Name: functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Volkswagen Vakfı (grant no. 89 883) ve Avrupa Araştırma Konseyi (Hibe Sözleşmesi No 694410 - AEDNA) tarafından bu proje için finansal destek minnetle anıyoruz. YÜKSEK LİSANS-S. Destek DFG GRK 2062 aracılığıyla tarafından kabul eder.

Not: Bir zaman planı farklı bölümlerde yer alan adımlar için tamamlayıcı bilgiler (Bölüm 1) verilir.
1. küçük parça imalat
Not: gibi yüzeylerde, kullanım silikon gofret (100 mm çap, 0.525 mm kalınlığında) ile 50 nm kalın bir tabaka silikon dioksit veya cam slaytlar (24 mm x 24 mm, No 1.5; 22 mm x 50 mm, No 4). Uygulamaya bağlı olarak, diğer boyutları ve kalınlıkları daha uygun olabilir.
<ol><li>Yüzeylerde üzerinden bir RCA t...

<ol>
	<li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip.">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li><li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus.">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.+coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides.">The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li><li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology.">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li><li>Est&#233;vez-Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+and+reversible+photocontrol+of+transcription/expression+systems+using+a+photosensitive+nucleic+acid+binder.">Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).</li><li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance.">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-Grained+Dynamics+of+Protein+Synthesis+in+a+Cell-Free+System.">Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System.</a> Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+replication,+synthesis,+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction.">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Maeda, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+MreB+filaments+on+liposome+membranes:+a+synthetic+biology+approach.">Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Niederholtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-free+forward+engineering+of+novel+genetic+ring+oscillators.">Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators.</a> eLife. 4, e09771 (2015).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+by+pure+translation+systems.">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), 299-304 (2005).</li><li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+prospects+for+biotechnology.">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+crowding+shapes+gene+expression+in+synthetic+cellular+nanosystems.">Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems.</a> Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).</li><li>van Nies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-replication+of+DNA+by+its+encoded+proteins+in+liposome-based+synthetic+cells.">Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).</li><li>Buxboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step+photolithographic+interface+for+cell-free+gene+expression+and+active+biochips.">A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips.</a> Small. 3 (3), 500-510 (2007).</li><li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface.">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li><li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes.">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li><li>Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+by+directional+gene+expression.">Compartmentalization by directional gene expression.</a> Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).</li><li>Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+on-chip+DNA+compartments+as+artificial+cells.">Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells.</a> Science. 345 (6198), 829-832 (2014).</li><li>Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagating+gene+expression+fronts+in+a+one-dimensional+coupled+system+of+artificial+cells.">Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells.</a> Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).</li><li>Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+on+DNA+Biochips+Patterned+with+Strand-Displacement+Lithography.">Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).</li><li>Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+Erasable+DNA+Photolithography.">Multicolor and Erasable DNA Photolithography.</a> ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).</li><li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction.">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li><li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly(dimethylsiloxane).">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).</li></ol>

Bephore litografi DNA veya RNA desenli immobilizasyon için güçlü ve çok yönlü bir tekniktir. Henüz, yordam olan - çevirdiyseniz - başarısızlık için bir kaynak bulabilirsiniz birkaç adım içerir veya sistemin performansı düşer.
Bephore cips imalatı bir çok önemli biyouyumluluk yüzey sağlar substrat PEGylation adımdır. Ayrıca sonraki silanization için yüzey aktive beri burada, bir RCA yordamı ile temizlik adım önemlidir. Gerçek PEGylation sırasında belgili tan?...

Hücre-alerjik reaksiyonlar Biyokimya, biyoteknoloji ve sentetik biyoloji çeşitli uygulamalar için yoğun ilgi vardır gen ekspresyonu. Boş hücre ifade proteinlerin çok sayıda çalışma için temel yapısal biyoloji dersinde olduğunu saf protein örnekleri hazırlanması için vesile oldu. Örneğin, boş hücre sistemleri hücre tabanlı ifade kullanarak üretmek zor olan protein kompleksleri1 veya membran proteinleri2, ifade için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Özellikle, hücre ücretsiz-gen ekspresyonu reaksiyonlar da 19613çığır açan deneylerde Nirenberg ve Matthaei ile başlayan genetik kod yapısını aydınlatmak için kullanıldı.
Son zamanlarda, boş hücre Yöntemler Biyoteknoloji ve sentetik biyoloji4,5,6yenilenmiş bir ilgi olmuştur. Boş hücre sistemleri biyolojik olmayan bileşikler ile artar ve bileşenleri çeşitli biyolojik kökenli daha kolay7birleştirilebilir. Boş hücre sistemleri onlar "büyümek ve bölmek" yapmak değil bariz dezavantajı olsa bile, bu temel metabolik fonksiyonları ile açık boş hücre Biyoreaktörler hazırlamak ve onlara sağlanan basit karbon ve enerji ile metabolitleri sentezlemek için akla yatkın girişleri8. Sentetik biyoloji gelişmekte olan alanı içinde boş hücre sistemleri bir daha öngörülebilir "kasa" uygulanması için sentetik biyolojik fonksiyonların olacağıma söz veriyorum.
Şu anda, boş hücre gen ifade tepkiler are ikisinden biri istimal dışarı araba hücre ayıklar (farklı kaynaklardan gelen bakteri, Maya, böcekler gibi), veya (Örneğin, farklı uygulamalar için en iyi duruma getirilmiş transkripsiyon/çeviri sistemleri prokaryotik ve Ökaryotik gen ekspresyonu, üretim zar proteinleri, vb). Yaygın bir iletişim kuralı (yaygın olarak adlandırdığı TXTL) bakteri hücre özü hazırlanması için son zamanlarda V. Noireaux ve iş arkadaşlarınızla9tarafından sağlandı. Biyofiziksel özellikleri iyice karakterize10edilmiş ve TXTL sistem zaten başarılı bir şekilde karmaşık biyokimyasal görevleri bir dizi yapmak için kullanılmıştır: Örneğin, fonksiyonel bacteriophages yolu ile Meclisi Feyc genom11, bakteriyel protein filamentler12sentezi veya boş hücre gen devreleri13,14uygulamaları ifade boş hücre.
Başka bir sistem içinde boş hücre sentetik biyoloji popüler saf bileşenleri15,16' dan yeniden saf sistemidir. TXTL sisteme göre enzimler veya protein yıkımı makine içermez. Doğrusal DNA bozulması, RNA molekülleri proteinler mi bir sorun daha az saf sisteminde, çürüme yolları aslında dinamik işlevleri uygulanması için önemlidir. TXTL sistemi (RecBCD) aracılığıyla doğrusal gen şablonları eksonükleaz bozulma etkisini azaltmak için eklenecek son koruma GamS protein vardır. TXTL ve saf sistemi ticari olarak kullanılabilir.
Bir tema yakından boş hücre biyolojisi kaygıları bölünebilme biyokimyasal reaksiyonlar üzerinde etkisi ve daha fazla yapay hücre benzeri yapıları veya protocells17,18,19 oluşturma çalışma ilgili. ,20. Araştırma yapay hücrelerde genellikle veziküler bölmeleri fosfolipitler veya diğer amphiphiles yapılmış içinde bir biyokimyasal reaksiyon sistemi encapsulation içerir. Bu tür sistemlere bölünebilme temel yönlerini veya cellularity ve kendi kendini kopyalayan yapıları keşfetmek için yardımcı olsa da, onlar kapalı sistemler tipik sorunlarla karşı karşıya: yokluğunda işleyen bir metabolizma ve uygun membran taşıma mekanizmaları, bu bölümlere tepkiler uzun bir süre için çalışan tutmak zordur - yakıt molekülleri kullanılır ve atıklar birikir.
Bölünebilme böyle hücre taklit eden bölmeleri içinde için ilginç bir alternatif genetik materyal photolithographic yöntemlerle uzamsal kuruluştur. İmmobilizasyon "genlerin bir yonga üzerinde" on yıldan fazla öncülük Weizmann Enstitüsü Bar-Ziv grubu tarafından21. Çözülmesi gereken önemli konular arasında belirsiz adsorpsiyon DNA ve proteinler çip yüzeyinde potansiyel denatürasyon idi. Bar-Ziv vd immobilizasyon silikon dioksit yüzeylerde resist moleküllerin emin uzun Polietilen glikol (PEG) ayırıcı için reaktif bir terminal silane oluşan "Daisy" olarak adlandırdığı bir adanmış fotolitografi resist geliştirilen biyouyumluluk ve ışınlama ultraviyole (UV) ışık ile üzerine bir reaktif Amin içine dönüştürülmüş bir photocleavable headgroup. Daisy bir çip yüzeyinde (ile birkaç kilo baz-çifti (kbp) uzunlukları) gen-uzunluk DNA molekülleri hareketsiz için kullanılabilir gösterilmiştir. Bir polimer fizik açısından bakıldığında, bir katı substrat aşılı polimer fırçalar sistemleri temsil. DNA Polielektrolit yapısı nedeniyle bu fırçaların uyum kuvvetle ozmotik ve diğer iyon özel efektleri22,23tarafından etkilenir.
En önemlisi, substrat immobilize genleri hala işlevsel ve kopya etmek ve içine çevrilmiş RNA ve protein olabilir gösterilmiştir. Gene fırçalar için RNA polimeraz çözüm24erişilebilir ve transkripsiyon/çeviri karmaşık makromoleküllerin karışımı yüzeyde denatüre değil. Onlar sürekli olarak küçük habercisi moleküller ile ve hangi atık ürünlerin kaldırılan25 olabilir üzerinden sağlanan bir açık mikrosıvısal reaktör sisteminde çalıştırılabilir immobilizasyon bir yüzey üzerinde genetik bileşenlerinin avantajlarından biri olduğunu , 26.
Biz son zamanlarda sadece ticari olarak mevcut bileşenleri dayanıyordu ve fingerprinting DNA strand işgaline tepkiler için kullanılan Bephore (için biyouyumlu elektron ışını ve fotorezist)27, olarak adlandırılan bu yöntem bir türevi geliştirilmiştir yapay hücre çip tabanlı oluşturulması için bir basit uygulamak multistep litografi yordam gerçekleştirilmesi. Yordamı şematik bir bakış Şekil 1' de gösterilen. Biyouyumlu PEG katman üzerinde immobilize photocleavable grubu içeren DNA saç tokası molekülleri dayanır. Photocleavage saç tokası, hangi DNA yoluyla bağlı yolu ile çıkıntı aracılı strand işgali molekülleri ("yerinden" DIS sıra içeren) ilgi olabilir bir tek iplikçikli çıkıntı dizisi sunar.
Bephore uygulamak potansiyel olarak daha basit olmakla birlikte, Daisy çok yoğun ve temiz gerçekleştirilmesinin sağlar "gen fırçalar", hangi belirli uygulamalarda avantajları vardır. Prensip olarak, ancak, Daisy ve Bephore litografi kolayca birlikte. DNA iplikçik deplasman DNA yapılanma için altın fırçalar kullanan bir ilgili litografi yöntemi daha önce Huang vdtarafından geliştirilmiş, ancak boş hücre gen ifade28,29bağlamında kullanılmıştır değil.
Aşağıdaki protokolünde DNA üretim ayrıntılı bir açıklaması için Bephore yöntemini kullanarak boş hücre gen ekspresyonu fırçaları sağlar. Biz nasıl gen cips cihazlarında ve genlerin bir yonga üzerinde dağınık şekilde yapılandırılmış immobilizasyon için çok adımlı fotoğraf-litografi kullanımını göstermek açıklanmaktadır. Biz de tepki odaları imalatı ve havacilik üstünde-küçük parça gen ifade reaksiyonlar performansı için uygulama tartışıyorlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (for PDMS master mold)</td>
			<td>Siegert Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Thickness (&#181;m): 525 &#177;25, Diameter (mm): 76.2 (3&#8221;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 4</td>
			<td>Menzel</td>
			<td></td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides no. 1.5</td>
			<td>Assistent</td>
			<td></td>
			<td>24 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Silane</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td></td>
			<td>MW 5,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous toluene</td>
			<td>Sigma Aldrich (Merck)</td>
			<td>244511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td>Spin-column PCR clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURExpress</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800S</td>
			<td>Cell-free expression system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS&#160;</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Slygard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>F8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)</td>
			<td>Bola</td>
			<td>S 1810-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpoCore 20</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr-Dev 600</td>
			<td>micro resist technology&#160;GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Photoresist developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-Prime</td>
			<td>MicroChemicals</td>
			<td></td>
			<td>Adhesion promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component silicon glue</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-protection yellow foil</td>
			<td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td>
			<td>Y520E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks for photolithography</td>
			<td>Zitzmann GmbH</td>
			<td></td>
			<td>64.000 dpi, 180x240 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Photolithography and fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LumPlanFl</td>
			<td>Used with Olympus BX51, NA 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Coolsnap HQ</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligtht source</td>
			<td>EXFO</td>
			<td>X-Cite 120Q</td>
			<td>Used with Olympus BX51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti2-E</td>
			<td>Fluorescence imaging of gene expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI P-Apo 4x Lambda</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo5.5</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>SOLA SM II</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>bold line</td>
			<td>Used with Nikon Ti2-E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Controller</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoPhotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td></td>
			<td>DNA concentration measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener</td>
			<td>Femto</td>
			<td>200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional surface-immobilization of genes using multistep strand displacement lithography

Lithographically yapısal yüzeylerde genlerin immobilizasyon compartmentalized gen çalışmanın bir açık mikrosıvısal biyoreaktör sisteminde ifade işlemleri sağlar. Yapay hücresel sistemleri diğer yaklaşımlar aksine, gen ifade reaktifler ve atık ürünlerin eşzamanlı boşaltma ile sürekli bir tedarik için böyle bir kurulum sağlar. Bu boş hücre gen ifade işlemleri uygulama uzun bir süre dinamik gen düzenleyici görüş sistemleri gerçekleşmesi için önemli olan, üzerinde kolaylaştırır. Burada sadece ticari olarak mevcut bileşenleri kullanan DNA strand yer değiştirme reaksiyonları üzerinde dayalı bir basit-e doğru-kullanma tekniğinde tekniği kullanarak genetik biochips imalatı için detaylı bir protokol sağlar. Biz aynı zamanda bir polydimethylsiloxane (PDMS) bölümlere genler entegrasyonu üzerinde bir protokol sağlar-tabanlı mikrosıvısal sistemi. Ayrıca, sistem doğrudan gözlem DNA ve ifade karışımda bulunan moleküller arasındaki moleküler etkileşim için kullanılan toplam iç yansıma Floresan (TIRF) mikroskopi ile uyumlu olduğunu göstereceğiz.

İki adım litografi: Şekil 5 desen fluorescently etiketli DIS iplikçiklerinin çakışan bir cam slayt üzerinde tekniğinde bir işlemdir sonucunu gösterir.
Bir gen fırça floresan bir protein ifadesi: Şekil 6 immobilize DNA'dan floresan protein YPet ifade gösterir. Biz kısmen floresan protein ağartma ve kurtarma floresans sinyalinin gözlemleyerek gen ifade h...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography at JoVE.com

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

DNA biyoçipleri, in vitro gen devrelerinin uzun süre ler boyunca çalışmasını sağlayan BASF grubu tarafından geliştirilen, kendi kendini yeniden sentetik biyoloji için cazip bir araştırma platformudur. Bu protokolle, bu teknolojiyi daha geniş bir araştırmacı yelpazesine sunmayı umuyoruz. Befor litografi olarak adlandırdığımız yöntemimiz, DNA iplikçik yer değiştirme reaksiyonuna dayalı DNA'nın immobilizasyonu için bir stratejiyi temsil ediyor.Bu tekniğin gücü, çok aşamalı litografik yetenekleri, basit tekrarlanabilirliği ve tüm bileşenlerin ticari kullanılabilirliği ile ilgilidir. Diğer biyoçip çözümlerine benzer şekilde, bephore farklı teknolojilerle kombine edilebilir. Örneğin, fonksiyonel gen fırçaları protein ekspresyonu için mikro bölmeler içinde monte edilebilir.Başlamak için, bir cam kabında% 30 amonya çözeltisi bir parçası ile beş parça su karıştırarak bir RCA karışımı hazırlamak. Karıştırırken karışımı sıcak bir tabakta 70 dereceye ısıtın. Bir kez 70 santigrat derece ulaşır, bir parçası% 30 hidrojen peroksit ekleyin.Sonra çözelti içine 100 milimetre çapında silikon gofret yerleştirin, ondan organik madde ve parçacıklar kaldırmak için. 30 dakika sonra, substrat çıkarmak, iyice bir yıkama şişesi su ile durulayın ve bir azot tabancası ile kurulayın. Hemen substrat PEGylation ile devam edin.Bunu başarmak için, ilk seyreltik biotin-PEG-Silane kuru toluen mililitre başına 5 miligram, ve girdap çözeltisi kadar iyice karıştırılır. Bir cam Petri kabına yerleştirilen substrat ile, yavaş yavaş tüm yüzeyi kaplayan, substrat üzerine çözelti pipet, ama çözüm kenarına akmasına izin kaçının. Yüzey kapatıldıktan sonra Petri kabını kapatın ve ek bir kapak ekleyin.30 dakika sonra kapağı çıkarın ve Petri kabına yaklaşık 40 mililitre isopropil alkol ekleyin. Sonra substrat çıkarmak, tekrar iyice izopropil alkol ile durulayın ve bir azot tabancası ile kurulayın. Kuruduğunda, gerekli olana kadar karanlıkta substrat saklayın.Bir santimetre parçalar tarafından bir santimetre oluşturmak için bir cam kesici veya neşter kullanarak bir substrat hazırlayın. Daha sonra, merkezden substrat kenarına doğru kısa bir çizik yaparak basit bir hizalama işareti ekleyin. Azot tabancası kullanarak çipteki küçük parçacıkları patlatın.Daha sonra, iki bileşenli silikon tutkal iki damlacık karıştırın ve çizik ucu etrafında alan boş bırakarak, çip yüzeyine tutkal uygulayın. Orada tutkal bir hidrofobik bariyer sağlar, çip üzerinde sulu çözeltiler tutarak. Bu sonraki yıkama adımlarını kolaylaştırır ve kuluçka için gerekli DNA miktarını azaltır.Daha sonraki bir adımda, tutkal kolayca soyulmuş olabilir. Aşağıdaki adımlarda, fotocleavable DNA sadece sarı ışık ortamında işlenir. Oda sıcaklığında bir befor karışımı yaklaşık 10 mikrolitre ile çip kapağı ve buharlaşmayı azaltmak için kısmen su ile dolu bir kutu ya da çip yerleştirin.Bir saat sonra, herhangi bir bağlanmamış befor karışımı kaldırmak için PBS ile çip birkaç kez yıkayın. Sonra, çipe pasifasyon karışımından 10 mikrolitre ekleyin. İki saat sonra, bağlanmamış pasifasyon ajanlarını çıkarmak için çipi PBS ile birkaç kez yıkayın.Uygun bir maske tutucusu sığdırmak için baskılı bir fotoğraf maskesini uygun boyuta kesin. Alan durağının konumuna takın ve maskeyi tutucuda hizalamak için hizalama işaretlerini kullanın. Mikroskop aşamasına yerleştirilen substrat ile, aydınlatma yoluna kırmızı bir filtre yerleştirin ve substrat yüzeyine odaklanın.Daha sonra, maruz kalacak substrat bölgeye gidin. Ardından maske tutucuyu takın, aydınlatmayı engelleyin ve UV filtresine değiştirin. Düşük ışık yoğunluğunda deklanşörü açın ve maskeyi substrata hızla odaklamak için kamerayı kullanın.Alt tabaka şimdi hizalanmış ve maske odakta, kameraya ışık yolunu engelleyin ve istenilen pozlama süresi için yüksek ışık yoğunluğunda substratı aydınlatın. Pozlamadan sonra, numuneyi mikroskoptan çıkarın ve kurutmadan mümkün olduğunca fazla arabelleği substrattan dikkatlice çıkarın. Daha sonra, yüzeye bağlanma sırası ile 10 ila 20 mikrolitre DNA ekleyin.Kurumasını engellemek için substratı ıslak bir kutuya yerleştirin ve DNA'yı oda sıcaklığında iki saat boyunca substrat üzerinde kuluçkaya yatırın. Ters bir mikroskopüzerinde bölümlenmiş gen ekspresyonunu gözlemlemek için, önce numune tutucunun iki parçasını ayrı ayrı hazırlayın. Çift taraflı yapışkan bant kullanarak, hareketsiz gen fırçası ile bir befor çipi talaş ile talaş ile fiş tutucuya yapıştırarak başlayın.Daha sonra, tutucunun alt kısmının orta deliğine biraz vakum yağı ekleyin ve talaş tutucuyu takın. Şimdi tutucunun üst kısmını birleştirin. Mümkün olduğunca küçük bölmeleri ile ince bir PDMS çip kesin, daha sonra difüzyon Sonraki tarafından atık ve öncümoleküllerin değişimi için izin vermek için bir tarafa açık bir kanal bırakarak, plazma tedavi oksijen plazma ile PDMS çipin arka tarafında bir cam kapak kayma.Tedaviden hemen sonra, PDMS çipini cam kaydıraktan sonra bölmeleri yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Sonra, 70 santigrat derece bir saat PDMS ile cam pişirin. Numune tutucunun tamamını montajdan kısa bir süre önce, cam kaydırağı DAHA ÖNCE OLDUĞU GIBI PDMS çiple plazma gibi tedavi edin.Daha sonra, üst tutucunun büyük deliğinin etrafına biraz vakum yağı ekleyin ve üzerine PDMS içeren cam kaydırağı yerleştirin. Bardağı yavaşça yağın üzerine bastırın. Arabelleği çipten dikkatlice çıkarın ve 10 mikrolitre kendini yeniden ifade sistemiyle bir kez yıkayın.Daha sonra, çip üzerine 60 mikrolitre kendini yeniden ifade sistemi ekleyin ve kenarlardan iki bileşenli silikon tutkal çıkarın. Şimdi, PDMS üzerine ifade sisteminin 20 mikrolitre ekleyin. Damlacık'ı PDMS'ye yerleştirdikten sonra, bölmelerin ıslak ve hava kabarcıkları olmadan stereoskopik mikroskobu hızlıbir şekilde kontrol edin.Hava kabarcıkları varsa, onları yıkamaya çalışın. Tutucunun iki parçasını birleştirmek ve odaları ve DNA fırçalarını hizalamak için stereoskopik mikroskop altında çalışır. İki vida ve wingnuts her iki elinizle kolayca erişilebilir böylece bir kavrayedici kol ile alt tutucu immobilize.Üst tutucuyu alt tutucuya takın ve hücresiz ifade sistemi damlacıkları kaynayana kadar indirin. Ardından, bölmelerin ve hizalama işaretinin XY düzleminde benzer bir bölgede olduğundan emin olun. Alttan, tutucunun alt tarafına dokunana kadar kanat larını vidalayın.XY düzlemindeki bölmeleri ve çipi hizalarken kanatsoklarını hafifçe sıkın. Bu adım biraz deneyim gerektirir ve numune tutucunun yapısına bağlıdır. PDMS çip üzerine sadece nazik bir kuvvetle bastırılmalıdır.Daha sonra, su ile anti-buharlaşma muhafaza bir sünger sprey ve kutuya tutucu yerleştirin. Sonra, iki bileşenli silikon tutkal ile beş mililitrelik şırınga doldurun ve kutumühür için kullanabilirsiniz. Son olarak, kutuyu sıcaklık kontrollü bir mikroskoba aktarın ve floresan mikroskop kullanarak DNA fırçasını ve reaksiyonu görüntüleyin.Burada before cam bir slayt üzerinde gerçekleştirilen iki aşamalı litografik işlem, floresan olarak etiketlenmiş DNA iplikçiklerinin üst üste binme desenlerini verir. Çip teki gen ekspresyonunun bu gösteriminde, DNA soldaki odada hareketsiz hale getirilmiştir. İfade karışımına maruz kaldığında, sarı floresan protein YPet immobilize DNA'dan sentezlenir.Gen ekspresyonu sisteminin aktivitesini değerlendirmek için, floresan kurtarma bir beyazlatma adımı sonra gözlenir. İki saat sonra floresan şiddeti hızla düzeldi. Ancak, dört ve altı saat sonra, ifade karışımı taze bir kaynağı olmadan, reaksiyon saat dört civarında sona erdiğini belirten, kurtarmak vermedi.Gen ekspresyonu kapalı bir sistemde sınırlı olmasına rağmen, mikro-akışkanlar aracılığıyla ek öncül moleküller ile ekspresyon bölmeleri temin ederek uzun süreler boyunca sürdürülebilir. Befor yöntemi, kendi kendine yeniden gen ekspresyonu için etkileşimedebilen DNA fırçalarının sistemlerini oluşturmak için uygulanabilen oligonükleotidleri veya gen uzunluğu DNA'sını hareketsiz hale getirmek için kullanılır. Bu teknik aynı zamanda biyofizikteki tek moleküllü floresan çalışmaları gibi diğer uygulamalar için de kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, gofret veya cam slaytlar bephore biyoçipler imal etmek ve araştırma projelerinize entegre etmek gerekir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Kardiyak Doku Mühendisliği kılcal Kuvvetleri Litografi

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Hemiplejik Arms Fonksiyonel Kurtarma için Robotik Ayna Tedavi Sistemi

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Gıda kaynaklı patojen tespit etmek için bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı gelişimi

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

Etch Nano mimarilerine mikroelektrotlara odaklanmış iyon ışını Litografisi

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

Optik Diffüz Korelasyon Spektroskopisi ile İnsan Beyninin Serebral Kan Akışı Nadayalı Dinlenme Durumu Fonksiyonel Bağlantısı

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Yumuşak Litografi Değişimi Ile Kök Yüzey Mikroyapısının Biyomimetik Replikasyonu

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...