Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Мы с благодарностью признаем финансовую поддержку для этого проекта Volkswagen Stiftung (Грант № 89 883) и Советом европейских исследований (Грант соглашение № 694410 - AEDNA). М.С. S. признает поддержки DFG через ГРК 2062.

Примечание: Время расписание для действия в разных разделах приведен в дополнительной информации (раздел 1).
1. чип изготовление
Примечание: в качестве подложек, использования кремниевых пластин (диаметром 100 мм, толщина 0,525 мм) 50 Нм толстым слоем диоксида кре?...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

Литография Bephore — это надёжный и универсальный метод для узорной иммобилизации ДНК или РНК. Тем не менее процедура включает несколько этапов, которые - если изменено - может быть источником для отказа или снижению производительности системы.
Решающим шагом в изготовлени?...

Ячейки свободной экспрессии генов, которые реакции представляют большой интерес для различных применений в синтетической биологии, биохимии и биотехнологии. Ячейки свободный экспрессию белков сыграл для подготовки образцов чистого белка, которые были основой для многочисленных исследований в структурной биологии. Например клетки бесплатные системы успешно использовались для выражения протеина комплексы1 или мембранные белки2, которые трудны для того производить с помощью выражения на основе ячеек. В частности клетки бесплатно экспрессии генов, реакции также использовались для уточнения структуры генетического кода, начиная с новаторским эксперименты Ниренберг и Matthaei в 1961 году3.
Недавно наблюдается возрождение интереса к свободной ячейки методы в области биотехнологии и синтетической биологии4,5,6. Ячейки свободной системы могут быть дополнены-биологических соединений, и компоненты различных биологического происхождения могут быть объединены более легко7. Несмотря на то, что клетки свободной системы имеют явный недостаток, что они не «расти и делиться», это мыслимо подготовить открытых свободных клеток биореакторах с основные метаболические функции и пусть синтезировать метаболитов при наличии простой углерода и энергии 8входов. В рамках новой области синтетической биологии клетки-систем обещают быть более предсказуемым» шасси» для осуществления синтетических биологических функций.
В настоящее время свободных клеток ген выражение реакции осуществляется либо с помощью клеток экстрактов (из различных источников, таких как бактерии, дрожжи, насекомых), или транскрипция/перевод систем, которые были оптимизированы для различных приложений (например, прокариот против эукариотической экспрессии генов, производство мембранных белков и т.д.). Популярный протокол для подготовки бактериальной клетке экстракт (обычно называют TXTL) был недавно представленной V. Noireaux и coworkers9. Биофизические свойства были тщательно характеризуется10, и TXTL система уже успешно используется для выполнения ряда сложных биохимических задач: например, Ассамблея функциональных бактериофагов через клетки бесплатно выражение генома Фаговые11, синтеза бактериального белка нитей12или осуществление свободных клеток гена цепей13,14.
Другой системы популярны в свободной ячейке синтетической биологии является чистая система, которая воссоздается из очищенных компонентов,1516. По сравнению с TXTL системы, он не содержит nucleases или механизм деградации белков. При деградации линейной ДНК молекулы РНК и белки меньше вопроса в чистой системе, распад пути действительно важны для реализации динамических функций. Для того, чтобы уменьшить влияние деградации при exonuclease линейной гена шаблонов в системе TXTL (через RecBCD), белок GamS конце защита должна быть добавлена. TXTL и чистая система коммерчески доступны.
Тема тесно связана с проблем биологии клетки Бесплатные Изучение эффекта дробления на биохимических реакций и далее создание искусственных клеток подобных структур или protocells17,18,19 ,20. Исследования на искусственные клетки обычно включает инкапсуляцию биохимические реакции системы внутри везикулярного отсеков, сделанные из фосфолипидов или других amphiphiles. Хотя такие системы помогают исследовать фундаментальные аспекты дробления, или возникновение клеточности и самовоспроизводящаяся структур, они сталкиваются типичные проблемы замкнутых систем: в отсутствие функционирующего метаболизма и соответствующие мембранных транспортных механизмов, трудно держать разобщенным реакции для длительных периодов времени - молекулы топлива используются и накопления отходов.
Интересной альтернативой раздробленности внутри таких отделений, подражая клеток является пространственной организации генетического материала, офсетным способами. Иммобилизация «генов на чипе» был впервые предложен бар-Зив группы в институте Вейцмана более десяти лет назад21. Среди основных вопросов, которые должны быть решены были неспецифической адсорбционной ДНК и потенциальных денатурация белков на поверхности чипа. Бар-Зив et al. разработали выделенный фотолитографии сопротивляться, называют «Маргаритка», который состоит из реактивной терминала силана для иммобилизации противостоять молекул на поверхности кремния диоксид, длинные полиэтиленгликоля (PEG) разделителя, который заверил биосовместимость и photocleavable headgroup, который был преобразован в реактивной Амин после облучения с ультрафиолетового (УФ) света. Было показано, что Дейзи может использоваться для иммобилизации молекул ДНК гена Длина (с длиной несколько Кило-пар оснований (kbp)) на поверхности чипа. С точки зрения физики полимеров полимерные щетки, привитые на твердом субстрате представлены системы. Из-за характера полиэлектролит ДНК конформация этих кистей сильно зависит от осмотического и другие Ион специфические эффекты22,23.
Самое главное было показано, что субстрат прикол генов по-прежнему функционирует и могут быть расшифрованы и переведен на РНК и белка. Джин кисти доступны для РНК полимеразы решение24, и комплекс макромолекулярных смесь транскрипция/перевод не денатурировано на поверхности. Одним из преимуществ иммобилизации генетических компонентов на подложке является, что они могут эксплуатироваться в открытой microfluidic реакторная система, которая постоянно поставляется с небольшой прекурсоров молекулы и от которых отходы могут быть удалены25 , 26.
Мы недавно разработали вариант этот метод называется Bephore (для биосовместимых электронно лучевые и фоторезиста)27, которое было основано исключительно на коммерчески доступных компонентов и использовать специфичные для последовательности ДНК пряди вторжения реакции для Реализация простой в реализации многоступенчатое литографии процедуры для создания на основе чипа искусственные клетки. Схематический обзор процедуры показан на рисунке 1. Он основан на молекулы ДНК шпильки, содержащие photocleavable группу, которые иммобилизованных на слое биосовместимых КОЛЫШЕК. Photocleavage шпилька предоставляет последовательность одноцепочечной зацепки, через который ДНК молекул интерес (содержащие последовательности «вытеснения» DIS) может быть прилагаемый через зацепки опосредованной стренги вторжения.
В то время как Bephore является потенциально проще реализовать, Дейзи позволяет реализации очень густой и чистой «ген кисти», которые имеет преимущества в некоторых приложениях. В принципе однако, Дейзи и Bephore литография может легко сочетаться. Связанной с литографией метод использования которых перемещение нити ДНК для структурирования ДНК щетки на золото был ранее разработан Хуан et al., но не был использован в контексте свободных клеток ген выражение28,29.
В следующий протокол мы предоставляем подробное описание производства ДНК щетки для экспрессии генов клеток бесплатно, с помощью метода Bephore. Мы описываем, как ген фишки изготовлены и демонстрируют использование многоступенчатой фото литография пространственно структурированных иммобилизации генов на чипе. Мы также обсуждаем изготовление реакции камер и применение микрофлюидика для проведения реакций выражение гена на чипе.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

Обездвиживание генов на lithographically структурированных поверхностей позволяет исследование разобщенным ген выражение процессов в системе открытого microfluidic биореактора. В отличие от других подходов к искусственным сотовых систем такая установка позволяет для бесперебойного снабжения с ген выражение реагентов и одновременного слива отходов. Это облегчает осуществление процессов выражение гена свободных клеток более продолжительных периодов времени, что имеет важное значение для реализации систем регулирования обратной связи динамического гена. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изготовления генетических биочипов, с использованием simple-to-use литографические техники на основе ДНК пряди перемещения реакций, который использует исключительно коммерчески доступных компонентов. Мы также предоставляем протокол по вопросам интеграции разобщенным генов с полиэфиром (PDMS)-на основе microfluidic системы. Кроме того мы показываем, что система совместима с микроскопии флуоресцирования (TIRF) полного внутреннего отражения, который может быть использован для прямого наблюдения молекулярных взаимодействий между ДНК и молекул, содержащихся в наборе выражений.

Двухступенчатый литография: Рисунок 5 показывает результат двухэтапный литографический процесс на слайде стекла с перекрывающимися моделей дневно обозначенные DIS пряди.
Выражение флуоресцентный белок от гена кисти: <s...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Мы опишем простой литографических процедуры для иммобилизации молекул ДНК гена длина на поверхности, которая может использоваться для выполнения экспериментов выражение гена свободных клеток на биочипов.

Функциональные поверхности иммобилизация генов с использованием многоэтапных Strand перемещения литография

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Биочипы ДНК являются привлекательной исследовательской платформой для самостоятельной ресинтететики биологии, первоначально разработанной группой BASF, которая позволяет ею ею его рода in vitro в течение длительных периодов времени. С помощью этого протокола мы надеемся сделать эту технологию доступной для более широкого круга исследователей. Наш метод, который называют литографией bephore, представляет собой стратегию иммобилизации ДНК на основе реакции смещения нити ДНК.Сила этого метода заключается в его многоступенчатых литографических возможностях, его простой воспроизводимости и коммерческой доступности всех компонентов. Как и другие решения биочипа, bephore можно сочетать с различными технологиями. Например, функциональные генные щетки могут быть собраны в микро-отсеках для экспрессии белка.Для начала приготовьте смесь RCA, смешивая пять частей воды с одной частью 30%аммиачного раствора в стеклянном стакане. Нагрейте смесь до 70 градусов по Цельсию на горячей тарелке, помешивая. Как только он достигнет 70 градусов по Цельсию, добавить одну часть 30%перекиси водорода.Затем поместите кремниевую пластину диаметром 100 миллиметров в раствор, чтобы удалить из него органический материал и частицы. Через 30 минут вынюхайте субстрат, тщательно промойте его водой из бутылки для мытья и высушите азотной пушкой. Немедленно приступайте к PEGylation субстрата.Для достижения этой цели сначала разбавьте биотин-PEG-silane в сухом толуоле до 5 миллиграммов на миллилитр и вихрем раствор, пока он хорошо перемешан. С субстратом помещается в стеклянную чашку Петри, медленно пипетка раствор на субстрат, охватывающих всю поверхность, но избежать позволяя раствору течь через край. Как только поверхность будет покрыта, закройте чашку Петри, а затем добавьте дополнительную крышку.Через 30 минут снимите крышку и добавьте в чашку Петри около 40 миллилитров изопропилового спирта. Затем вынюхайте субстрат, тщательно промойте его изопропиловым спиртом и высушите азотным пистолетом. Когда высохнет, хранить субстрат в темноте, пока это не нужно.Подготовьте субстрат с помощью стеклянного резака или скальпеля, чтобы сформировать один сантиметр на один сантиметр штук. Затем добавьте простую отметку выравнивания, сделав короткую царапину от центра к краю субстрата. Удар любых мелких частиц от чипа с помощью азотной пушки.Затем смешайте две капли двухкомпонентного силиконового клея и нанесите клей на поверхность чипа, оставив область вокруг кончика царапины пустой. Там клей обеспечивает гидрофобный барьер, сохраняя на чипе акальные растворы. Это облегчает последующие шаги мытья, и уменьшает количество ДНК, необходимое для инкубации.В более позднем шаге, клей может быть легко очищен. На следующих этапах фотосемаемая ДНК обрабатывается только в условиях желтого света. Обложка чип около 10 микролитров смеси bephore при комнатной температуре, и поместите чип в коробку частично заполнены водой, чтобы уменьшить испарение.После одного часа, мыть чип несколько раз с PBS, чтобы удалить любые неограниченные смеси bephore. Затем добавьте к чипу 10 микролитров пассивации. Через два часа, мыть чип несколько раз с PBS, чтобы удалить неограниченные пассивации агентов.Вырежьте печатную фотомысяк до нужного размера, чтобы соответствовать подходящей маске. Вставьте его в положение остановки поля и используйте знаки выравнивания для выравнивания маски в держателе. С помощью субстрата, размещенного на стадии микроскопии, вставьте красный фильтр в траекторию освещения и сосредоточьтесь на поверхности субстрата.Затем перейдите в область субстрата, который будет выставлен. Затем вставьте держатель маски, заблокив подсветку и перевести на УФ-фильтр. При низкой интенсивности света откройте затвор и используйте камеру, чтобы быстро сфокусировать маску на субстрате.Теперь, когда субстрат выровнен и маска в фокусе, блокируйте световой путь к камере и осветите субстрат с высокой интенсивностью света в течение желаемого времени экспозиции. После экспозиции удалите образец из микроскопа и аккуратно удалите как можно больше буфера из субстрата, не сушив его. Затем добавьте от 10 до 20 микролитров ДНК с последовательностью для крепления к поверхности.Поместите субстрат во влажную коробку, чтобы он не высыхал, и инкубировать ДНК на субстрате в течение двух часов при комнатной температуре. Для того, чтобы наблюдать разобщенные экспрессии генов на перевернутый микроскоп, сначала отдельно подготовить две части образца держателя. Начните с склеивания чипа bephore с обездвиженной генной щеткой на держатель чипа, используя двустороннюю клейую ленту.Затем добавьте вакуумную смазку вокруг центрального отверстия нижней части держателя и вставьте держатель чипа. Теперь соберите верхнюю часть держателя. Вырезать тонкий чип PDMS с отсеками как можно меньше, оставляя канал открытым для одной стороны, чтобы позже обеспечить обмен отходами и молекулами-предшественниками путем диффузии Далее, плазма-лечить стеклянную крышку скольжения в задней стороне чипа PDMS с кислородной плазмой.Сразу после обработки поместите чип PDMS в центр стеклянной горки, а отсеки будут направлены вверх. Затем выпекать стекло с PDMS в течение одного часа при температуре 70 градусов по Цельсию. Незадолго до сборки всего держателя образца плазма-обработать стеклянную горку с чипом PDMS, как и раньше.Затем добавьте немного вакуумной смазки вокруг большого отверстия верхнего держателя и поместите стеклянную горку с PDMS на нее. Аккуратно нажмите стекло на смазку. Аккуратно снимите буфер с чипа и вымойте его один раз с помощью 10 микролитров системы саморазмещения.Затем добавьте на чип 60 микролитров системы саморазмыщения и удалите двухкомпонентный силиконовый клей с краев. Теперь добавьте 20 микролитров системы выражения на PDMS. После размещения капли на PDMS, быстро проверить в стереоскопический микроскоп, что отсеки хорошо мокрые и без пузырьков воздуха.Если есть пузырьки воздуха, попробуйте смыть их. Чтобы собрать две части держателя, а также выровнять камеры и кисти ДНК, работа под стереоскопическим микроскопом. Обездвижить нижний держатель с рукояткой захвата, так что два винта и wingnuts будет легко доступны обеими руками.Вставьте верхний держатель в нижний держатель и опустите его до тех пор, пока капли системы выражения без клеток не сливаются. Затем проверьте, чтобы убедиться, что отсеки и знак выравнивания находятся в аналогичной области в плоскости XY. Снизу, винт вверх wingnuts, пока они не коснутся нижней стороне держателя.При выравнивания отсеков и чипа в плоскости XY, аккуратно затяните wingnuts. Этот шаг требует некоторого опыта и зависит от конструкции держателя образца. PDMS следует нажимать на чип только с мягкой силой.Затем распылите губку в анти-испарение корпуса с водой, и вставьте держатель в коробку. Затем заполните пятими миллилитровый шприц двухкомпонентным силиконовым клеем и используйте его для уплотнения коробки. Наконец, перенесите коробку в контролируемый температурой микроскоп, и изображение кисти ДНК и реакции с помощью микроскопии флуоресценции.Двухступный литографический процесс, выполненный здесь на стеклянном слайде bephore, дает перекрывающиеся узоры флуоресцентно помеченных нитей ДНК. В этой демонстрации экспрессии генов на чипе, ДНК обездвижена в камере слева. При воздействии экспрессии смесь, желтый флуоресцентный белок YPet синтезируется из обездвиженой ДНК.Для оценки активности системы экспрессии генов после отбеливания наблюдается восстановление флуоресценции. В два часа интенсивность флуоресценции быстро восстановилась. Однако, после четырех и шести часов, он не восстановился, что указывает на то, что без свежего питания экспрессии смеси, реакция прекратилась около часа четыре.Хотя экспрессия генов ограничена в закрытой системе, она может поддерживаться в течение более длительных периодов времени, поставляя отсекам экспрессии дополнительные молекулы-прекурсоры с помощью микрофлюитики. Метод bephore использован для того чтобы обездвижить олигонуклеотиды или дна длины гена, которые можно придать для того чтобы построить системы взаимодействующих кистей дна для выражения re-гена. Техника может также использоваться для других применений в биофизике, таких как исследования флуоресценции одной молекулы.После просмотра этого видео, вы должны быть в состоянии изготовить биочипы bephore из пластин или стеклянных слайдов, и интегрировать их в свои исследовательские проекты.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Плазменные литографии поверхности паттернов для создания сотовых сетей

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Капиллярная сила Литография для сердечной тканевой инженерии

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Генерация неприсоединения функциональной ткани миокарда Через микроконтактной печати

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Роботизированная система Зеркало терапии для восстановления функций Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Разработка электрохимических ДНК биосенсора для обнаружения пищевых патогенов

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Сосредоточенная литография Ионного Луча для наноархитектур etch в микроэлектроды

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

Церебральный поток крови на основе отдыха государства функциональная связь человеческого мозга с помощью оптической диффузной корреляции спектроскопии

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Поколение и количественная характеристика функциональных и поляризованных желчных эпителиальных кист

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Биомиметическая репликация микроструктуры поверхности корня с использованием изменения мягкой литографии

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Поколение динамических экологических условий с использованием микрофлюидного устройства с высокой пропускной способностью

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...