Name: antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Thea Brennan-Krohn blev støttet af en Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og menneskelig udvikling pediatric infektionssygdomme forskning uddannelse grant (T32HD055148), en National Institute for allergi og infektionssygdomme uddannelse grant ( T32AI007061), en Boston children's Hospital Office af fakultet udvikling Fakultet karriereudvikling stipendium, og en National Institute for allergi og infektionssygdomme karriere udvikling award (1K08AI132716). J.E.K. blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme af National Institutes of Health under award nummer R33 AI119114. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae:+Biology,+epidemiology,+and+management.">Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).</li><li>Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+antibiotics.">The future of antibiotics.</a> Critical Care. 18 (3), (2014).</li><li>Spellberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemic+of+antibiotic-resistant+infections:+a+call+to+action+for+the+medical+community+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).</li><li>Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+antibiotic+synergy+for+polymyxin+B-resistant+carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).</li><li>Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+dual+carbapenem+combinations+against+carbapenemase-producing+Enterobacteriaceae.">In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).</li><li>Zusman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+of+in+vitro+synergy+of+polymyxins+and+carbapenems.">Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).</li><li>Clock, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+doripenem+alone+and+in+multi-agent+combinations+against+extensively+drug-resistant+Acinetobacter+baumannii+and+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).</li><li>Hirsch, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antimicrobial+combinations+for+Klebsiella+pneumoniae+carbapenemase-producing+K.+pneumoniae.">Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).</li><li>T&#228;ngd&#233;n, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+double-+and+triple-antibiotic+combinations+for+VIM-+and+NDM-producing+klebsiella+pneumoniae+by+in+vitro+time-kill+experiments.">Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).</li><li>Tascini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activity+of+colistin+plus+rifampin+against+colistin-resistant+kpc-producing+klebsiella+pneumoniae.">Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).</li><li>Paul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+carbapenem-resistant+Gram-negative+bacteria.">Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).</li><li>Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+for+treating+carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae.">Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verification+of+an+automated,+digital+dispensing+platform+for+at-will+broth+microdilution-based+antimicrobial+susceptibility+testing.">Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).</li><li>Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+Synergistic+Activity+of+Antimicrobial+Combinations+Against+Carbapenem-Resistant+Enterobacteriaceae+Using+Inkjet+Printer-Based+Technology.">Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology.</a> J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).</li><li>Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Activity+of+Colistin-Containing+Combinations+against+Colistin-Resistant+Enterobacteriaceae.">Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin:+The+Revival+of+Polymyxins+for+the+Management+of+Multidrug-Resistant+Gram-Negative+Bacterial+Infections.">Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).</li><li>Nation, R. L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+in+the+21st+century.">Colistin in the 21st century.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).</li><li>Ah, Y. -. M., Kim, A. -. J., Lee, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+resistance+in+Klebsiella+pneumoniae.">Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).</li><li>Bratu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae+in+Brooklyn,+NY:+Molecular+epidemiology+and+in+vitro+activity+of+polymyxin+B+and+other+agents.">Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).</li><li>Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+plus+imipenem,+meropenem,+or+tigecycline+against+KPC-2-producing+Enterobacteriaceae+with+high+MICs+for+these+antimicrobials.">In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).</li><li>MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+methodology+and+implementation+of+a+semiautomated+serial+dilution+microtechnique+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing.</a> Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).</li><li>Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poisoned+well:+Enhancing+the+predictive+value+of+antimicrobial+susceptibility+testing+in+the+era+of+multidrug+resistance.">The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , (2018).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , (2018).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), 7 (1999).</li><li>Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+drop+plate+technique+for+bacterial+enumeration+by+parametric+and+nonparametric+tests.">Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests.</a> Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+6x6+drop+plate+method+for+simultaneous+colony+counting+and+MPN+enumeration+of+Campylobacter+jejuni,+Listeria+monocytogenes,+and+Escherichia+coli.">A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli.</a> Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).</li><li>Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Inoculum+and+Activity+in+AmpC-+and+Extended-Spectrum+(ESBL)-Producing+Escherichia+coli+and+Klebsiella+pneumoniae+Clinical+Isolates+Tested+by+Using+NCCLS+ESBL+Methodology.">Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inoculum+Effect+in+the+Era+of+Multidrug+Resistance:+Minor+Differences+in+Inoculum+Have+Dramatic+Effect+on+Minimal+Inhibitory+Concentration+Determination.">The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+Testing:+Broth+Microdilution+Checkerboard+and+Broth+Macrodilution+Methods.">Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Kill+Assay+for+Determining+Synergy.">Time-Kill Assay for Determining Synergy.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Hindler, J. A., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+MIC+variability+by+method+for+contemporary+clinical+isolates+of+multidrug-resistant+gram-negative+bacilli.">Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).</li><li>Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+add+or+not+to+add+Polysorbate+80:+Impact+on+colistin+MICs+for+clinical+strains+of+Enterobacteriaceae+and+Pseudomonas+aeruginosa+and+quality+controls.">To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).</li><li>Fuchs, P. C., Barry, a. L., Brown, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+testing+quality+control+studies+with+fosfomycin+tromethamine.">Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine.</a> European journal of clinical microbiology &amp; infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+Bactericidal+Concentration+Testing.">Minimum Bactericidal Concentration Testing.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+in+combination+with+various+antibiotics+against+extensively+drug-resistant+Enterobacter+cloacae+with+decreased+susceptibility+to+polymyxin+B.">In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).</li><li>Bulman, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin+combinations+combat+Escherichia+coli+harboring+mcr-1+and+blaNDM-5:+Preparation+for+a+postantibiotic+Era.">Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era.</a> mBio. 8 (4), (2017).</li></ol>

D300 Digital Dispenser og tilknyttede forbrugsvarer blev leveret af Tecan (Morrisville, NC). Tecan spillede ingen rolle i undersøgelse design, data indsamling/fortolkning, manuskript forberedelse eller beslutningen om at offentliggøre.

De to metoder beskrevet her giver begge oplysninger om aktiviteten af antimikrobielle stoffer brugt i kombination i forhold til deres individuelle aktivitet. Den automatiserede, inkjet printer-assisteret digitale udlevering metode er en tilpasning af metoden beskrevet i klinisk Mikrobiologi procedurer håndbog33, mens metoden tid-kill mere nøje følger den tilhørende protokol fra den samme referere til34.
I metoden skakternet array beregninger til at bestemme antimikrobiel materiel til at tilføje til hver brønd nødvendige mængde samt udlevering af disse mængder er automatiseret, således at eliminere nogle af de vigtigste potentielle kilder til fejl opstod i en manual skakternet array. Det er imidlertid stadig vigtigt, at investigator bestemmer, at oprindelige bestande er lavet på den planlagte fusion og at målet endelige koncentrationer er indgået D300 softwaren korrekt. Tilføje antimikrobiel suspension brønde i en 384-godt plade kan være udfordrende i første omgang og kræver pleje for at sikre at pipette tip Angiv passende brøndene og at væske splash op ikke i kanten af brøndene. En automatiseret flydende handleren kan bruges i stedet for en håndholdt multikanalpipette for at øge hastighed og nøjagtighed, hvormed den bakterielle suspension er føjet til brønde. Som beskrevet i protokollen, kræver D300 tilføjelse af det overfladeaktive stof, Polysorbat 20 (P-20), for korrekt flydende håndtering. En anden overfladeaktivt stof, Polysorbat 80, i en koncentration på 0,002%, er blevet konstateret for at sænke colistin mikrofoner for organismer med colistin mikrofoner af < 2 µg/mL i standard bouillon microdilution assays. 35 , 36 vores laboratorium tidligere vist, at P-20 i koncentrationer op til 0.0015% havde ingen effekt på D300-assisteret MIC resultater i sammenligning med reference BMD14. I analysen eksemplet præsenteres her, er den maksimale P-20, koncentrationen er 0.0014%.
Et problem vi stødte med nogle skakternet array assays var et stort antal springes brønde. Dette skete efter en uforholdsmæssige sats til visse antibiotika. Specifikt, i en skærm kombinationer mod en samling af carbapenem-resistente enterobakterierfandt vi, at samtidig med at 49 af 521 forsøg (9,4%) var ubrugelig på grund af flere springes wells, 2 af de 12 antibiotika testet (fosfomycin og cefepime) tegnede sig for 46 af disse forsøg (94%). Sådanne øgede satser er mere sandsynligt i lægemidler, som er særligt modtagelige for inokulum effekt31,32,37. Af note anbefaler der ikke test fosfomycin i bouillon fortynding25 på grund af bekymringer om resultaternes pålidelighed med denne metode, som kan forklare de upålidelige resultater set med dette stof. Nogle ændringer kan foretages til automatiseret skakternet metode efter investigator præference. Antimikrobielle stoffer kan udleveres i plader der allerede indeholder bakteriel suspension, snarere end i tomme wells, hvis dette er at foretrække af hensyn til arbejdsgangen i laboratoriet. Mens 384-godt plader blev brugt her, kan metoden også gennemføres i 96-brønd plade assays med passende ændring af godt volumen. Brugen af en 96-brønd plade format kan hjælpe med at reducere springes brønde for antibiotika, der er særligt følsomme over for små ændringer i inokulum. Ved beregning af FIC,jeg, kan der være situationer, hvor mikrofonen er unormale (dvs., højere end testet), herunder situationer, hvor stoffet testes har ingen aktivitet individuelt mod type af organismen bliver testet. I disse tilfælde, kan FIC beregnes på basis antager MIC er én fortynding højere end den højeste koncentration testet. Dette er den mest konservative strategi, som det påtager sig den maksimale mulige FIC værdi for enhver fortynding, hvor hæmning er iagttaget under synergy test. For eksempel, hvis den faktiske MIC blev i stedet to fordobling fortyndinger ovenfor den højeste koncentration testet, så de tilsvarende FICs ville være to gange lavere end de konservative tildelinger, og så videre.
Præcist vurdere de bakteriedræbende aktivitet af narkotika i en tid-kill assay, er det væsentligt, at kulturer i logaritmiske fase vækst, især når cellevæg aktive antibiotika er ved at blive testet28. For de hastigt voksende bakterier bruges i dette eksempel (K. pneumoniae), 3 timers inkubation med ryster var passende at nå denne vækstfase, men forskellige mængder af tid kan være nødvendigt for forskellige organismer. Generelt bør kulturen vises synligt, men ikke stærkt grumset. Den passende mængde tid kan bestemmes ved at konstruere en vækstkurve med koloni tæller taget på serielle tid point (f.eks. hvert 30 min for 4-6 h)38. Den planlagte start inokulum i tid-kill undersøgelse er også vigtig. Target koncentrationen af den begyndende inokulum er ca 5 x 105 til 1 x 106 CFU/mL. Fortynding beskrevet her (100 μL af 1.0 McFarland suspension i 10 mL af medier) genererer denne inokulum for Klebsiella pneumoniae og andre enterobakterier arter som vi har testet det. Hvis tætheden af de begyndende inocula i et eksperiment ved hjælp af forskellige organismer er betydeligt højere eller lavere end dette, kan derefter en anden fortynding være nødvendig. (Den passende fortynding påkrævet for en given art kan bestemmes ved at udføre et kimtal af 0,5 eller 1,0 McFarland suspension til at bestemme, hvor mange organismer denne turbiditet repræsenterer, derefter beregningen som den første udsættelse skal være fortyndes for at nå den passende slutkoncentration.) Hvis på anmeldelse af pladen tæller fra synergi undersøgelse, den begyndende inokulum af nogen af de antibiotika, der indeholder rør er fundet at have været betydeligt lavere end den begyndende inokulum i kontrolelementet vækst, kan dette angive hver antibiotiske fremførsel eller meget hurtig aflivning af bakterier i den korte tid mellem tilsætning af bakterier til antibiotika-holdige røret og fjernelse af alikvot for plating. Hvis det faktiske antal kolonier i ufortyndet drop i en serie er lavere end antallet af kolonier i efterfølgende fortyndinger, tyder dette antibiotika afsmittende virkning. Forskellige muligheder er blevet beskrevet for at forhindre denne virkning, herunder sprede en enkelt alikvot over en hel plade38 eller spinning ned prøven, fjernelse af supernatanten og re suspension i sterilt saltvand før plating39. På hvert tidspunkt i tid-kill metode er det også afgørende for investigator effektivt men præcist fjerne en prøve fra hver kultur tube og udføre serielle fortyndinger. Forsinkelser under denne proces, især i tidlig tidspunkter, der forekommer i tætte træk, kan føre til længere perioder hvor kulturer ikke er blevet udruget og rystet, skødesløse udlevering og serielle fortyndinger kan medføre unøjagtige plade tæller. I forhold til den spredning plade metode plade skal tælles, hvori 100 μL af hver fortynding er spredt over en hel agar plade, den drop plate beskrevne metode er langt mere hurtig, kræver et langt mindre antal agar plader, og giver mulighed for hurtigere optælling, som maksimalt tællelig antallet af kolonier for hver dråbe er 30, mens op til 300 kolonier kan typisk tælles fra en spredning plade. Men spredningen plade metode er også en mulighed hvis efterforskere er mere komfortabel med denne teknik. Hvis dråber spredt sig til hinanden efter påfyldes en multikanalpipette, kan individuel anvendelse af mere bredt fordelte dråber med en enkelt kanal pipette udføres i stedet. Vores erfaring syntes køling plader ved 4 ° C forud for udlevering dråber at reducere overdreven spredning.
En begrænsning af de teknikker, der er beskrevet her er at resultaterne af de to typer af synergy assay (skakternet array og tid-kill) er ikke altid overensstemmende, og da mest udgivne synergi artikler bruger én metode eller den anden stedet for begge sammen, det kan være svært at vide, hvordan man kan integrere data fra de to typer af assays. Fordi den automatiserede Skaktern array metode vi udviklede er enkel og høj overførselshastighed, vi har brugt det i realiteten som en slags skærm til at teste kombinationer mod et større antal isolater og at afgøre, hvilken koncentration kombinationer var synergistisk. Vi udførte derefter et mindre antal tid-kill undersøgelser, udvælgelse af kombinationer og koncentrationer, der havde været effektiv i matrixen skakternet. Af note, fordi skakternet assay er typisk udført på en microbroth fortynding skala, mens den tid-kill assay bruger større mængder (svarende til en macrobroth fortynding), fandt vi at FICs var undertiden forskellige mellem de to metoder, med højere koncentrationer i almindelighed kræves i tid-kill analysen at vise aktivitet. Dette fænomen er blevet bemærket tidligere, når macrobroth og microbroth fortynding MIC assay resultater sammenlignes for Gram-negative baciller26 og Hvornår større inocula (som bruges i tid-kill undersøgelser) sammenlignes med den standard inokulum anvendes i microbroth fortynding og skakternet array-undersøgelser,32. En specifik begrænsning af matrixen skakternet er den iboende variabilitet i microbroth fortynding MIC test22. Mens FICjeg cutoffs for synergy konto for denne variation matematisk6 sådanne variabilitet uundgåeligt giver anledning til bekymring om pålideligheden og konsistens af skakternet array resultater.
På grund af begrænsningerne for alle in vitro-synergy test metoder (herunder dyrkning af bakterier i en kunstig vækstmediet, statisk antibiotikaet koncentrationer og en begrænset tidsforløb), resultaterne af disse metoder skal bekræftes og yderligere vurderes ved hjælp af supplerende teknikker. Disse metoder omfatter in vitro-farmakokinetiske/farmakodynamiske (PK/PD) undersøgelser (fx den hule fibre infektion model40), dyremodeller, og i sidste ende, menneskelige PK/PD og effekt studier. Den automatiserede Skaktern array metode beskrevet her, ved at give en hurtig metode med som til skærm kombinationer for potentielle synergistisk aktivitet, giver mulighed for mere målrettet udnyttelse af disse teknikker. Yderligere automatisering af alle disse metoder, som godt som mere systematisk undersøgelse af forholdet mellem in vitro-parametre og kliniske resultater, vil være vigtigt i skalering op brugen af synergi test og øge dens kliniske anvendelighed.

Spredningen af multiresistente (MDR) bakterielle patogener, især MDR Gram-negative bakterier såsom carbapenem-resistente Enterobacteriaceae (CRE), har forladt klinikere med stadig mere begrænsede muligheder for vellykket antiinfektiøs terapi 1, et problem, der forværres af den træge tempo af nye antibakterielle drug discovery2,3. Antimikrobiel synergi, hvor to lægemidler, der anvendes i kombination udøve en større-end-additiv effekt, giver mulighed for at redde eksisterende antibiotika til brug i behandling af MDR bakterier, selv når disse bakterier er resistente over for den ene eller begge af de antibiotika individuelt. De teknikker, der er beskrevet i denne hvidbog giver to komplementære metoder til in vitro-synergy test, når de bruges sammen, tillade efterforskere at effektivt skærmen antimikrobiel kombinationer af interesse for dokumentation af synergistisk aktivitet (den automatiserede skakternet array metode) og derefter yderligere evaluere kinetik af hæmning og drab demonstreret af lovende kombinationer identificeres i screening etape (den manuelle tid-kill metode).
En af de mest almindeligt anvendte metoder til in vitro-synergy test er skakternet array assay, en ændring af mindste hæmmende koncentration (MIC) test, hvor de hæmmende aktivitet af to forskellige antibiotika mod en bakteriel isolere er testet over en række koncentration kombinationer4,5. Hvis de to stoffer udøve større end additiv aktivitet når de bruges sammen, kombinationen er betragtes som synergistiske6. Opsætning af et skakternet array manuelt indebærer imidlertid en række beregninger og fortynde og pipettering trin, der er besværlige og sårbare over for menneskelige fejl. Disse begrænsninger har haft virkningen at begrænse brugen af synergi test primært til retrospektiv evaluering af et lille antal antibiotika kombinationer og bakteriel isolater, og resultaterne har ikke altid været konsekvent blandt undersøgelser7, 8,9,10,11. Derudover har kompleksiteten af synergy test bidraget til dens utilgængelighed i klinisk Mikrobiologi laboratorium og virtuelle fraværet af in vitro-synergy test data fra kliniske studier af kombination terapi12, 13.
For at øge effektiviteten og gennemløb af metoden skakternet array, gjorde vi brug af en automatiseret MIC test teknik tidligere udviklet i vores laboratorium, der benytter inkjet print teknologi til netop og konsekvent fritage små mængder af antibiotika stamopløsning i brønd i et mikrotiter plade14. Platformen overflødiggør behovet for komplekse beregninger og flere pipettering trin. Det tilknyttede programmel beregner og dispenserer passende mængder af antibiotika for at oprette en todimensional skakternet array, hvis brugeren simpelthen indlæser rækken ønskede koncentration og Stamopløsningens koncentration af antibiotika. Vi i første omgang testet denne metode mod en samling af CRE isolater15 og efterfølgende har fokuseret på test colistin-holdige kombinationer for aktivitet mod colistin-resistente isolater16. Colistin er et lægemiddel af sidste udvej generelt reserveret til brug i behandling af MDR Gram-negative patogener17,18, og colistin modstand gør allerede MDR bakterier næsten pan-resistente19, hvilket gør dem ideelle kandidater til udviklingen af nye terapeutiske strategier ved hjælp af narkotika som de er ufølsomme individuelt. Vi fandt, at kombinationen af colistin og protein syntese hæmmer antibiotika minocycline havde et meget højt sats af synergi, selv mod stammer, der var resistente over for hvert af disse stoffer enkeltvis, formentlig fordi colistin udøver en subinhibitory permeabilizing effekt på selv colistin-resistente bakterier. Vi har valgt denne kombination skal bruges som et eksempel i dette papir. Af note, synergi test kan også bruges til at evaluere for øget effekten af to lægemidler, som er både effektiv individuelt.
Metoden automatiseret skakternet array letter hurtig, høj overførselshastighed synergi test. Skakternet array metode har imidlertid begrænsninger. Som en modificeret MIC assay, det giver data kun på hæmning af bakteriel vækst og ikke på drab, og det giver ikke data om antibiotikaresistens virkninger over tid. Derimod manuel udførelsen af tid-kill synergi assays er mere arbejdskraftintensive men indeholder oplysninger om både hæmning og drab over en 24 h tid kursus20,21. Vi brugte tid-kill analyse på et mindre antal isolater bekræfte vores skakternet array resultater og at afgøre, om de synergistiske kombinationer vi identificeret var også bakteriedræbende.
Begge skakternet array og tid-kill synergi metoder give værdifulde oplysninger om aktiviteten af stoffet kombinationer, og er især nyttig ved vurdering potentielle nye terapeutiske muligheder for meget resistente bakterielle patogener. Metoderne, der også har iboende begrænsninger. Standard microbroth fortynding MIC metode har en kendt forventede fejl række 1 tofolds22, der øges, når to stoffer testes sammen i et skakternet array. Standarddefinition af synergi, som finder en synergistisk kombination kun hvis stofferne er aktive sammen på en fjerdedel deres respektive mikrofoner6, tager hensyn til dette forventes variabilitet, men sådanne variabilitet, (som menes at medføre fra en kombination af biologiske og tekniske udsving23) uundgåeligt genererer usikkert om synergy resultaternes pålidelighed. Manglen på etablerede kvalitetskontrol standarder for synergy test er også en strømbegrænsning. Måske er den vigtigste begrænsning af alle synergi testmetoder manglen på etablerede korrelationer mellem in vitro-resultater og kliniske resultater når kombinationer der bruges til at behandle patienter24. Enklere og hurtigere synergi testmetoder, som den automatiserede Skaktern array metode beskrevet her, kan lette integrationen af in vitro-synergy test inden for kliniske forsøg eller andre evalueringer af patient resultater for bedre at kunne karakterisere forholdet mellem in vitro- og in vivo effekter i fremtiden.
Metoden automatiseret skakternet array, der præsenterer vi her giver mulighed for høj overførselshastighed screening af en række forskellige kombinationer og giver mulighed for hurtig evaluering af usædvanlige, "høj risiko-høj belønning" kombinationer uden en større investering af tid og ressourcer. Den tid-kill metode, som vi efterfølgende vise, kan give ekstra støttende oplysninger om kombinationen synergistisk aktivitet og kan hjælpe til at karakterisere sin bakteriedræbende aktivitet og antibakterielle kinetik.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain ATCC 25922</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>25922</td>
			<td>QC strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L 0.22 &#181;m bottle-top filter</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>597-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R01620 or R04050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2011-25150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-566-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>222-8032-01R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation adjusted Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control Software</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DensiCHEK Plus McFarland reader</td>
			<td>bioM&#233;rieux</td>
			<td>21250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long SHARP 10 &#181;L Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 digital dispenser</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 T8+ cassettes</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td>30097370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minocycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>14302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12-channel 10-300 &#181;L pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP-337</td>
			<td>Brand name: Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xplorer 12-channel 50-1200 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000328</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method

Som satser for multidrug-resistente (MDR) patogener fortsætter med at stige, overgår udviklingen af nye antimikrobielle stoffer, grad nye strategier til behandlingen af MDR bakterier i stigende en nødvendighed. En sådan tilgang er kombinationsbehandling, i hvilke to eller flere antibiotika bruges sammen til at behandle en infektion imod hvilke en eller begge af narkotika kan være ineffektive alene. Når to stoffer sammen, lægge en større end additiv effekt, de betragtes synergistisk. In vitro undersøgelse af synergistisk aktivitet er et vigtigt første skridt i evaluering muligt effektiviteten af narkotika kombinationer. To vigtigste in vitro-synergy test metoder er blevet udviklet: matrixen skakternet og tiden-kill undersøgelse. I dette papir, præsenterer vi en automatiseret skakternet array metode, der gør brug af inkjet print teknologi til at øge effektiviteten og nøjagtigheden af denne teknik, såvel som en standard manuel tid-kill synergi metode. Automatiseret skakternet array kan tjene som en høj overførselshastighed screening assay, mens manuel tid-kill undersøgelsen giver yderligere, supplerende data på synergistisk aktivitet og drab.
Skakternet array er en ændring af standard mindste hæmmende koncentration (MIC) test, hvor bakterier er inkuberes med antibiotika på forskellige koncentration kombinationer og evalueret for væksthæmning efter natten inkubation. Manuel ydeevne af matrixen skakternet kræver en møjsommelig og fejlbehæftet serier af beregninger og fortyndinger. I den automatiserede metode præsenteres her, beregning og udlevering af nødvendige antibiotika stamopløsning diskenheder er automatiseret ved hjælp af inkjet printer teknologi. I gang-kill synergi assay, er bakterier inkuberes med antibiotika af interesse, både sammen og hver for sig, og stikprøven med intervaller i løbet af 24 timer for kvantitative kultur. Resultaterne kan afgøre, hvorvidt en kombination er synergistiske og om det er bakteriedræbende og levere data om hæmning og drab af bakterier over tid.

Figur 1A præsenterer et gitter fra et skakternet array synergi eksperiment i hvilke minocycline i koncentrationer på 0-32 μg/mL blev kombineret med colistin i koncentrationer på 0-16 μg/mL og testet mod E. coli stamme FDA-CDC 0494. Værdierne repræsenterer spektrofotometriske målinger ved ekstinktionen 600 nm (OD600). Brønde med OD600 værdier under 0,07 (hvilket svarer til ingen vækst ved visuel inspektion) er skyggefulde rød, mens brønde med OD600 værdier 0,07 (hvilket svarer til vækst ved visuel inspektion) er nedtonede grøn. For hvert stof er den mindste hæmmende koncentration (MIC; fed) den laveste koncentration af stof, der hæmmer bakterievækst. For minocycline, dette er 32 μg/mL og colistin, det er 8 μg/mL. Skraveringen er bevaret i figur 1B, men værdier i brøndene vækst hæmmes erstattes af fraktioneret hæmmende koncentration (FICjeg) indeksværdier. Disse er fastsat som følger: i hver brønd, fraktioneret hæmmende koncentration indekset (FIC) for hvert stof beregnes ved at dividere koncentrationen af antibiotika i godt med det stof MIC og FICjeg beregnes ved at addere de to FICs. Brønde med en FICjeg værdi på 0,5, der betragtes som cutoff for synergi, er angivet med en brudt stregramme, og godt med den laveste FICjeg værdi (0.094) er med fed. Fordi den mindste FICjeg værdi er i rækken synergistiske, kombinationen er betragtes som synergistisk.
Figur 2A og figur 2B viser gitre svarer til dem i figur 1A og figur 1B, men i dette tilfælde kombinationen ikke godtgør synergy mod isolatet testet (K. pneumoniae isolat BIDMC 4), fordi den minimum FICjeg hvor vækst hæmmes er 1, som er > 0,5.
Figur 3 illustrerer absorbansaflæsningerne af et skakternet synergi gitter, hvor flere springes wells opstod (Enterobacter cloacae komplekse isolat BIDMC 27). Springes brønde er brønde som bakteriel vækst hæmmes trods tilstedeværelsen af bakterievækst i tilstødende brønde med højere koncentrationer af antibiotikum. Dette fænomen, der vides at forekomme i standard MIC test så godt, er sandsynligvis på grund af biologiske variation i bakteriel vækst egenskaber fra godt til godt og følsomheden af nogle antibiotika til små forskelle i bakteriel inokulum23 , 31 , 32. Hvis mere end én springes over godt skete i et skakternet array, vi kasseret resultaterne og gentages analysen.
Figur 4 præsenterer eksempler på tid-kill synergi resultaterne af tre kombinationer testet mod K. pneumoniae isolere BIDMC 32. Koloni tæller er angivet i en logaritmisk skala på y-aksen og tid i timer, på x-aksen. Forskellen mellem den begyndende inokulum i røret som indeholder kombinationen narkotika og koncentrationen af bakterier i at røret på 24 h er illustreret ved den røde bar og nummer, mens forskellen mellem koncentrationen af bakterier på 24 h mellem røret indeholdende kombinationen og det rør, der indeholder de mest aktive enkelt agent alene er illustreret ved den blå bjælke og antallet. Figur 4A viser resultater fra en kombination af colistin og minocycline; Denne kombination var synergistiske (forskellen mellem koncentrationer af bakterier eksponeres kombination og mest aktive agent alene ≥2 log10 CFU/mL på 24 h) og bakteriedræbende (tilbagegang fra start inokulum koncentration på 24 h ≥3 log10 CFU/mL). Figur 4B viser resultater fra en kombination af colistin og clindamycin, en kombination, der var synergistiske men var ikke bakteriedræbende. Denne kombination hæmmet vækst af bakterier, som hverken stof gjorde alene, men ikke dræbe dem. Figur 4 c viser resultater fra en kombination af colistin og erythromycin, der var hverken bakteriedræbende eller synergistiske.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg"> Figur 1: Skakternet array resulterer demonstrerer synergi (minocycline + colistin testet mod E. coli stamme FDA-CDC 0494). (A) spektrofotometriske udlæsning og vækst fortolkning af et skakternet array. Værdier i celler er absorbansaflæsningerne på 600 nm (OD600). Celler med OD600 værdier under 0,07 (svarende til ingen vækst ved visuel inspektion) er skyggefuld rød, mens celler med OD600 værdier 0,07 (svarende til vækst ved visuel inspektion) er nedtonede grøn. (B) fraktioneret hæmmende koncentration indeks (FICjeg) beregning. Skygge med angivelse af vækst eller ingen vækst er blevet bibeholdt. Værdier for colistin og minocycline langs x- og y-akser, henholdsvis nu repræsentere fraktioneret hæmmende koncentration (FIC) eller forholdet mellem koncentrationen af stoffet i den pågældende kolonne eller række til den mindste hæmmende koncentration ( MIC) af dette stof alene. Værdien i hver celle er FICjeg, eller summen af to FICs narkotika i så godt. Den store brudte linje-omkranset boks omslutter brønde med en FICjeg på 0,5. Den tykke-omkranset celle angiver godt med den laveste FICjeg vækst hæmmes, eller den mindste FICjeg. Fordi den mindste FICjeg er 0,5, kombinationen er betragtes som synergistisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg"> Figur 2: Skakternet array resultaterne af en kombination, der ikke viser synergi (minocycline + colistin testet mod K. pneumoniae isolere BIDMC 4). (A) optisk tæthedsværdier på 600 nm og vækst fortolkning af skakternet array resultater som beskrevet i figur 1A. (B) fraktioneret hæmmende koncentration indeks (FICjeg) beregning som beskrevet i figur 1A. Fordi den mindste FICjeg er > 0,5, kombinationen er ikke betragtes som synergistisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg"> Figur 3: Skakternet array resultater, der er uninterpretable grund sprunget wells (minocycline + colistin testet mod Enterobacter cloacae komplekse isolere BIDMC 27). Optisk tæthedsværdier på 600 nm og vækst fortolkning af skakternet array resultater som beskrevet i figur 1A. Flere springes brønde, hvor bakteriel vækst hæmmes trods tilstedeværelsen af vækst i tilstødende brønde med højere koncentrationer af antibiotikum, er påvist. Resultaterne er ikke fortolkelige og eksperimentere skal gentages. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg"> Figur 4: Tid-kill synergi resultaterne af tre kombinationer testet mod K. pneumoniae isoleres BIDMC 32. Koloni tæller er angivet i en logaritmisk skala på y-aksen og tid i timer, på x-aksen. Forskellen mellem koncentrationen af bakterier i kombination på 24 h og den begyndende inokulum i røret er illustreret ved den røde bar og antal. Hvis tilbagegang fra start inokulum koncentration på 24 h er ≥3 log10 CFU/mL, anses kombinationen bakteriedræbende. Forskellen mellem koncentrationen af bakterier på 24 h mellem rør indeholdende kombinationen og det rør, der indeholder de mest aktive enkelt agent alene er illustreret ved den blå bjælke og antallet; Hvis der er ≥2 log10 reduktion af CFU/mL, anses kombinationen synergistisk. (A) Colistin (CST) + minocycline (MIN), en kombination, der er både synergistiske og bakteriedræbende. (B) Colistin + clindamycin (CLI), en kombination der er synergistisk men ikke bakteriedræbende. (C) Colistin + erythromycin (ERY), en kombination, der er hverken synergistisk eller bakteriedræbende. Disse resultater blev oprindeligt udgivet som en del af en undersøgelse af colistin-holdige synergistisk aktivitet kombinationer mod colistin-resistente enterobakterier, hvor vi viste at colistin var synergistisk med en række antibiotika, der er aktive individuelt kun (f.eks clindamycin) eller primært (fx erythromycin) mod Gram-positive bakterier16. (Bemærk at erythromycin var synergistiske af skakternet array mod den stamme, der er vist, men ikke af tid-dræbe, så det er blevet valgt her som et eksempel på en ikke-synergistisk kombination.) Vi en hypotese som colistin, som er kendt for at handle ved permeabilization af Gram-negative ydre membran, udøver en sub-hæmmende permeabilizing effekt på colistin-resistente Gram-negative bakterier, at tillade indrejse af stoffer som clindamycin, normalt ikke kan angive cellen Gram-negative. Panelet (A) i denne figur er blevet ændret fra Brennan-Krohn, Pironti og Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, antimikrobielle stoffer og kemoterapi, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

Antimikrobiel synergi test bruges til at vurdere effekten af to eller flere antibiotika, der anvendes i kombination og udføres typisk af en af to metoder: skakternet array eller tid-kill assay. Her præsenterer vi en automatiseret, inkjet printer-assisteret skakternet array synergi teknik og en klassisk tid-kill synergi undersøgelse.

Antimikrobiel synergi test af Inkjet Printer-assisteret automatiseret skakternet Array og metoden manuel tid-kill

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Manuel checkerboard array synergi test er en arbejdskrævende og fejlbehæftet metode. I modsætning hertil forbedrer vores automatiserede inkjetprinterbaserede skakternets metode dramatisk hastighed, nøjagtighed og overførselshastighed. Den automatiserede skakternet metode gør det muligt at screene et stort antal lægemidler til synergistiske kombinationer, mens time-kill metode kan bekræfte og yderligere udforske aktiviteten af disse kombinationer.Ny antibiotika opdagelse er ikke at holde trit med udbredelsen af resistens, men undersøgelsen af synergistiske kombinationer giver mulighed for at redde eksisterende lægemidler til behandling af resistente bakterier. Selv om vi demonstrere denne teknik med antibakterielle lægemidler, Det kunne også bruges med andre klasser af antimikrobielle stoffer eller endda for forskellige typer af kombination narkotika eller sammensatte test. I denne video demonstrerer vi en automatiseret skakternet array metode og en manuel time-kill metode.Vi foreslår at udføre skakternet array undersøgelser først at identificere lovende kombinationer, derefter undersøge disse yderligere med time-kill undersøgelser. Til at begynde, gøre antimikrobielle lager opløsninger af colistin og minocyclin, og derefter udføre kvalitetskontrol på bestanden løsninger som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Dernæst tilsættes omkring en milliliter 0,9% natriumchlorid, saltvand, til 12-millimeter-by-75-millimeter runde bund glaskulturrør.Vælg en eller to kolonier fra en natten plade af bakterier, og læg dem i kulturrør. Vortex rørene forsigtigt at suspendere bakterier i opløsningen. Tjek koncentrationen af bakterier ved hjælp af en McFarland læser.Juster koncentrationen ved at tilføje mere saltvand eller flere bakterier for at opnå en 0,5 McFarland turbiditet læsning. Derefter fortyndes bakterierne en til 300 ved at tilsætte 100 mikroliter af suspensionen til 30 milliliter kationjusteret Mueller-Hinton bouillon i et 50-milliliter konisk rør for at nå en endelig celletæthed på fem gange 10 til den femte kolonidannende enheder pr. milliliter. Nu forberede antimikrobielle stoffer til udskrivning ved at følge med i den medfølgende tekstprotokol.Gem protokollen, og klik derefter på knappen Kør øverst til venstre efterfulgt af knappen Start. Læg en 384-brøndplade i pladeholderen, og tryk på Loaded under load plate 1 Synergy-prompten. Placer derefter en T8+kassette i kassettestikket, og tryk på Indlæs under prompten Indlæs en T8+kassette.Når du bliver bedt om det, tilsættes antibiotisk lageropløsning til de angivne reservoirer på kassetten. Når hver løsning er tilføjet, skal du trykke på knappen Udfyldt. Når D300 Dispenser har tilføjet antibiotika lager i passende mængder til hver brønd og Kør Afsluttet boksen vises, skal du klikke på Luk, fjerne pladen, og slukke for D300.Dernæst hældes den tidligere forberedte bakteriel suspension i en steril reagens reservoir. Brug en multikanalpipette til at tilføje 50 mikroliter af suspensionen til alle brønde i skakternet array. Derefter tilsættes 50 mikroliter af kation-justeret Mueller-Hinton bouillon uden bakterier til en tom brønd.Dette vil være den negative kontrol godt at bekræfte sterilitet af medierne. Inkubere i en 35-graders Celsius omgivende luft inkubator i 16 til 20 timer. Hvis du vil analysere testen, skal du følge med i den medfølgende tekstprotokol.Til time-kill-synergitesten skal du igen forberede de antimikrobielle lageropløsninger som beskrevet i tekstprotokollen. Derefter foretage en 0,5 McFarland suspension af testorganismen i sterilt saltvand. Tilføj 100 mikroliter af 0,5 McFarland suspension til fem milliliter CAMHB i en 25-by-150-millimeter glas rund bund kultur rør med rustfrit stål lukning, og vortex forsigtigt at blande.Ved hjælp af en steril inokulerende løkke, isolation streak en dråbe af den fortyndede suspension på en blod agar plade, og inkubere pladen ved 35 grader Celsius i luften for at bekræfte inokulum renhed. Udskift lukningen på røret, og inkuber den i et reagensglasstativ på en ryster ved 35 grader Celsius i luften i mindst 3 timer, indtil væksten i logaritmisk fase er nået. Mens den oprindelige kultur er inkubering, tilføje 10 milliliter kation-justeret Mueller-Hinton bouillon til fem autoklaveret glas kultur rør.For en time-kill synergi undersøgelse, mindst ét lægemiddel bør være i en koncentration, der ikke påvirker vækstkurven individuelt. Dette kan bestemmes ved at evaluere virkningerne af de enkelte lægemiddelkoncentrationer forud for synergiundersøgelsen. Til det første rør tilsættes 10 mikroliter af en milligram-per-milliliter colistin lager for at opnå en endelig colistin koncentration på et mikrogram pr. milliliter, da dette er en koncentration, der er ineffektiv mod den stamme, der anvendes i dette eksempel.For det andet rør tilsættes 10 mikroliter af en milligram-per-milliliter minocyclin lager for at opnå en endelig koncentration på et mikrogram pr. milliliter. Denne koncentration er også ineffektiv mod den stamme, der anvendes i dette eksempel. Til det tredje rør, tilsættes 10 mikroliter af en-milligram-per-milliliter minocyclin lager og 10 mikroliter af en milligram-per-milliliter colistin lager.Dette er den samme mængde colistin og minocyclin, der anvendes i rør et og to. I den fjerde og femte rør, tilføje ingen antibiotika. Dette vil være vækstkontrol og de negative kontrolrør, henholdsvis.Dernæst forberede 96 dybblyn polypropylen plader med to-milliliter brønde til serielle fortyndinger ved at tilføje 900 mikroliter af sterilt saltvand til række B gennem H af kolonner en til fire med en multikanal pipette. Når kulturen er i logaritmisk vækstfase, skal du fjerne kulturrøret fra shakeren og vortex det forsigtigt. Overfør en milliliter af suspensionen til et 12 gange 75-millimeter glaskulturrør, og kontroller tætheden med en McFarland-læser.Hvis tætheden er mindre end 1,0 McFarland, returnere røret til shaker og inkubere længere. Hvis det er større end 1,0 McFarland, tilsæt kation-justeret Mueller-Hinton bouillon til røret, vortex forsigtigt, og re-prøve, indtil suspensionen er på 1,0 McFarland. Det er vigtigt, at kulturen er i den logaritmiske vækstfase, når du forbereder startinoculum.Du kan konstruere en vækstkurve for at bestemme, hvornår en organisme når denne fase. Derefter tilsættes 100 mikroliter af 1,0 McFarland suspension til rør en gennem fire, og vortex dem forsigtigt. Umiddelbart efter blanding og på en, to, fire, seks og 24 timer, fjerne en 150-mikroliter aliquot fra hver kultur rør ved at vippe røret, således at kun den sterile pipette spids ind i røret og ikke unsterile pipettor akslen under aliquot tilbagetrækning.Tilføj aliquots, henholdsvis til hinanden følgende brønde i den første række af de tidligere forberedte 96 dyb-godt plade. Returneringsrør til et reagensglasstativ på en shaker i en 35-graders Celsius-indskubator umiddelbart efter fjernelse af aliquots på hvert tidspunkt. Ved hjælp af en multikanalpipette fjernes 100 mikroliter fra række A af pladen, og den føjes til række B, der indeholder 900 mikroliter saltvand, hvilket skaber en en-til-10 fortynding.Pipette opløsningen op og ned fire til fem gange for at blande, og derefter kassere spidserne. Først skal du mærke Mueller-Hinton agar plader med antibiotika betingelser og fortynding, der skal belagt. Derefter plade de fortyndede prøver til koloni tæller ved hjælp af drop plade metode, ved hjælp af en multichannel pipette med ekstra lange spidser.Fjern 10 mikroliter fra hver brønd i kolonne et, og dispenser forsigtigt i træk på den passende mærket plade. Fortsæt, indtil alle rækkerne er dispenseret på pladerne. Desuden anbringes et 10-mikroliterfald på 24 timer taget direkte fra det negative kontrolrør på det sted, der er dedikeret til dette, for at teste for sterilitet.Derefter vende alle plader, og inkubere dem natten over ved 35 grader Celsius i den omgivende luft. Derefter skal du tælle antallet af kolonier på hvert område og beregne celletætheden. Marker kolonier med en permanent markør med fin spids på bagsiden af pladen for at undgå dobbelttælling eller manglende kolonier.For hver fortyndingsserie identificeres dråber med tre til 30 kolonier. Tælle kolonierne i disse dråber, og registrere tælle sammen med fortynding faktor. Vist her er et gitter fra et skakternet array synergi eksperiment, hvor minocyclin i koncentrationer på nul til 32 mikrogram pr. milliliter blev kombineret med colistin ved koncentrationer på nul til 16 mikrogram pr. milliliter og testet mod en stamme af E.coli.Brønde med OD600-værdier under 07 repræsenterer ingen vækst og er skraverede røde, mens brønde med OD600-værdier over eller lig med 07 repræsenterer vækst og er grønne. For hvert lægemiddel, den mindste hæmmende koncentration er den laveste koncentration af narkotika, der hæmmer bakterievækst. For minocyklin er dette 32 mikrogram pr. milliliter, og for colistin er det otte mikrogram pr. milliliter.Skyggerne bevares her, men værdierne i de brønde, hvor væksten hæmmes, erstattes af fraktioneret hæmmende koncentration eller FIC-indeksværdier. I hvert brønd beregnes FIC-indekset for hvert lægemiddel ved at dividere koncentrationen af antibiotika i så godt med lægemidlets minimale hæmmende koncentration. Brønde med et FIC-indeks på mindre end eller lig med 0,5, hvilket anses for at være en skæringsrunde for synergi, er angivet med en brudt grænse, og brønden med det laveste FIC-indeks er fed.Da den mindste FIC-værdi ligger i det synergistiske område, betragtes kombinationen som synergistisk. Et eksempel på en sag, der ikke viser synergi, vises her, da det mindste FIC-indeks, hvor væksten hæmmes, er et, der er større end 0,5. Endelig, i dette eksempel, flere sprunget brønde opstod, som repræsenterer bakterievækst, der er hæmmet, på trods af tilstedeværelsen af bakterievækst i tilstødende brønde med højere koncentrationer af antibiotika.Hvis mere end én sprunget godt opstod i en skakternet array, bør resultaterne kasseres og analysen gentages. Et eksempel på en graf, der viser resultaterne af en tid-kill synergi analyse præsenteres her. Se den medfølgende tekstprotokol for nærmere oplysninger om fortolkningen af tidsdrabssynergianalysen.Yderligere oplysninger om synergistiske kombinationers aktivitet kan opnås gennem evalueringer af farmakokinetik og farmakodynamik og gennem in vivo-undersøgelser med dyremodeller. Følg altid passende sikkerhedsprocedurer, herunder brug af personlige værnemidler, når du arbejder med bakterier. Hvis du genererer aerosoler eller bruger højrisikopatogener, skal du udføre alt arbejde i et biosikkerhedsskab.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En-dags Workflow ordningen for bakteriepatogen Detection og antimikrobiel resistens fra blodkulturer

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Vurdering Nedsat metaboliske ændringer Under Progressive Kolonisering af Kim-fri mus ved 1 H-NMR-spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay til Typing af stafylokokker Cassette Kromosom Mec Typer I til V i Methicillin-resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse af epitelbeskadigelse Produceret af<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Højt gennemløb, realtid, Dual-udlæsning Test af Intracellulær antimikrobielle aktivitet og eukaryote celle cytotoksicitet

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

Det<em&gt; Ex vivo</em&gt; Colon Organ Kultur og dens anvendelse i Antimikrobiel Host Defense Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolation, karakterisering og rensning af makrofager fra væv ramt af fedme-relaterede Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Trykte Glycan matrix: En følsom teknik til analyse af Repertoire af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer i små dyr

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiseret adfærdsmæssige analyse af store C. elegans befolkninger ved hjælp af et bredt synsfelt sporer Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...