Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt ekonomiskt stöd för detta projekt av den Volkswagen Stiftung (grant nr 89 883) och European Research Council (grant avtal nr 694410 - AEDNA). M.S.-S. erkänner stöd av DFGEN genom GRK 2062.

Obs: En tidsplan för stegen i de olika avsnitten ges kompletterande uppgifter (avsnitt 1) i.
1. chip Fabrication
Obs: som substrat, användning kiselskivor (diameter 100 mm, tjocklek 0,525 mm) med en 50 nm tjocka lager av kiseldioxid eller objektglas (24 mm x 24 mm, nr 1,5; 22 mm x 50 mm, nr 4). Beroende på applikation, kan andra storlekar och tjocklekar vara mer lämplig.
<ol><li>Rengöring av substrat via en RCA-rengör förfarande (vatten, ammoniak N...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

Bephore litografi är en robust och mångsidig teknik för mönstrade immobilisering av DNA eller RNA. Men förfarandet omfattar flera steg, som - om ändrat - kan vara en källa för misslyckande eller minskat systemets prestanda.
Ett avgörande steg i tillverkningen av Bephore marker är pegylering av substratet, vilket ger biokompatibiliteten av ytan. Här är steget rengöring med en RCA-förfarandet viktigt, eftersom det aktiverar också ytan för den efterföljande silanisering. Under de...

Cell-gratis genuttryck reaktioner är av stort intresse för olika applikationer i biokemi, bioteknik och syntetisk biologi. Cellfria uttrycket av proteiner var avgörande för beredning av rent protein prover, som låg till grund för ett flertal studier inom strukturbiologi. Exempelvis användes cellfria system framgångsrikt för uttrycket av protein komplex1 eller membranet proteiner2, som är svåra att producera med hjälp av cell-baserade uttryck. Noterbart cellfria genuttryck reaktioner användes också till att klarlägga den genetiska koden, börjar med den banbrytande experimenten av Nirenberg och Matthaei i 19613struktur.
Nyligen har det varit ett förnyat intresse för cellfria metoder inom bioteknik och syntetisk biologi4,5,6. Cell-gratis system kan utökas med icke-biologiska föreningar och komponenter av olika biologiska ursprung kan kombineras till lättare7. Även om cellfria system har uppenbara nackdelen att de inte ”växa och dela upp”, är det tänkbart att förbereda öppen cellfria bioreaktorer med grundläggande metaboliska funktioner och låt dem syntetisera metaboliter när medföljer enkla kol och energi ingångar8. Framväxande inom syntetisk biologi lovar cell-fria system att vara en mer förutsägbar ”chassi” för genomförandet av syntetiska biologiska funktioner.
För närvarande cellfria gen uttryck reaktioner utförs antingen med cell extrakt (från olika källor såsom bakterier, jäst, insekter), eller transkription och översättning system som var optimerad för olika tillämpningar (t.ex. prokaryota och eukaryota genuttryck, produktion av membranproteiner, etc.). Ett populärt protokoll för beredning av bakteriell cell extrakt (även kallat TXTL) lämnades nyligen av V. Noireaux och medarbetare9. Dess biofysiska egenskaper har varit grundligt kännetecknas10, och det TXTL systemet har redan använts framgångsrikt att utföra en serie komplexa biokemiska aktiviteter: exempelvis montering av funktionella bakteriofager via cellfria uttryck för phage genomet11, syntesen av bakteriell protein filament12eller genomförandet av cellfria gen kretsar13,14.
Ett annat system populära i cellfria syntetisk biologi är det ren systemet, som bereds från renade komponenter15,16. Jämfört med det TXTL systemet, innehåller det inte nukleaser eller protein nedbrytning maskiner. Samtidigt som nedbrytningen av linjära DNA är RNA-molekyler eller proteiner mindre problem i ren systemet, decay vägar är faktiskt viktigt för genomförandet av dynamiska funktioner. För att minska effekten av exonuclease nedbrytning av linjära gen mallar i systemet TXTL (genom RecBCD), har slutet-skydda GamS proteinet till vara adderat. Både TXTL och ren systemet är kommersiellt tillgängliga.
Ett ämne besläktade nära cellfria biologi oro att studera effekten av uppdelning på biokemiska reaktioner och ytterligare skapandet av konstgjorda cell-liknande strukturer eller protocells17,18,19 ,20. Forskning på konstgjorda celler oftast inkapsling av en biokemisk reaktion system inuti vesikulär fack tillverkade av fosfolipider eller andra amphiphiles. Medan sådana system hjälper till att utforska grundläggande aspekter av uppdelning, eller uppkomsten av cellularitet och självreproducerande strukturer, de möter de typiska problemen av slutna system: i avsaknad av en fungerande ämnesomsättning och lämpliga membranet transportmekanismer, det är svårt att hålla konkurrensbetingat reaktioner kör för längre tid - bränsle molekyler används upp och slaggprodukter ansamlas.
Ett intressant alternativ till olika fack inuti sådan cell-härma fack är den rumsliga organisationen av genetiskt material med photolithographic metoder. Immobilisering av ”gener på ett chip” var pionjärer av gruppen Bar-Ziv vid Weizmann Institutet mer än tio år sedan21. Bland de större frågor som hade att lösa var ospecifika adsorption av DNA och de potentiella denaturering av proteinerna på chip ytan. Bar-Ziv et al. utvecklat en dedikerad photolithography motstå kallas ”Daisy”, som bestod av en reaktiv terminal silan för immobilisering av motstå molekylerna på kiseldioxid ytor, distanshylsa lång polyetylenglykol (PEG) som säker biokompatibilitet och en photocleavable headgroup, som omvandlades till en reaktiv Amin vid bestrålning med ultraviolett (UV) ljus. Det har visats att Daisy kan användas att immobilisera gen-längd DNA-molekyler (med längder av flera kilo-baspar (kbp)) på en chip yta. Från en polymer fysik synvinkel representerade systemen polymer borstar ympade på ett fast substrat. På grund av hur polyelectrolyte DNA påverkas konformation av dessa borstar starkt av osmotisk och andra ion-specifika effekter22,23.
Viktigast av allt, har det visat att substrat-orörlig gener är fortfarande fungerande och kan transkriberas och översatt till RNA och protein. Gen borstar är tillgängliga för RNA polymeraser från lösning24och komplexa makromolekylära blandningen av transkription/översättningen är inte denatureras vid ytan. En av fördelarna med immobilisering av genetiska komponenter på ett substrat är att de kan användas i ett system av öppna mikroflödessystem-reaktorn som tillhandahålls kontinuerligt med små föregångare molekyler och från vilka restprodukter kan vara borttagna25 , 26.
Vi har nyligen utvecklat en variant av denna metod som kallas Bephore (för biokompatibla elektron-beam och fotoresist)27, som grundades uteslutande på kommersiellt tillgängliga komponenter och utnyttjas sekvens-specifika DNA strand invasion reaktioner för förverkligandet av ett enkel att implementera utgångsämnet litografi förfarande för skapandet av chip-baserade konstgjorda celler. En schematisk översikt över förfarandet visas i figur 1. Den är baserad på DNA hårnål molekyler som innehåller en photocleavable grupp, som är orörlig på ett biokompatibelt PEG-lager. Photocleavage för hårnål exponerar ett enkelsträngat fotfäste sekvens, genom vilka DNA molekyler av intresse (som innehåller sekvensen ”tränger” DIS) kan vara anslutna via fotfäste-medierad strand invasion.
Medan Bephore är potentiellt enklare att genomföra, Daisy möjliggör förverkligandet av mycket tät och ren ”genen penslar”, som har fördelar i vissa applikationer. I princip, men kan Daisy och Bephore litografi enkelt kombineras. En relaterad litografi metod utnyttjar DNA strand deplacement för att strukturera DNA borstar på guld har tidigare utvecklats av Huang et al., men var inte utnyttjas i samband med cellfria gen uttryck28,29.
I följande protokoll ger vi en detaljerad beskrivning av produktionen av DNA borstar för cellfria genuttryck med metoden Bephore. Vi beskriver hur genen chips tillverkas och demonstrera användningen av flera steg foto-litografi för rumsligt strukturerad immobilisering av gener på ett chip. Vi diskuterar också tillverkning av reaktion chambers och tillämpningen av mikrofluidik för utförandet av på-chip gen uttryck reaktioner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

Immobilisering av gener på lithographically strukturerade ytor tillåter studier av konkurrensbetingat gen uttryck processer i ett öppet mikroflödessystem bioreaktor system. Till skillnad från andra metoder mot konstgjorda cellulära system tillåter sådan inställning för kontinuerlig med gen uttryck reagenser och samtidig dränering av avfallsprodukter. Detta underlättar genomförandet av cellfria gen uttryck processer över längre tidsperioder, vilket är viktigt för förverkligandet av dynamiska gen reglerande återkopplingssystem. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för tillverkning av genetiska biochips genom en enkel att använda litografisk teknik baserat på DNA strand deplacement reaktioner, som uteslutande använder kommersiellt tillgängliga komponenter. Vi ger också ett protokoll om integrering av konkurrensbetingat gener med ett Polydimetylsiloxan (PDMS)-baserat mikroflödessystem system. Vi visar dessutom att systemet är kompatibelt med Totalreflexion (Frida) fluorescensmikroskopi, som kan användas för direkt observation av molekylära interaktioner mellan DNA och molekyler som ingår i uttrycket mix.

Två-stegs litografi: figur 5 visar resultatet av en litografisk tvåstegsprocess på en glasskiva med överlappande mönster av fluorescently märkt DIS strandar.
Uttryck för en fluorescerande protein från en gen borste: figur 6 visar uttrycket av fluorescerande protein YPet från immobiliserade DNA. På flera punkter i tid bedömde vi andelen gen uttryck genom blekn...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Vi beskriver en enkel litografiska procedur för immobilisering av gen-längd DNA-molekyler på en yta, som kan användas för att utföra cellfria gen uttryck experiment på biochips.

Funktionell yta-immobilisering av gener med utgångsämnet Strand deplacement litografi

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

DNA-biochips är en attraktiv forskningsplattform för självretetisk biologi, som ursprungligen utvecklades av BASF-gruppen, som möjliggör drift av in vitro-genkretsar under längre tidsperioder. Med detta protokoll hoppas vi kunna göra denna teknik tillgänglig för ett bredare spektrum av forskare. Vår metod, benämnd before litografi, representerar en strategi för immobilisering av DNA baserat på DNA-strängen förskjutningsreaktion.Styrkan i denna teknik ligger i dess flerstegslitografiska kapacitet, dess enkla reproducerbarhet, och den kommersiella tillgängligheten av alla komponenter. I likhet med andra biochiplösningar kan befor kombineras med olika tekniker. Till exempel kan funktionella genborstar sättas ihop inom mikrofack för proteinuttryck.Till att börja med förbereda en RCA-blandning genom att blanda fem delar vatten med en del av en 30%ammoniaklösning i en glasbägare. Värm blandningen till 70 grader Celsius på en värmeplatta under omrörning. När den når 70 grader Celsius, tillsätt en del 30%väteperoxid.Placera sedan en 100 millimeters diameter kisel wafer i lösningen, för att avlägsna organiskt material och partiklar från den. Efter 30 minuter, ta ut underlaget, skölj det noggrant med vatten från en tvättflaska, och torka den med en kvävepistol. Fortsätt omedelbart med PEGylationen av substratet.För att åstadkomma detta, först späda biotin-PEG-Silane i torr toluen till 5 milligram per milliliter, och virvel lösningen tills den är väl blandad. Med substratet placeras i ett glas Petriskål, långsamt pipettera lösningen på substratet, som täcker hela ytan, men undvika att lösningen att flöda över kanten. När ytan är täckt, stäng Petriskålen och tillsätt sedan ytterligare ett lock.Efter 30 minuter, ta bort locket, och tillsätt cirka 40 milliliter isopropylalkohol till petriskålen. Ta sedan ut underlaget, skölj det igen noggrant med isopropylalkohol, och torka det med en kvävepistol. När torr, förvara underlaget i mörker tills det behövs.Förbered ett substrat genom att använda en glasskärare eller en skalpell för att bilda en centimeter med en centimeter bitar. Lägg sedan till ett enkelt justeringsmärke genom att göra en kort repa från mitten mot en kant av substratet. Blås några små partiklar från chipet med hjälp av en kvävepistol.Blanda därefter två droppar av ett tvåkomponents silikonlim och applicera limmet på ytan av chipet och lämna området runt spetsen på repa tomt. Där limmet ger en hydrofoba barriär, hålla vattenlösningar på chipet. Detta underlättar efterföljande tvättsteg, och minskar mängden DNA som krävs för inkubationer.I ett senare steg kan limmet lätt skalas av. I följande steg hanteras fotorenbart DNA endast i en gul ljusmiljö. Täck chipet med ca 10 mikroliter av en beforblandning vid rumstemperatur, och placera chipet i en låda som delvis fylls med vatten för att minska avdunstningen.Efter en timme, tvätta chipet flera gånger med PBS för att avlägsna eventuell obunden beforblandning. Därefter lägger du till 10 mikroliter av passivationsblandningen till chipet. Efter två timmar, tvätta chipet flera gånger med PBS för att ta bort de obundna passivationsmedel.Klipp en tryckt fotomask till lämplig storlek för att få plats med en lämplig maskhållare. Sätt in den vid fältstoppets position, och använd justeringsmarkeringarna för att justera masken i hållaren. Med substratet placerat på mikroskopistadiet, sätt in ett rött filter i belysningsvägen, och fokusera på underlagsytan.Sedan navigera till regionen av substratet som kommer att exponeras. Därefter sätter du in maskhållaren, blockerar belysningen och ändrar till UV-filtret. Vid en låg ljusintensitet öppnar du slutaren och använder kameran för att snabbt fokusera masken på underlaget.Med underlaget nu i linje och masken i fokus, blockera ljusvägen till kameran, och belysa underlaget med hög ljusintensitet för önskad exponeringstid. Efter exponering, ta bort provet från mikroskopet, och försiktigt ta bort så mycket buffert som möjligt från substratet utan att torka den. Tillsätt sedan 10 till 20 mikroliter DNA med sekvensen för fastsättning på ytan.Placera substratet i en våt låda för att hålla det från att torka, och inkubera DNA på substratet i två timmar vid rumstemperatur. För att observera det uppdelade genuttrycket på ett inverterat mikroskop, först separat förbereda de två delarna av provhållaren. Börja med att limma fast ett beforchip med en immobiliserad genborste på spånhållaren, med hjälp av dubbelhäftande tejp.Därefter lägger du till lite vakuumfett runt det centrala hålet i hållarens underdel, och för in spånhållaren. Montera nu hållarens översta del. Skär en tunn PDMS chip med fack så små som möjligt, lämnar en kanal öppen för ena sidan för att senare möjliggöra utbyte av avfall och molekyler föregångare genom diffusion Nästa, plasma-behandla ett glasskydd glida i baksidan av PDMS chip med syre plasma.Omedelbart efter behandlingen, placera PDMS-chipet i mitten av glasglaset, med facken pekande uppåt. Sedan baka glaset med PDMS i en timme vid 70 grader Celsius. Strax innan du monterar hela provhållaren, plasma-behandla glaset skjut med PDMS chip som tidigare.Sedan, tillsätt lite vakuumfett runt det stora hålet på den övre hållaren, och placera glaset skjut med PDMS på den. Tryck försiktigt glaset på fettet. Ta försiktigt bort bufferten från chipet, och tvätta den en gång med 10 mikroliter av själv re-uttryck system.Därefter lägger du till 60 mikroliter av självre-expression-systemet på chipet och ta bort det tvåkomponents silikonlimet från kanterna. Nu, lägga till 20 mikroliter av uttrycket systemet på PDMS. Efter att släppa ner droppen på PDMS, kontrollera snabbt i det stereoskopiska mikroskopet att facken är väl våta och utan luftbubblor.Om det finns luftbubblor, försök att tvätta bort dem. För att montera de två bitarna av hållaren, och för att anpassa kammare och DNA-borstar, arbeta under ett stereoskopiskt mikroskop. Immobilisera bottenhållaren med en griparm så de två skruvarna och vingnötterna blir lättåtkomliga med båda händerna.Sätt in den övre hållaren i bottenhållaren, och sänk den tills systemets cellfria uttrycksdroppar smälter samman. Kontrollera sedan att facken och justeringsmarkeringen är i en liknande region i XY-planet. Från botten skruvar du upp vingnötterna tills de rör vid hållarens undersida.Medan du riktar in facken och chipet i XY-planet, dra försiktigt åt vingnöterna. Detta steg kräver viss erfarenhet, och beror på konstruktionen av provhållaren. PDMS-datorerna ska tryckas på chipet endast med mild kraft.Därefter spraya en svamp i anti-avdunstningshöljet med vatten och sätt in hållaren i lådan. Fyll sedan en fem milliliter spruta med tvåkomponents silikonlim, och använd den för att försegla lådan. Slutligen, överför lådan till ett temperaturkontrollerat mikroskop, och bild DNA-borsten och reaktionen med hjälp av fluorescensmikroskopi.En tvåstegslitografisk process, här utförd på en beforglassrutsch, ger överlappande mönster av fluorescerande märkta DNA-strängar. I denna demonstration av on-chip genuttryck, är DNA immobilized i kammaren till vänster. När det utsätts för uttrycksmixen syntetiseras det gula fluorescerande proteinet YPet från det immobiliserade DNA.För att bedöma aktiviteten i genuttryckssystemet observeras återvinningen av fluorescensen efter ett blekningssteg. Vid två timmar återhämtade sig fluorescensintensiteten snabbt. Men efter fyra och sex timmar, det återhämtade sig inte, vilket tyder på att utan en ny leverans av uttrycket mix, reaktionen avslutades runt timme fyra.Även om genuttryck är begränsat i ett slutet system, kan det vara ihållande över längre tidsperioder genom att förse uttrycksutrymmena med ytterligare prekursormolekyler via mikro-fluidik. Beformetoden används för att immobilisera oligonukleotider eller genlängd-DNA, som kan appliceras för att konstruera system av interagerande DNA-borstar för självre-genuttryck. Tekniken kan också användas för andra tillämpningar inom biofysik, såsom enmolekylfluorescensstudier.Efter att ha sett den här videon, bör du kunna fabricera bephore biochips från wafers eller glas diabilder, och integrera dem i dina forskningsprojekt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Litografi Surface Mönstring för att skapa Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kapillärkraften Litografi för Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generering av Aligned Funktionell myokardialvävnad Genom mikrokontakttryckning

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy för funktionell återhämtning av hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Utveckling av en elektrokemisk DNA Biosensor att upptäcka livsmedelsburna patogener

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Fokuserad jonstråle litografi till etch nano-arkitekturer i mikroelektroder

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

Cerebral blodflöde-baserade vilotillstånd funktionell anslutning av den mänskliga hjärnan med optisk diffus korrelation spektroskopi

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Generering och kvantitativ karakterisering av funktionella och polariserade gallans epitelcystor

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetisk replikering av rotytans mikrostruktur med ändring av mjuk litografi

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering av dynamiska miljöförhållanden med hjälp av en mikrofluidisk enhet med hög genomströmning

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...