Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Agradecemos el apoyo financiero para este proyecto por la Volkswagen Stiftung (grant no. 89 883) y el Consejo Europeo de investigación (beca Convenio Nº 694410 - AEDNA). M.S.-S. agradece apoyo por el DFG a través de GRK 2062.

Nota: Un calendario para las medidas en las diferentes secciones se da en la información complementaria (sección 1).
1. fabricación de microchips
Nota: como substratos obleas de silicio de uso (100 mm de diámetro, 0,525 mm de espesor) con una capa gruesa de 50 nm de dióxido de silicio o vidrio portaobjetos (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 mm x 50 mm, no. 4). Dependiendo de la aplicación, otros tamaños y espesores pueden ser más convenientes.
<ol><li>Limpieza de...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

Bephore litografía es una técnica robusta y versátil para el modelado inmovilización de ADN o ARN. Sin embargo, el procedimiento incluye varios pasos, que - si - pueden ser una fuente de fracaso o menor rendimiento del sistema.
Un paso crucial en la fabricación de chips de Bephore es la pegilación del sustrato, que proporciona la biocompatibilidad de la superficie. Aquí, el paso de limpieza con un procedimiento RCA es importante, ya que también activa la superficie para la silanizació...

Libre expresión génica, las reacciones son de gran interés para diversas aplicaciones en Bioquímica, biotecnología y biología sintética. Libre expresión de las proteínas fue instrumental para la preparación de las muestras de proteína pura, que fueron la base para numerosos estudios de biología estructural. Por ejemplo, sistemas libres de células fueron utilizados con éxito para la expresión de la proteína complejos1 o membrana proteínas2, que son difíciles de producir con la expresión de la célula. En particular, libre expresión génica reacciones también fueron utilizadas para dilucidar la estructura del código genético, a partir de los experimentos innovadores de Nirenberg y Matthaei en 19613.
Recientemente, ha habido un renovado interés en métodos sin células en biotecnología y biología sintética4,5,6. Sistemas libres de células pueden ser aumentados con compuestos no-biológica, y componentes de origen biológico distinto pueden combinarse más fácilmente7. A pesar de sistemas libres de células tienen la desventaja evidente que no es "crecer y dividir", es concebible para preparar Biorreactores abiertos libres de células con funciones metabólicas básicas y que sintetizan metabolitos cuando provisto de energía y carbono simple entradas8. Dentro del campo emergente de la biología sintética, sistemas libres de células prometen ser un "chasis" más predecible para la ejecución de funciones biológicas sintético.
Actualmente, las reacciones de expresión de genes sin células se llevan a cabo usando los extractos de célula (de diferentes fuentes tales como bacterias, levaduras, insectos), o sistemas de transcripción y traducción que fueron optimizados para diferentes aplicaciones (por ejemplo, procariotas vs. eucariotas la expresión génica, la producción de proteínas de membrana, etc.). Un popular protocolo para la preparación del extracto de la célula bacteriana (comúnmente llamados TXTL) fue proporcionado recientemente por V. Noireaux y compañeros de trabajo9. Sus propiedades biofísicas han sido completamente caracterizados10, y el sistema TXTL ha sido ya utilizado con éxito para llevar a cabo una serie de tareas bioquímicas complejas: por ejemplo, la Asamblea de bacteriófagos funcional a través de expresión sin células el genoma phage del11, la síntesis de proteína bacteriana filamentos12o la aplicación del gen sin células circuitos13,14.
Otro sistema popular en biología sintética libre de células es el sistema puro, que se reconstituye a partir de componentes purificados15,16. En comparación con el sistema TXTL, no contiene las nucleasas o maquinaria de degradación de proteínas. Mientras que la degradación de ADN lineal, las moléculas de ARN o proteínas es tan importante en el sistema puro, vías de decaimiento son realmente importantes para la implementación de funciones dinámicas. Para reducir el efecto de la degradación de la exonucleasa de plantillas gene lineal en el sistema TXTL (a través de RecBCD), la proteína extremo-protección de GamS debe agregar. El sistema puro y el TXTL están disponibles en el mercado.
Un tema estrechamente relacionado con preocupaciones de la biología celular gratis el estudio del efecto de la compartimentalización en reacciones bioquímicas y aún más la creación de estructuras de la célula artificiales o protocélulas17,18,19 ,20. Investigación sobre las células artificiales típicamente implica el encapsulamiento de un sistema de reacción bioquímica dentro de compartimientos vesiculares de fosfolípidos u otros Anfífilos. Mientras que estos sistemas ayudan a explorar aspectos fundamentales de la compartimentalización, o la aparición de la celularidad y estructuras auto-replicantes, afrontan los problemas típicos de los sistemas cerrados: en ausencia de un metabolismo funcional y apropiado mecanismos de transporte de membrana, es muy difícil mantener reacciones compartimentadas para largos períodos de tiempo - las moléculas del combustible se utilizan para arriba y se acumulan productos de desecho.
Una alternativa interesante a la compartimentación interior de dichos compartimientos imitan a las células es la organización espacial del material genético mediante métodos photolithographic. Inmovilización de "genes en un chip" fue promovido por el grupo Bar-Ziv en el Instituto Weizmann hace más de diez años21. Entre las principales cuestiones que tenían que resolver eran la adsorción inespecífica del ADN y la posible desnaturalización de proteínas en la superficie del chip. Bar-Ziv et al desarrolló una resistencia Fotolitografía dedicado llamado "Daisy", que se compone de un silano reactivo terminal para la inmovilización de las moléculas de resistir en las superficies de dióxido de silicio, un espaciador largo polietileno glicol (PEG) que aseguró biocompatibilidad y una headgroup photocleavable, que fue convertida en una amina reactiva a la irradiación con luz ultravioleta (UV). Se ha demostrado que la Margarita puede utilizarse para inmovilizar moléculas de la DNA del gene-longitud (con longitudes de varios kilo-pares de bases (kbp)) sobre una superficie de viruta. De un polímero física punto de vista, los sistemas representan cepillos de polímero injertados sobre un sustrato sólido. Debido a la naturaleza de polielectrolito de ADN, la conformación de estos cepillos es afectada fuertemente por efectos de iones específicos osmótico y otros22,23.
Lo más importante, se ha demostrado que genes inmovilizada de sustrato son aún funcionales y pueden ser transcrito y traducido en ARN y proteínas. Cepillos de gene son accesibles para ARN Polimerasas de solución24, y la mezcla macromolecular complejo de la transcripción y traducción no es desnaturalizada en la superficie. Una de las ventajas de la inmovilización de componentes genéticos en un sustrato es que pueden funcionar en un sistema de reactor abierto microfluídico que continuamente se suministra con moléculas pequeñas precursor y de la cuales productos de desecho puede ser eliminado25 , 26.
Recientemente hemos desarrollado una variante de este método llamado Bephore (para haz de electrones Biocompatible y fotoresistencia)27, que se basó exclusivamente en los componentes comercialmente disponibles y utilizados secuencia específica DNA filamento invasión las reacciones para la realización de un procedimiento de litografía varios pasos simples de implementar para la creación de células artificiales basadas en el chip. Un Resumen esquemático del procedimiento se muestra en la figura 1. Se basa en horquilla las moléculas de ADN que contiene un grupo photocleavable, que están inmovilizadas en una capa biocompatible de PEG. Fotorrotura de la horquilla expone una secuencia de cadena simple punto de apoyo, a través de que DNA moléculas de interés (que contiene la secuencia DIS "desplazar") pueden ser conectado vía invasión de filamento mediada por punto de apoyo.
Mientras que Bephore es potencialmente más fácil de implementar, Daisy permite la realización de muy denso y limpio "cepillos de gen", que tiene ventajas en ciertas aplicaciones. En principio, sin embargo, litografía Daisy y Bephore podría ser fácilmente combinada. Un método de litografía relacionada utilizando desplazamiento de hebra de ADN para estructurar ADN cepillos en oro fue previamente desarrollado por Huang et al., pero no fue utilizado en el contexto del gen libre expresión28,29.
En el siguiente protocolo brindamos que una descripción detallada de la producción de ADN cepillos para la expresión del gen libre utilizando el método de Bephore. Describimos cómo el gene se fabrican y demostrar el uso de multi-step foto-litografía para la inmovilización espacialmente estructurado de genes en un chip. También discutimos la fabricación de cámaras de reacción y la aplicación de la microfluídica para la realización de reacciones de expresión del gen de la en-viruta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

Inmovilización de genes en superficies litográfico estructurados permite el estudio del gen compartimentado procesos de expresión en un sistema de biorreactor de microfluidos abierto. En contraste con otros enfoques hacia sistemas celulares artificiales, tal configuración permite un suministro continuo con gene expresión reactivos y drenaje simultáneo de productos de desecho. Esto facilita la implementación de procesos de expresión génica sin células durante largos períodos de tiempo, lo cual es importante para la realización de sistemas de retroalimentación reguladora de genes dinámico. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la fabricación de biochips genéticos utilizando una técnica litográfica de simple-to-use basada en reacciones de desplazamiento de hebra de ADN, que utiliza exclusivamente los componentes comercialmente disponibles. También proporcionamos un protocolo sobre la integración de genes compartimentadas con un polidimetilsiloxano (PDMS)-sistema de microfluidos. Por otra parte, nos muestran que el sistema es compatible con microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, que puede ser utilizado para la observación directa de las interacciones moleculares entre el ADN y las moléculas contenidas en la mezcla de la expresión.

Litografía de dos etapas: la figura 5 muestra el resultado de un proceso de dos pasos litográficos en un portaobjetos de vidrio con la superposición de patrones de fluorescencia etiquetada DIS hilos.
Expresión de una proteína fluorescente de un cepillo de gene: figura 6 demuestra la expresión de la proteína fluorescente YPet de DNA inmovilizado. En varios puntos ...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Se describe un sencillo procedimiento litográfico para la inmovilización de las moléculas de ADN del gen-longitud sobre una superficie, que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de expresión génica sin células en biochips.

Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Los biochips de ADN son una atractiva plataforma de investigación para la biología autointético, desarrollada originalmente por el grupo BASF, que permite el funcionamiento de circuitos genéticos in vitro durante largos períodos de tiempo. Con este protocolo, esperamos poner esta tecnología a disposición de una gama más amplia de investigadores. Nuestro método, llamado litografía de bephore, representa una estrategia para la inmovilización del ADN basada en la reacción de desplazamiento de la cadena de ADN.La fuerza de esta técnica reside en sus capacidades litográficas de varios pasos, su simple reproducibilidad y la disponibilidad comercial de todos los componentes. Al igual que otras soluciones de biochip, el before se puede combinar con diferentes tecnologías. Por ejemplo, los cepillos genéticos funcionales se pueden ensamblar dentro de microcompartidores para la expresión de proteínas.Para empezar, prepare una mezcla de RCA mezclando cinco partes de agua con una parte de una solución de 30% de amoníaco en un vaso de precipitados de vidrio. Calienta la mezcla a 70 grados Celsius en un plato caliente mientras remueves. Una vez que alcance los 70 grados centígrados, agregue una parte 30%peróxido de hidrógeno.A continuación, coloque una oblea de silicio de 100 milímetros de diámetro en la solución, para eliminar el material orgánico y las partículas de ella. Después de 30 minutos, saque el sustrato, enjuáguelo bien con agua de una botella de lavado y séquelo con una pistola de nitrógeno. Proceder inmediatamente con la PEGylation del sustrato.Para lograr esto, primero diluir la biotina-PEG-Silane en tolueno seco a 5 miligramos por mililitro, y vórtice la solución hasta que esté bien mezclada. Con el sustrato colocado en un plato Petri de vidrio, pipetee lentamente la solución sobre el sustrato, cubriendo toda la superficie, pero evite permitir que la solución fluya sobre el borde. Una vez cubierta la superficie, cierre el plato Petri y, a continuación, agregue una cubierta adicional.Después de 30 minutos, retire la cubierta y agregue aproximadamente 40 mililitros de alcohol isopropílico al plato de Petri. Luego saque el sustrato, enjuáguelo de nuevo a fondo con alcohol isopropílico y séquelo con una pistola de nitrógeno. Cuando esté seco, guarde el sustrato en la oscuridad hasta que sea necesario.Preparar un sustrato utilizando un cortador de vidrio o un bisturí para formar trozos de un centímetro por un centímetro. A continuación, agregue una marca de alineación simple haciendo un rasguño corto desde el centro hacia un borde del sustrato. Sopla cualquier partícula pequeña del chip usando una pistola de nitrógeno.A continuación, mezcle dos gotas de un pegamento de silicona de dos componentes y aplique el pegamento a la superficie del chip, dejando el área alrededor de la punta del rasguño en blanco. Allí el pegamento proporciona una barrera hidrófoba, manteniendo soluciones acuosas en el chip. Esto facilita los pasos de lavado posteriores, y reduce la cantidad de ADN necesario para las incubaciones.En un paso posterior, el pegamento se puede pelar fácilmente. En los siguientes pasos, el ADN fotocleaveable se maneja solo en un entorno de luz amarilla. Cubra el chip con unos 10 microlitros de una mezcla de bephore a temperatura ambiente, y coloque el chip en una caja parcialmente llena de agua para reducir la evaporación.Después de una hora, lave el chip varias veces con PBS para eliminar cualquier mezcla de beforo sin ataduras. A continuación, agregue 10 microlitros de la mezcla de pasivación al chip. Después de dos horas, lave el chip varias veces con PBS para eliminar los agentes de pasivación no enlazados.Corte una máscara de foto impresa al tamaño adecuado para que se ajuste a un soporte de máscara adecuado. Insértelo en la posición del tope de campo y utilice las marcas de alineación para alinear la máscara en el soporte. Con el sustrato colocado en la etapa de microscopía, inserte un filtro rojo en la trayectoria de iluminación y concéntrese en la superficie del sustrato.A continuación, navegue a la región del sustrato que se expondrá. A continuación, inserte el soporte de la máscara, bloquee la iluminación y cambie al filtro UV. A una intensidad de luz baja, abra el obturador y utilice la cámara para enfocar rápidamente la máscara en el sustrato.Con el sustrato ahora alineado y la máscara enfocada, bloquee el camino de luz a la cámara e ilumine el sustrato a una alta intensidad de luz para el tiempo de exposición deseado. Después de la exposición, retire la muestra del microscopio y retire cuidadosamente el mayor tampón posible del sustrato sin secarla. A continuación, agregue de 10 a 20 microlitros de ADN con la secuencia para la fijación a la superficie.Coloque el sustrato en una caja húmeda para evitar que se seque e incubar el ADN en el sustrato durante dos horas a temperatura ambiente. Para observar la expresión génica compartimentada en un microscopio invertido, primero prepare por separado las dos partes del soporte de la muestra. Comience pegando un chip de bephore con un cepillo genético inmovilizado en el soporte de la viruta, utilizando cinta adhesiva de doble cara.A continuación, agregue un poco de grasa al vacío alrededor del orificio central de la parte inferior del soporte e inserte el soporte de viruta. Ahora ensamble la parte superior del soporte. Cortar un chip PDMS delgado con compartimentos lo más pequeños posible, dejando un canal abierto a un lado para luego permitir el intercambio de residuos y moléculas precursoras por difusión Después, tratar el plasma-tratar un resbalón de cubierta de vidrio en la parte posterior del chip PDMS con plasma de oxígeno.Inmediatamente después del tratamiento, coloque el chip PDMS en el centro del portaobjetos de vidrio, con los compartimentos apuntando hacia arriba. Luego, hornee el vaso con el PDMS durante una hora a 70 grados Centígrados. Poco antes de montar todo el portavelas, trate por plasma el portaobjetos de vidrio con el chip PDMS como antes.A continuación, agregue un poco de grasa al vacío alrededor del orificio grande del soporte superior y coloque la diapositiva de vidrio con el PDMS en él. Presione suavemente el vaso sobre la grasa. Retire cuidadosamente el tampón del chip y lávelo una vez con 10 microlitros del sistema de autoexpresión.A continuación, agregue 60 microlitros de sistema de autoexpresión en el chip y retire el pegamento de silicona de dos componentes de los bordes. Ahora, agregue 20 microlitros del sistema de expresión al PDMS. Después de colocar la gota en el PDMS, compruebe rápidamente en el microscopio estereoscópico que los compartimentos están bien mojados y sin burbujas de aire.Si hay burbujas de aire, trate de lavarlas. Para ensamblar las dos piezas del soporte, y para alinear cámaras y cepillos de ADN, trabajar bajo un microscopio estereoscópico. Inmovilice el soporte inferior con un brazo de sujeción para que los dos tornillos y las alas sean fácilmente accesibles con ambas manos.Inserte el soporte superior en el soporte inferior y tírelo hasta que las gotas del sistema de expresión sin celda se fusionen. A continuación, compruebe que los compartimentos y la marca de alineación se encuentran en una región similar en el plano XY. Desde abajo, arruine las tuercas de ala hasta que toquen el lado inferior del soporte.Mientras alinea los compartimentos y el chip en el plano XY, apriete suavemente las tuercas de ala. Este paso requiere cierta experiencia y depende de la construcción del portacuchillas. El PDMS debe ser presionado sobre el chip sólo con una fuerza suave.A continuación, rocíe una esponja en el recinto antievaporción con agua e inserte el soporte en la caja. A continuación, llene una jeringa de cinco mililitros con pegamento de silicona de dos componentes y úselo para sellar la caja. Por último, transfiera la caja a un microscopio con temperatura controlada e imagine el cepillo de ADN y la reacción mediante microscopía de fluorescencia.Un proceso litográfico de dos pasos, realizado aquí en un portaobjetos de vidrio bephore, produce patrones superpuestos de hebras de ADN con etiqueta fluorescente. En esta demostración de expresión génica en chip, el ADN se inmoviliza en la cámara de la izquierda. Cuando se expone a la mezcla de expresión, la proteína fluorescente amarilla YPet se sintetiza a partir del ADN inmovilizado.Para evaluar la actividad del sistema de expresión génica, se observa la recuperación de la fluorescencia después de un paso de blanqueo. A las dos horas, la intensidad de la fluorescencia se recuperó rápidamente. Sin embargo, después de cuatro y seis horas, no se recuperó, lo que indica que sin un nuevo suministro de la mezcla de expresión, la reacción terminó alrededor de la cuarta hora.Aunque la expresión génica es limitada en un sistema cerrado, puede mantenerse durante períodos de tiempo más largos suministrando a los compartimentos de expresión moléculas precursoras adicionales a través de micro-fluidos. El método bephore se utiliza para inmovilizar oligonucleótidos o ADN de longitud genética, que se puede aplicar para construir sistemas de cepillos de ADN que interactúan para la expresión auto-gengénica. La técnica también se puede utilizar para otras aplicaciones en la biofísica, como estudios de fluorescencia de molécula única.Después de ver este video, usted debe ser capaz de fabricar biochips bephore a partir de obleas o diapositivas de vidrio, e integrarlos en sus proyectos de investigación.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Investigación

Bioingeniería

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Sistema de terapia robótica Espejo para la recuperación funcional de armas hemipléjica

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Litografía de haz de iones enfocado a etch nano-arquitecturas en microelectrodos

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

Conectividad funcional del cerebro humano basada en el flujo sanguíneo cerebral mediante espectroscopia óptica de correlación difusa

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Generación y caracterización cuantitativa de quistes epiteliales biliares funcionales y polarizados

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Replicación biomimética de la microestructura de superficie raíz mediante alteración de la litografía blanda

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...