Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
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Com gratidão reconhecemos o apoio financeiro para este projeto, a Volkswagen Stiftung (grant, n. º 883 de 89) e o Conselho Europeu de investigação (concessão acordo n. º 694410 - AEDNA). M.S.-S. reconhece o apoio pelo DFG através de Silvina 2062.

Nota: Um calendário para as etapas nas seções diferentes consta a informação suplementar (seção 1).
1. fabricação do chip
Nota: como substratos, wafers de silício de uso (diâmetro de 100 mm, espessura de 0,525 mm) com 50 nm espessa camada de dióxido de silício ou lâminas de vidro (24 mm x 24, n. º 1.5; 22 mm x 50 mm, n º 4). Dependendo da aplicação, outros tamanhos e espessuras podem ser mais apropriadas.
<ol><li>Limpeza a substratos através...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

Litografia de Bephore é uma técnica robusta e versátil para a imobilização padronizada de DNA ou RNA. Ainda, o procedimento inclui várias etapas, que - se alterado - podem ser uma fonte para falha ou reduzir o desempenho do sistema.
Um passo crucial na fabricação de chips de Bephore é a PEGylation do substrato, que fornece a biocompatibilidade da superfície. Aqui, a etapa de limpeza com um procedimento RCA é importante, desde que ele também ativa a superfície para a silanização ...

Célula-liberdade de expressão de gene reações são de grande interesse para várias aplicações de biotecnologia, bioquímica e biologia sintética. Célula-livre expressão de proteínas foi fundamental para a preparação de amostras de proteína pura, que serviram de base para inúmeros estudos em biologia estrutural. Por exemplo, sistemas de célula livre foram usados com sucesso para a expressão da proteína complexos1 ou membrana proteínas2, que são difíceis de produzir usando a expressão baseada em célula. Notavelmente, célula livre expressão gênica reações também foram utilizadas para elucidar a estrutura do código genético, começando com os inovadoras experimentos por Nirenberg e Matthaei em 19613.
Recentemente, tem havido um interesse renovado em métodos sem célula em biotecnologia e biologia sintética4,5,6. Sistemas sem célula podem ser aumentados com compostos não-biológico, e componentes de origem biológica diversa podem ser combinadas mais facilmente7. Apesar de sistemas sem célula têm a desvantagem aparente que eles não fazem "crescer e se dividir", é concebível para preparar aberto sem célula biorreatores com funções metabólicas básicas e deixá-los a sintetizar metabólitos quando fornecido com energia e carbono simples entradas8. Dentro o campo emergente da biologia sintética, sistemas sem célula prometem ser um "chassis" mais previsível para a implementação de funções biológicas sintéticas.
Atualmente, as reações de expressão do gene sem célula são realizadas utilizando célula extrai (a partir de diferentes fontes tais como bactérias, leveduras, insetos), ou sistemas de transcrição e tradução que foram otimizados para diferentes aplicações (por exemplo, procariotas vs eucariotas expressão gênica, produção de proteínas de membrana, etc.). Um protocolo popular para a preparação do extrato de célula bacteriana (comumente denominado TXTL) foi fornecido recentemente por V. Noireaux e colegas de trabalho9. Suas propriedades biofísicas tem sido completamente caracterizadas10, e o sistema TXTL foi já utilizado com sucesso para realizar uma série de tarefas bioquímicas complexas: por exemplo, o assembly de bacteriófagos funcional através de célula-livre expressão do genoma do fago11, a síntese de proteínas bacterianas filamentos12ou a implementação de circuitos de gene sem célula13,14.
Popular em biologia sintética sem célula outro sistema é o sistema puro, que é reconstituído a partir de componentes purificados15,16. Em comparação com o sistema TXTL, ele não contém nucleases ou máquinas de degradação de proteínas. Enquanto a degradação do DNA linear, moléculas de RNA ou proteínas é menos de um problema do puro sistema, caminhos de decaimento são realmente importantes para a implementação de funções dinâmicas. Para reduzir o efeito de degradação do exonuclease de modelos lineares gene no sistema TXTL (por RecBCD), a proteína de GamS extremidade-proteger tem a ser adicionado. Tanto o TXTL e o sistema puro estão comercialmente disponíveis.
Um tema intimamente relacionado às preocupações de biologia celular-free o estudo do efeito da compartimentalização em reações bioquímicas e ainda mais a criação de estruturas artificiais célula ou protocélulas17,18,19 ,20. Pesquisa sobre células artificiais normalmente envolve o encapsulamento de um sistema de reação bioquímica dentro de compartimentos vesiculares de fosfolipídios ou outros amphiphiles. Enquanto tais sistemas ajudam a explorar os aspectos fundamentais da compartimentalização, ou o surgimento de celularidade e estruturas auto-replicante, que enfrentam os problemas típicos de sistemas fechados: na ausência de um metabolismo funcional e apropriado mecanismos de transporte de membrana, é difícil manter reações compartimentadas correndo por longos períodos de tempo - usadas de moléculas de combustível e produtos de resíduos se acumulam.
Uma alternativa interessante para compartimentalização dentro desses compartimentos celulares-imitando é a organização espacial do material genético usando métodos fotolitográfica. Imobilização de "genes em um chip" foi pioneira pelo grupo no Instituto Weizmann de Bar-Ziv há mais de dez anos21. Entre as principais questões que precisavam ser resolvidos foram a adsorção não específica de DNA e a potencial desnaturação das proteínas na superfície do chip. Bar-Ziv et al desenvolveram um resist fotolitografia dedicado denominado "Daisy", que era composto de um silano reativo terminal para a imobilização das moléculas sobre superfícies de dióxido de silício, resiste um espaçador de longa polietileno glicol (PEG) que assegurou biocompatibilidade e uma headgroup photocleavable, que foi convertido em uma amina reativa após irradiação com luz ultravioleta (UV). Ficou demonstrado que a Daisy pode ser usado para imobilizar a moléculas de DNA do gene-comprimento (com comprimentos de vários quilo-pares de bases (kbp)) sobre uma superfície de chip. Polímero física ponto de vista, os sistemas representaram escovas de polímero enxertadas em um substrato sólido. Devido à natureza do polyelectrolyte do DNA, a conformação dessas escovas é fortemente afetada pela osmótica e outros efeitos íon-específicos de22,23.
O mais importante, ficou demonstrado que genes de substrato-imobilizado são ainda funcionais e podem ser transcrita e traduzida para o RNA e proteína. Escovas do gene são acessíveis para ARN-polimerase de solução24, e a mistura complexa macromolecular da transcrição/tradução não é desnaturada na superfície. Uma das vantagens da imobilização dos componentes genéticos sobre um substrato é que podem ser operados em um sistema de reator aberto microfluidic continuamente fornecido com moléculas precursoras pequenas e de produtos que resíduos podem ser removidos25 , 26.
Recentemente desenvolvemos uma variante desse método denominado Bephore (para o feixe de elétrons biocompatível e fotorresiste)27, que foi baseado exclusivamente em componentes disponíveis comercialmente e utilizadas sequência-DNA strand invasão a reacções específicas para a realização de um procedimento simples para implementar várias etapas litografia para a criação de células artificiais baseada no chip. Uma visão esquemática do processo é mostrada na Figura 1. É baseado no gancho de cabelo as moléculas de DNA que contém um grupo de photocleavable, que são imobilizadas em uma camada de PEG biocompatível. Photocleavage do gancho de cabelo apresenta uma sequência de single-stranded ponto de apoio, através do qual DNA moléculas de interesse (que contém a sequência DIS "uma substituição") podem ser anexado através de invasão de vertente mediada por ponto de apoio.
Enquanto Bephore é potencialmente mais simples de implementar, Daisy permite a realização de muito denso e limpo "gene" pincéis, que tem vantagens em certas aplicações. Em princípio, no entanto, litografia de Daisy e Bephore poderia ser facilmente combinada. Um método de litografia relacionada utilizando escovas de deslocamento de strand DNA para estruturação do DNA em ouro foi desenvolvido anteriormente por Huang et al, mas não foi utilizado no contexto da expressão de gene sem célula28,29.
O protocolo seguinte nós fornecemos que uma descrição detalhada da produção de DNA brushes para expressão do gene sem célula usando o método Bephore. Descrevemos como os chips de gene são fabricados e demonstram o uso de foto-litografia de várias etapa para a imobilização espacialmente estruturada dos genes em um chip. Discutimos também a fabricação de câmaras de reação e a aplicação de microfluídica para o desempenho das reações de expressão do gene em-microplaqueta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
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functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

Imobilização de genes em superfícies Litograficamente estruturadas permite o estudo do gene compartimentada processos de expressão em um sistema do biorreator microfluidic aberto. Em contraste com outras abordagens para sistemas celulares artificiais, tal uma configuração permite um fornecimento contínuo com reagentes de expressão de gene e drenagem simultânea de produtos residuais. Isto facilita a implementação de processos de expressão do gene sem célula durante longos períodos de tempo, o que é importante para a realização de sistemas de feedback reguladoras do gene dinâmico. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a fabricação de biochips genéticas usando uma simples de usar litográfica técnica baseada em reações de deslocamento do DNA strand, que usa exclusivamente componentes disponíveis comercialmente. Também oferecemos um protocolo sobre a integração dos genes compartimentadas com um polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic sistema baseado. Além disso, mostramos que o sistema é compatível com microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna total, que pode ser usada para a observação direta de interações moleculares entre o DNA e as moléculas contidas na mistura, a expressão.

Litografia de duas etapas: a Figura 5 mostra o resultado de um processo de duas etapas litográfica sobre uma lâmina de vidro com sobreposição de padrões de cordões DIS fluorescente etiquetadas.
Expressão de uma proteína fluorescente de uma escova de gene: Figura 6 demonstra a expressão da proteína fluorescente YPet de DNA imobilizado. Em vários pontos no temp...

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Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

A bióquips de DNA é uma plataforma de pesquisa atraente para a biologia auto-sintética, originalmente desenvolvida pelo grupo BASF, que permite o funcionamento de circuitos genéticos in vitro por longos períodos de tempo. Com este protocolo, esperamos disponibilizar essa tecnologia para uma gama mais ampla de pesquisadores. Nosso método, chamado litografia bephore, representa uma estratégia para a imobilização do DNA com base na reação de deslocamento da cadeia de DNA.A força dessa técnica está em suas capacidades litográficas de várias etapas, sua simples reprodutibilidade e a disponibilidade comercial de todos os componentes. Semelhante a outras soluções biochip, o bephore pode ser combinado com diferentes tecnologias. Por exemplo, escovas genéticas funcionais podem ser montadas dentro de micropartidás para expressão proteica.Para começar, prepare uma mistura de RCA misturando cinco partes de água com uma parte de uma solução de 30% de amônia em um copo de vidro. Aqueça a mistura a 70 graus Celsius em uma placa quente enquanto mexe. Uma vez que atinja 70 graus Celsius, adicione uma parte de peróxido de hidrogênio 30%.Em seguida, coloque um wafer de silício de 100 milímetros de diâmetro na solução, para remover material orgânico e partículas dele. Depois de 30 minutos, retire o substrato, enxágue-o bem com água de uma garrafa de lavagem e seque-o com uma arma de nitrogênio. Proceda imediatamente com a PEGylation do substrato.Para isso, primeiro diluir biotina-PEG-Silane em tolueno seco a 5 miligramas por mililitro, e vórtice a solução até que esteja bem misturada. Com o substrato colocado em uma placa de vidro Petri, lentamente pipeta a solução sobre o substrato, cobrindo toda a superfície, mas evite permitir que a solução flua sobre a borda. Uma vez que a superfície esteja coberta, feche a placa de Petri e adicione uma tampa adicional.Após 30 minutos, retire a tampa e adicione aproximadamente 40 mililitros de álcool isopropílico à placa de Petri. Em seguida, pegue o substrato, enxágüe-o novamente completamente com álcool isopropílico, e seque-o com uma arma de nitrogênio. Quando secar, armazene o substrato no escuro até que seja necessário.Prepare um substrato usando um cortador de vidro ou um bisturi para formar um centímetro por pedaços de um centímetro. Em seguida, adicione uma simples marca de alinhamento, fazendo um pequeno arranhão do centro em direção a uma borda do substrato. Tire qualquer pequena partícula do chip usando uma arma de nitrogênio.Em seguida, misture duas gotículas de uma cola de silicone de dois componentes e aplique a cola na superfície do chip, deixando a área ao redor da ponta do arranhão em branco. Lá a cola fornece uma barreira hidrofóbica, mantendo soluções aquosas no chip. Isso facilita as etapas subsequentes de lavagem e reduz a quantidade de DNA necessária para incubações.Em um passo posterior, a cola pode ser facilmente descascada. Nas etapas a seguir, o DNA fotocleásable é manuseado apenas em um ambiente de luz amarela. Cubra o chip com cerca de 10 microliters de uma mistura bephore à temperatura ambiente, e coloque o chip em uma caixa parcialmente cheia de água para reduzir a evaporação.Depois de uma hora, lave o chip várias vezes com PBS para remover qualquer mistura de bephore não ligada. Em seguida, adicione 10 microliters da mistura de passivação ao chip. Depois de duas horas, lave o chip várias vezes com PBS para remover os agentes de passivação sem limites.Corte uma máscara de foto impressa no tamanho apropriado para caber um suporte de máscara adequado. Insira-o na posição do campo stop e use as marcas de alinhamento para alinhar a máscara no suporte. Com o substrato colocado no estágio de microscopia, insira um filtro vermelho no caminho de iluminação e concentre-se na superfície do substrato.Em seguida, navegue até a região do substrato que será exposta. Em seguida, insira o suporte da máscara, bloqueie a iluminação e mude para o filtro UV. Em baixa intensidade de luz, abra o obturador e use a câmera para focar rapidamente a máscara no substrato.Com o substrato agora alinhado e a máscara em foco, bloqueie o caminho da luz para a câmera, e ilumine o substrato em alta intensidade de luz para o tempo de exposição desejado. Após a exposição, remova a amostra do microscópio e remova cuidadosamente o máximo de tampão possível do substrato sem secá-la. Em seguida, adicione 10 a 20 microliters de DNA com a sequência para fixação à superfície.Coloque o substrato em uma caixa molhada para evitar que ele seque, e incubar o DNA no substrato por duas horas em temperatura ambiente. Para observar a expressão genética compartimentalizada em um microscópio invertido, primeiro prepare separadamente as duas partes do suporte da amostra. Comece colando um chip bephore com um pincel genético imobilizado no suporte do chip, usando fita adesiva de dois lados.Em seguida, adicione um pouco de graxa de vácuo ao redor do orifício central da parte inferior do suporte e insira o suporte do chip. Agora monte a parte superior do suporte. Corte um fino chip PDMS com compartimentos o mais pequeno possível, deixando um canal aberto para um lado para depois permitir a troca de resíduos e moléculas precursoras por difusão Em seguida, o plasma-treat um deslizamento de tampa de vidro na parte de trás do chip PDMS com plasma de oxigênio.Imediatamente após o tratamento, coloque o chip PDMS no centro do escorregador de vidro, com os compartimentos apontando para cima. Em seguida, asse o copo com o PDMS por uma hora a 70 graus Celsius. Pouco antes de montar todo o suporte de amostra, trate o slide de vidro com o chip PDMS como antes.Em seguida, adicione um pouco de graxa de vácuo ao redor do grande orifício do suporte superior e coloque o deslizamento de vidro com o PDMS sobre ele. Pressione suavemente o vidro sobre a graxa. Remova cuidadosamente o buffer do chip e lave-o uma vez com 10 microliters de sistema de auto-expressão.Em seguida, adicione 60 microliters de sistema de auto-expressão no chip e remova a cola de silicone de dois componentes das bordas. Agora, adicione 20 microliters do sistema de expressão ao PDMS. Depois de colocar a gota no PDMS, verifique rapidamente no microscópio estereoscópico que os compartimentos estão bem molhados e sem bolhas de ar.Se houver bolhas de ar, tente lavá-las. Para montar as duas peças do suporte, e para alinhar câmaras e pincéis de DNA, trabalhe sob um microscópio estereoscópico. Imobilize o suporte inferior com um braço de pegação para que os dois parafusos e asa-de-asa sejam facilmente acessíveis com ambas as mãos.Insira o suporte superior no suporte inferior e abaixe-o até que as gotículas do sistema de livre-célula se fundam. Em seguida, verifique se os compartimentos e a marca de alinhamento estão em uma região semelhante no plano XY. De baixo, estrague as asas até tocarem na parte inferior do suporte.Ao alinhar os compartimentos e o chip no plano XY, aperte suavemente as pontas das asas. Esta etapa requer alguma experiência, e depende da construção do titular da amostra. O PDMS deve ser pressionado sobre o chip apenas com força suave.Em seguida, pulverize uma esponja no compartimento anti-evaporação com água e insira o suporte na caixa. Em seguida, encha uma seringa de cinco mililitros com cola de silicone de dois componentes e use-a para selar a caixa. Finalmente, transfira a caixa para um microscópio controlado pela temperatura, e imagem o pincel de DNA e a reação usando microscopia de fluorescência.Um processo litográfico de duas etapas, aqui realizado em um escorregador de vidro bephore, produz padrões sobrepostos de fios de DNA fluorescentemente rotulados. Nesta demonstração de expressão genética on-chip, o DNA é imobilizado na câmara à esquerda. Quando exposto à mistura de expressão, a proteína fluorescente amarela YPet é sintetizada a partir do DNA imobilizado.Para avaliar a atividade do sistema de expressão genética, a recuperação da fluorescência é observada após uma etapa de branqueamento. Em duas horas, a intensidade da fluorescência recuperou-se rapidamente. No entanto, após quatro e seis horas, não se recuperou, indicando que sem um novo suprimento da mistura de expressão, a reação terminou por volta da hora quatro.Embora a expressão genética seja limitada em um sistema fechado, ela pode ser sustentada por períodos mais longos de tempo, fornecendo os compartimentos de expressão com moléculas precursoras adicionais via micro-fluidics. O método bephore é usado para imobilizar oligonucleotídeos ou DNA de comprimento genético, que pode ser aplicado para construir sistemas de escovas de DNA interativas para expressão auto-regênica. A técnica também pode ser utilizada para outras aplicações em biofísica, como estudos de fluorescência de moléculas únicas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de fabricar bióps bephore de wafers ou slides de vidro, e integrá-los em seus projetos de pesquisa.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Bioengenharia

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Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

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Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

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Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

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