Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Vi erkjenner takknemlig støtte for dette prosjektet av Volkswagen Stiftung (grant nr 89 883) og europeiske forskningsråd (grant avtalen nummer 694410 - AEDNA). MASTERGRAD-S. erkjenner støtter DFG gjennom GRK 2062.

Merk: En timeplan for trinnene i de ulike delene er gitt i den utfyllende informasjonen (del 1).
1. chip fabrikasjon
Merk: som underlag, bruk silisiumskiver (100 mm diameter, 0.525 mm tykkelse) med en 50 nm tykt lag av silisium dioksid eller glass lysbilder (24 mm x 24 mm, nr 1.5, 22 mm x 50 mm, nummer 4). Avhengig av applikasjonen, kan andre størrelser og tykkelser være bedre egnet.
<ol><li>Rengjøring av underlag via en RCA ren prosedyre (vann, ammoni...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

Bephore litografi er en robust og allsidig teknikk for den mønstrede immobilisering av DNA eller RNA. Likevel, prosedyren inneholder flere tiltak, som - hvis endret - kan være en kilde for manglende eller redusert ytelse av systemet.
Et viktig skritt i produksjon av Bephore chips er PEGylation av underlaget, som gir biokompatibilitet av overflaten. Her er rengjøringsprosessen med en RCA-prosedyre viktig, siden den også aktiveres overflaten for den påfølgende silanization. Under den fakti...

Cellen gratis genuttrykk reaksjoner er av stor interesse for ulike applikasjoner i biokjemi, bioteknologi og syntetisk biologi. Celle-frie uttrykk for proteiner var for utarbeidelse av ren protein prøver, som var grunnlaget for flere studier i strukturell biologi. For eksempel ble celle-frie systemer brukt for uttrykket av protein komplekser1 eller membran proteiner2, som er vanskelige å produsere bruker cellebasert uttrykk. Spesielt, celle-gratis genuttrykk reaksjoner ble også brukt til å belyse strukturen i den genetiske koden, starter med den banebrytende eksperimentet ved Nirenberg og Matthaei i 19613.
Nylig har det vært en fornyet interesse i celle-fri metoder i bioteknologi og syntetisk biologi4,5,6. Celle-frie systemer kan utvides med ikke-biologisk forbindelser, og komponentene i ulike biologiske opphavet kombineres lettere7. Selv om celle-frie systemer har den åpenbare ulempen at de ikke "vokse og dele", er det tenkelig å forberede åpen celle-fri bioreaktorer med grunnleggende metabolske funksjoner og la dem syntetisere metabolitter når enkle karbon og energi innganger8. I det nye feltet på syntetisk biologi lover celle-frie systemer å være en mer forutsigbar "chassis" for implementering av syntetiske biologiske funksjoner.
Foreløpig celle-fri gene expression reaksjoner utføres enten ved hjelp av cellen ekstrakter (fra ulike kilder som bakterier, gjær, insekter), eller transkripsjon/oversettelse systemer som var optimalisert for ulike programmer (f.eks Prokaryotic og eukaryotic genuttrykk, produksjon av membran proteiner, etc.). En populær protokoll for utarbeidelse av bakteriell celle ekstrakt (ofte kalt TXTL) ble levert nylig av V. Noireaux og kolleger9. Egenskapene Biofysiske har vært grundig preget10, og TXTL systemet har allerede brukt klarer å utføre en rekke komplekse biokjemiske oppgaver: f.eks montering av funksjonelle bacteriophages via celle-frie uttrykk phage genomet11, syntese av bakteriell protein filamenter12eller gjennomføringen av celle-fri genet kretser13,14.
Et annet system populært i celle-fri syntetisk biologi er ren systemet, som er rekonstruert fra renset komponenter15,16. Sammenlignet med TXTL systemet, inneholder den ikke nucleases eller protein fornedrelse maskiner. Mens nedbrytning av lineær DNA, RNA molekyler eller proteiner er mindre av et problem i ren systemet, forfall veier er faktisk viktige for gjennomføring av dynamiske funksjoner. For å redusere effekten av exonuclease nedbrytning av lineær genet maler i systemet TXTL (gjennom RecBCD), har end-beskytte GamS protein å bli addert. Både i TXTL og ren systemet er kommersielt tilgjengelig.
Et tema knyttet nært til celle-fri biologi bekymringer studier av effekten av compartmentalization på biokjemiske reaksjoner og ytterligere etableringen av kunstige celle-lignende strukturer eller protocells17,18,19 ,20. Forskning på kunstig celler innebærer vanligvis innkapsling av en biokjemiske reaksjonssystemet i vesicula rom laget av fosfolipider eller andre amphiphiles. Mens slike systemer hjelpe for å utforske grunnleggende aspekter av compartmentalization eller fremveksten av cellularity og selvreproduserende strukturer, de står overfor de typiske problemene på lukkede systemer: i fravær av en fungerende metabolisme og riktig membran transportmekanismer, er det vanskelig å holde compartmentalized reaksjoner kjører for lengre perioder - drivstoff molekyler er oppbrukt og avfallsprodukter akkumulere.
Et interessant alternativ til compartmentalization i slike celle-mimicking rom er romlig organisering av genetisk materiale ved hjelp photolithographic metoder. Immobilisering av "gener på en chip" ble utviklet av Bar-Ziv group ved Weizmann Institute mer enn ti år siden21. Blant de store problemene som måtte løses var uspesifisert opptak av DNA og den potensielle denaturering av proteiner på chip overflaten. Bar-Ziv et al. utviklet en dedikert klima og jordsmonn motstå kalt "Daisy", som besto av en reaktiv terminal silane for immobilisering av motstå molekyler på silisium dioksid overflater, en lang polyetylenglykol (PEG) spacer som sikret biocompatibility, og en photocleavable headgroup, som ble omgjort til en reaktiv Amin ved bestråling med ultrafiolett (UV) lys. Det har vist at Daisy kan brukes til nakkens genet lengde DNA molekyler (med lengder av flere kilo base-parene (kbp)) på chip underlag. Fra en polymer fysikk synspunkt representerte systemene polymer børster podet på et solid substrat. På grunn av polyelectrolyte natur DNA, er konformasjon av disse børster sterkt påvirket av osmotisk og andre ion-spesifikke effekter22,23.
Viktigst, har det vært vist at substrat-immobilisert gener funksjonelle og kan være transkribert og oversatt til RNA og protein. Gene børster er tilgjengelig for RNA polymerases fra løsning24komplekse macromolecular blanding av transkripsjon/oversettelsen er ikke denaturert på overflaten. En av fordelene ved immobilisering av genetisk komponentene på et substrat er at de kan brukes i et åpent microfluidic reaktoren system som kontinuerlig leveres med små forløper molekyler og fra hvilke avfallsprodukter kan fjernet25 , 26.
Vi har nylig utviklet en variant av denne metoden kalles Bephore (for biokompatible elektronstråle og photoresist)27, som var basert på kommersielt tilgjengelige komponentene og utnyttet sekvens-spesifikke DNA strand invasjonen reaksjoner for realisering av en enkel å implementere må litografi prosedyre for etableringen av chip-baserte kunstig celler. En skjematisk oversikt over prosedyren er vist i figur 1. Den er basert på DNA hårnål molekyler som inneholder en photocleavable-gruppen som er blokkert på et biokompatible PEG-lag. Photocleavage av hårnål viser en enkelt-strandet toehold sekvens, gjennom hvilke DNA molekyler av interesse (inneholder "fortrenger" DIS sekvensen) kan være tilkoblet via toehold-mediert strand invasjon.
Mens Bephore er potensielt enklere å implementere, Daisy gjør at realisering av svært tett og rent "gene børster", som har fordeler i enkelte programmer. I prinsippet, men kan Daisy og Bephore litografi lett kombineres. En relaterte litografi metoden bruker DNA strand forskyvning for strukturering DNA børster på gull ble utviklet av Huang et al., men ble ikke benyttet i sammenheng med celle-fri gene expression28,29.
I følgende protokollen gir vi en detaljert beskrivelse av produksjonen av DNA børster for celle-fri genuttrykk med metoden Bephore. Beskriver vi hvordan genet chips fremstille og demonstrere bruk av flere trinn Foto-litografi for romlig strukturert immobilisering av gener på en brikke. Vi diskuterer også fabrikasjon av reaksjon kamre og anvendelse av microfluidics for ytelsen på prosessoren gene expression reaksjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

Immobilisering av gener på lithographically strukturerte overflater kan studere compartmentalized genet uttrykk prosesser i en åpen microfluidic bioreactor system. I motsetning til andre tilnærminger til kunstig cellulær systemer tillater slikt oppsett en kontinuerlig tilførsel med gene expression reagenser og samtidige drenering av avfallsstoffer. Dette forenkler implementering av celle-fri gene expression prosesser over lengre perioder, som er viktig for realisering av dynamisk genet regulatoriske tilbakemeldingssystemer. Her gir vi en detaljert protokoll for fabrikasjon av genetiske biochips med en enkel-å-bruk litografisk teknikk basert på DNA strand forskyvning reaksjoner, som utelukkende bruker kommersielt tilgjengelige komponenter. Vi tilbyr også en protokoll på integrering av compartmentalized gener med en polydimethylsiloxane (PDMS)-basert microfluidic system. Videre vise vi at systemet er kompatibel med total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, som kan brukes til direkte observasjon av molekylære interaksjoner mellom DNA og molekyler i uttrykk blanding.

Totrinns litografi: figur 5 viser resultatet av en litografisk prosess på et glass lysbilde med overlappende mønstre av fluorescently merket DIS tråder.
Uttrykk for et lysstoffrør protein fra gene pensel: figur 6 viser uttrykk for fluorescerende protein YPet fra immobilisert DNA. På flere punkter i tid vi vurdert gene expression frekvensen av delvis bleking fluores...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Vi beskriver en enkel litografisk prosedyre for immobilisering av genet lengde DNA molekyler på en overflate, som kan brukes til å utføre celle-fri gene expression eksperimenter på biochips.

Funksjonell overflaten-immobilisering av gener bruker må Strand forskyvning Litografi

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

DNA biochips er en attraktiv forskningsplattform for selvresyntetisk biologi, opprinnelig utviklet av BASF-gruppen, noe som gjør det mulig å drifte in vitro genkretser over lengre perioder. Med denne protokollen håper vi å gjøre denne teknologien tilgjengelig for et bredere spekter av forskere. Vår metode, be begrepet bephore litografi, representerer en strategi for immobilisering av DNA basert på DNA-strengforskyvningsreaksjonen.Styrken av denne teknikken ligger i sine flertrinns litografiske evner, dens enkle reproduserbarhet og den kommersielle tilgjengeligheten av alle komponentene. I likhet med andre biochip-løsninger kan befor kombineres med forskjellige teknologier. For eksempel kan funksjonelle genbørster monteres i mikrorom for proteinuttrykk.Til å begynne med, lag en RCA-blanding ved å blande fem deler vann med en del av en 30% ammoniakkløsning i et glassbeger. Varm blandingen til 70 grader Celsius på en kokeplate under omrøring. Når den når 70 grader Celsius, legg til en del 30% hydrogenperoksid.Legg deretter en 100 millimeter diameter silisiumwafer i løsningen, for å fjerne organisk materiale og partikler fra den. Etter 30 minutter, ta ut underlaget, skyll det grundig med vann fra en vaskeflaske, og tørk det med en nitrogenpistol. Fortsett umiddelbart med PEGylation av substratet.For å oppnå dette, først fortynne biotin-PEG-Silane i tørr toluen til 5 milligram per milliliter, og vortex løsningen til den er godt blandet. Med underlaget plassert i et glass Petri skål, sakte pipette løsningen på underlaget, dekker hele overflaten, men unngå å la løsningen til å flyte over kanten. Når overflaten er dekket, lukk petriskålen, og legg deretter til et ekstra deksel.Etter 30 minutter, fjern dekselet, og legg til ca 40 milliliter isopropylalkohol til petriskålen. Ta deretter ut underlaget, skyll det igjen grundig med isopropylalkohol og tørk det med en nitrogenpistol. Når det er tørt, oppbevar underlaget i mørket til det er nødvendig.Forbered et substrat ved hjelp av en glasskutter eller en skalpell for å danne en centimeter med en centimeter stykker. Deretter legger du til et enkelt justeringsmerke ved å gjøre en kort ripe fra midten mot en kant av substratet. Blås noen små partikler av brikken ved hjelp av en nitrogenpistol.Deretter blander du to dråper av et to-komponent silikonlim, og påfør limet på overflaten av brikken, slik at området rundt spissen av ripen er tom. Der gir limet en hydrofob barriere, og holder vandige løsninger på brikken. Dette forenkler påfølgende vasketrinn, og reduserer mengden DNA som kreves for inkubasjoner.I et senere trinn kan limet lett skrelles av. I de følgende trinnene håndteres fotoklart DNA bare i et gult lysmiljø. Dekk brikken med ca 10 mikroliter av en bephore blanding ved romtemperatur, og legg brikken i en boks delvis fylt med vann for å redusere fordampning.Etter en time vask brikken flere ganger med PBS for å fjerne eventuelle ubundet bephore mix. Deretter legger du til 10 mikroliter av passiviseringsblandingen til brikken. Etter to timer vasker du brikken flere ganger med PBS for å fjerne de ubundne passiviseringsagentene.Klipp en trykt fotomaske til riktig størrelse for å passe til en passende maskeholder. Sett den inn i feltstopperets posisjon, og bruk justeringsmerkene til å justere masken i holderen. Når underlaget er plassert på mikroskopistadiet, setter du inn et rødt filter i belysningsbanen og fokuserer på substratoverflaten.Deretter navigerer du til regionen av underlaget som vil bli utsatt. Deretter setter du inn maskeholderen, blokkerer belysningen og bytter til UV-filteret. Ved lav lysintensitet åpner du lukkeren og bruker kameraet til raskt å fokusere masken på underlaget.Med underlaget nå justert og masken i fokus, blokkere lysbanen til kameraet, og belyse substratet med høy lysintensitet for ønsket eksponeringstid. Etter eksponering, fjern prøven fra mikroskopet, og fjern forsiktig så mye buffer som mulig fra substratet uten å tørke den. Deretter legger du til 10 til 20 mikroliter DNA med sekvensen for feste til overflaten.Plasser underlaget i en våt boks for å hindre at det tørker, og inkuber DNA-et på underlaget i to timer ved romtemperatur. For å observere det kompartaliserte genuttrykket på et omvendt mikroskop, må du først forberede de to delene av prøveholderen separat. Start med å lime en bephore chip med en immobilisert genbørste på chip holderen, ved hjelp av dobbeltsidig tape.Deretter legger du til litt vakuumfett rundt det sentrale hullet i den nederste delen av holderen, og setter inn sponholderen. Monter nå den øverste delen av holderen. Klipp en tynn PDMS-chip med rom så små som mulig, slik at en kanal er åpen for den ene siden for senere å tillate utveksling av avfall og forløpermolekyler ved diffusjon Neste, plasma-behandle et glassdeksel slip i baksiden av PDMS chip med oksygenplasma.Umiddelbart etter behandling plasserer du PDMS-brikken i midten av glasslysbildet, med rommene pekende oppover. Deretter bake glasset med PDMS i en time ved 70 grader Celsius. Kort tid før du monterer hele prøveholderen, må du sette sammen glasslysbildet med PDMS-chipen som før.Tilsett deretter litt vakuumfett rundt det store hullet på toppholderen, og plasser glasssklien med PDMS på den. Trykk glasset forsiktig på fettet. Fjern bufferen forsiktig fra brikken, og vask den en gang med 10 mikroliter selvrepresjonssystem.Deretter legger du til 60 mikroliter selvrepresjonssystem på brikken, og fjerner silikonlimet med to komponenter fra kantene. Legg nå til 20 mikroliter av uttrykkssystemet på PDMS. Etter å ha plassert dråpen på PDMS, må du raskt sjekke inn det stereoskopiske mikroskopet at rommene er godt våte og uten luftbobler.Hvis det er luftbobler, prøv å vaske dem bort. For å montere de to delene av holderen, og for å justere kamre og DNA børster, arbeid under et stereoskopisk mikroskop. Immobiliser bunnholderen med en griperarm slik at de to skruene og vingenøttene lett vil være tilgjengelige med begge hender.Sett den øverste holderen inn i bunnholderen, og senk den til cellefritt uttrykkssystemdråper smelter sammen. Kontroller deretter at rommene og justeringsmerket er i et lignende område i XY-planet. Fra bunnen skrur du opp vingemutterne til de berører undersiden av holderen.Mens du justerer rommene og brikken i XY-planet, strammer du forsiktig vingenøttene. Dette trinnet krever litt erfaring, og avhenger av byggingen av prøveholderen. PDMS skal bare trykkes på brikken med skånsom kraft.Spray deretter en svamp i antifordampningskabinettet med vann, og sett holderen inn i esken. Fyll deretter en fem milliliter sprøyte med to-komponent silikonlim, og bruk den til å forsegle boksen. Til slutt overfører du boksen til et temperaturkontrollert mikroskop, og bilde DNA-børsten og reaksjonen ved hjelp av fluorescensmikroskopi.En to-trinns litografisk prosess, her utført på et bephore glass lysbilde, gir overlappende mønstre av fluorescerende merkede DNA-tråder. I denne demonstrasjonen av genuttrykk på chip immobiliseres DNA i kammeret til venstre. Når det utsettes for uttrykksblandingen, syntetiseres det gule fluorescerende proteinet YPet fra det immobiliserte DNA-et.For å vurdere aktiviteten til genuttrykkssystemet observeres utvinningen av fluorescensen etter et blekingstrinn. Etter to timer ble fluorescensintensiteten raskt gjenopprettet. Men etter fire og seks timer, det ikke gjenopprette, noe som indikerer at uten en frisk tilførsel av uttrykket blanding, reaksjonen avsluttet rundt time fire.Selv om genuttrykket er begrenset i et lukket system, kan det opprettholdes over lengre perioder ved å forsyne uttrykksrommene med ekstra forløpermolekyler via mikroflytende. Beformetoden brukes til å immobilisere oligonukleotider eller genlengde DNA, som kan brukes til å konstruere systemer for interagerende DNA-børster for selvregenereringsuttrykk. Teknikken kan også brukes til andre applikasjoner i biofysikk, for eksempel enkeltmolekyl fluorescens studier.Etter å ha sett denne videoen, bør du kunne dikte bephore biochips fra wafers eller glass lysbilder, og integrere dem i forskningsprosjekter.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillær Force Litografi for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generasjon av alliansefrie Funksjonell Myocardial Tissue Gjennom Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy System for funksjonell bedring av hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Utvikling av en elektrokjemisk DNA Biosensor å oppdage en infeksjon patogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Fokusert ion Beam litografi å etse nano-arkitekturer i Microelectrodes

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

Cerebral blodstrøm-basert hviletilstand funksjonell tilkobling av den menneskelige hjerne ved hjelp av optisk diffus korrelasjon spektroskopi

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Generasjon og kvantitativ karakterisering av funksjonelle og polariserte gallepitelcyster

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetisk replikering av rotoverflatemikrostruktur ved bruk av endring av myk litografi

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering av dynamiske miljøforhold ved hjelp av en mikrofluidisk enhet med høy gjennomstrømning

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...