותך זכוכית או אזמל כדי ליצור סנטימטר אחד על ידי חתיכות סנטימטר אחד. לאחר מכן, הוסף סימון יישור פשוט על-ידי יצירת שריטה קצרה מהמרכז לכיוון קצה המצע. לפוצץ את כל החלקיקים הקטנים את השבב באמצעות אקדח חנקן.לאחר מכן, מערבבים שתי טיפות של דבק סיליקון דו-רכיבי, ומחילים את הדבק על פני השטח של השבב, ומשאירים את האזור סביב קצה השריטה ריק. שם הדבק מספק מחסום הידרופובי, שמירה על פתרונות מים על השבב. זה מקל על צעדי הכביסה הבאים, ומפחית את כמות ה-DNA הנדרשת עבור דגירה.בשלב מאוחר יותר, הדבק ניתן לקלף בקלות. בשלבים הבאים, DNA photocleavable מטופל רק בסביבת אור צהוב. מכסים את השבב בכ-10 מיקרוליטרים של תערובת בפור בטמפרטורת החדר, ומציבים את השבב בקופסה מלאה חלקית במים כדי להפחית את האידוי.לאחר שעה אחת, לשטוף את השבב מספר פעמים עם PBS כדי להסיר כל תערובת bephore מאוגד. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של תערובת פסיבציה לשבב. לאחר שעתיים, לשטוף את השבב מספר פעמים עם PBS כדי להסיר את סוכני פסיבציה מאוגדת.חותכים מסכת צילום מודפסת לגודל המתאים כדי להתאים למחזיק מסכה מתאים. הוסף אותו במיקום עצירת השדה ולהשתמש ב סימוני היישור כדי ליישר את המסיכה במחזיק. כאשר המצע ממוקם על שלב המיקרוסקופיה, הכנס מסנן אדום לנתיב התאורה והתמקד על משטח המצע.לאחר מכן, נווט אל אזור המצע אשר ייחשף. לאחר מכן, הכנס את מחזיק המסיכה, חסום את התאורה ושנה למסנן UV. בעוצמת אור נמוכה, פתח את התריס ולהשתמש במצלמה כדי למקד במהירות את המסכה על המצע.כאשר המצע מיושר כעת והמסכה ממוקדת, חסום את נתיב האור למצלמה והאיר את המצע בעוצמת אור גבוהה לזמן החשיפה הרצוי. לאחר החשיפה, הסר את הדגימה מהמיקרוסקופ, והסר בזהירות מאגר רב ככל האפשר מהמצע מבלי לייבש אותו. לאחר מכן, להוסיף 10 עד 20 microliters של DNA עם הרצף עבור חיבור על פני השטח.מניחים את המצע בקופסה רטובה כדי למנוע ממנו להתייבש, ודגירה את ה-DNA על המצע במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. על מנת להתבונן בביטוי הגן המודר במיקרוסקופ הפוך, הכינו תחילה בנפרד את שני החלקים של מחזיק הדגימה. התחל על ידי הדבקת שבב bephore עם מברשת גנים משותקת על מחזיק השבב, באמצעות סרט דבק דו צדדי.לאחר מכן, הוסיפו קצת שומן ואקום סביב החור המרכזי של החלק התחתון של המחזיק, והכניסו את מחזיק השבב. עכשיו להרכיב את החלק העליון של המחזיק. חותכים שבב PDMS דק עם תאים קטנים ככל האפשר, משאיר ערוץ פתוח לצד אחד מאוחר יותר לאפשר חילופי פסולת ומולקולות מבשר על ידי דיפוזיה הבא, פלזמה לטפל להחליק כיסוי זכוכית בצד האחורי של שבב PDMS עם פלזמת חמצן.מיד לאחר הטיפול, מניחים את שבב PDMS במרכז מגלשת הזכוכית, כאשר התאים מצביעים כלפי מעלה. לאחר מכן, אופים את ה עם PDMS במשך שעה אחת ב 70 מעלות צלזיוס. זמן קצר לפני הרכבת מחזיק הדגימה כולו, פלזמה לטפל במגלשת הזכוכית עם שבב PDMS כמו קודם.לאחר מכן, הוסיפו קצת שומן ואקום סביב החור הגדול של המחזיק העליון, והצבו עליו את מגלשת הזכוכית עם ה-PDMS. לוחצים בעדינות את הזכוכית על השומן. בזהירות להסיר את המאגר מהשבב, ולשטוף אותו פעם אחת עם 10 microliters של מערכת ביטוי עצמי.לאחר מכן, הוסיפו 60 מיקרוליטרים של מערכת ביטוי עצמי לשבב, והסירו את דבק הסיליקון הדו-רכיבי מהקצוות. עכשיו, להוסיף 20 microliters של מערכת הביטוי על PDMS. לאחר הנחת טיפה על PDMS, לבדוק במהירות את המיקרוסקופ סטריאוסקופי כי התאים רטובים היטב וללא בועות אוויר.אם יש בועות אוויר, לנסות לשטוף אותם משם. כדי להרכיב את שתי החלקים של המחזיק, וליישר תאים ומברשות DNA, לעבוד תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. שתק את המחזיק התחתון בזרוע אחיזה כך ששני הברגים וגני הכנפיים יהיו נגישים בקלות בשתי הידיים.הכנס את המחזיק העליון למחזיק התחתון והורד אותו עד ששחררות מערכת הביטוי ללא תאים יתמזגו. לאחר מכן, ודאו שהתאים וסימן היישור נמצאים באזור דומה במישור XY. מלמטה, לדפוק את כנף עד שהם נוגעים בצד התחתון של המחזיק.תוך יישור התאים ואת השבב במישור XY, הדק בעדינות את כנפי הכנף. שלב זה דורש ניסיון מסוים, ותלוי בבניית בעל הדגימה. יש ללחוץ על ה-PDMS על השבב רק בכוח עדין.לאחר מכן, לרסס ספוג במארז נגד אידוי עם מים, ולהכניס את המחזיק לתוך התיבה. לאחר מכן, מלא מזרק חמישה מיליליטר עם דבק סיליקון שני רכיבים, ולהשתמש בו כדי לאטום את התיבה. לבסוף, מעבירים את התיבה למיקרוסקופ מבוקר טמפרטורה, ומדמים את מברשת הדנ"א ואת התגובה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.תהליך ליתוגרפי בן שני שלבים, המבוצע כאן על מגלשת זכוכית בפור, מניב דפוסים חופפים של גדילי דנ"א המסומנים באופן פלואורסצנטי. בהדגמה זו של ביטוי גנים על שבב, DNA משותק בתא בצד השמאל. כאשר נחשפים לתערובת הביטוי, חלבון הפלואורסצנט הצהוב YPet מסונתז מהדנ"א משותק.כדי להעריך את הפעילות של מערכת ביטוי הגנים, התאוששות הפלואורסצנטיות נצפית לאחר שלב הלבנה. במשך שעתיים, עוצמת הפלואורסצנטיות התאוששה במהירות. עם זאת, לאחר ארבע ושש שעות, זה לא התאושש, המציין כי ללא אספקה טרייה של תערובת הביטוי, התגובה הסתיימה סביב שעה ארבע.למרות ביטוי גנים מוגבל במערכת סגורה, זה יכול להתקיים על פני פרקי זמן ארוכים יותר על ידי אספקת תאי הביטוי עם מולקולות מבשר נוספות באמצעות מיקרו נוזלים. שיטת bephore משמשת לשתק אוליגונוקלאוטידים או DNA באורך גנים, אשר ניתן ליישם כדי לבנות מערכות של מברשות DNA אינטראקציה לביטוי גנים מחדש עצמית. הטכניקה עשויה לשמש גם עבור יישומים אחרים בביופיזיקה, כגון מחקרי פלואורסצנטיות מולקולה אחת.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לפברק ביוצ'ים bephore מן ופלים או שקופיות זכוכית, ולשלב אותם בפרויקטים המחקר שלך.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

תרפיה מערכת Mirror רובוטית עבור התאוששות תפקודית של Arms ומחוסר

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

ליתוגרפיה של קרן יון ממוקדת לחרוט ננו-ארכיטקטורות למיקרואלקטרודות

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

מוחין זרימת דם מבוסס על המצב מנוחה קישוריות תפקודית של המוח האנושי באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם אופטי לפזר

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

ייצור ואפיון כמותי של ציסטות אפיתל מרה פונקציונליות ומקוטבות

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

שכפול של מבנה משטח שורש באמצעות שינוי של ליתוגרפיה רכה

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...