Name: antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00
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Thea Brennan-Krohn wurde unterstützt durch eine Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development pädiatrische Infektionskrankheiten Forschung Ausbildung Grant (T32HD055148), National Institute of Allergy und Ausbildung Zuschuss (Infectious Diseases T32AI007061), ein Boston Children Hospital Office der Fakultät Fakultät Karriereentwicklung Gemeinschaft und den National Institute of Allergy and Infectious Diseases Career Development Award (1K08AI132716). J.E.K. wurde durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases von den National Institutes of Health unter Prämiennummer R33 AI119114 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae:+Biology,+epidemiology,+and+management.">Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).</li><li>Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+antibiotics.">The future of antibiotics.</a> Critical Care. 18 (3), (2014).</li><li>Spellberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemic+of+antibiotic-resistant+infections:+a+call+to+action+for+the+medical+community+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).</li><li>Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+antibiotic+synergy+for+polymyxin+B-resistant+carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).</li><li>Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+dual+carbapenem+combinations+against+carbapenemase-producing+Enterobacteriaceae.">In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).</li><li>Zusman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+of+in+vitro+synergy+of+polymyxins+and+carbapenems.">Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).</li><li>Clock, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+doripenem+alone+and+in+multi-agent+combinations+against+extensively+drug-resistant+Acinetobacter+baumannii+and+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).</li><li>Hirsch, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antimicrobial+combinations+for+Klebsiella+pneumoniae+carbapenemase-producing+K.+pneumoniae.">Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).</li><li>T&#228;ngd&#233;n, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+double-+and+triple-antibiotic+combinations+for+VIM-+and+NDM-producing+klebsiella+pneumoniae+by+in+vitro+time-kill+experiments.">Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).</li><li>Tascini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activity+of+colistin+plus+rifampin+against+colistin-resistant+kpc-producing+klebsiella+pneumoniae.">Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).</li><li>Paul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+carbapenem-resistant+Gram-negative+bacteria.">Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).</li><li>Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+for+treating+carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae.">Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verification+of+an+automated,+digital+dispensing+platform+for+at-will+broth+microdilution-based+antimicrobial+susceptibility+testing.">Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).</li><li>Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+Synergistic+Activity+of+Antimicrobial+Combinations+Against+Carbapenem-Resistant+Enterobacteriaceae+Using+Inkjet+Printer-Based+Technology.">Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology.</a> J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).</li><li>Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Activity+of+Colistin-Containing+Combinations+against+Colistin-Resistant+Enterobacteriaceae.">Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin:+The+Revival+of+Polymyxins+for+the+Management+of+Multidrug-Resistant+Gram-Negative+Bacterial+Infections.">Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).</li><li>Nation, R. L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+in+the+21st+century.">Colistin in the 21st century.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).</li><li>Ah, Y. -. M., Kim, A. -. J., Lee, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+resistance+in+Klebsiella+pneumoniae.">Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).</li><li>Bratu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae+in+Brooklyn,+NY:+Molecular+epidemiology+and+in+vitro+activity+of+polymyxin+B+and+other+agents.">Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).</li><li>Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+plus+imipenem,+meropenem,+or+tigecycline+against+KPC-2-producing+Enterobacteriaceae+with+high+MICs+for+these+antimicrobials.">In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).</li><li>MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+methodology+and+implementation+of+a+semiautomated+serial+dilution+microtechnique+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing.</a> Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).</li><li>Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poisoned+well:+Enhancing+the+predictive+value+of+antimicrobial+susceptibility+testing+in+the+era+of+multidrug+resistance.">The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , (2018).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , (2018).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), 7 (1999).</li><li>Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+drop+plate+technique+for+bacterial+enumeration+by+parametric+and+nonparametric+tests.">Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests.</a> Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+6x6+drop+plate+method+for+simultaneous+colony+counting+and+MPN+enumeration+of+Campylobacter+jejuni,+Listeria+monocytogenes,+and+Escherichia+coli.">A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli.</a> Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).</li><li>Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Inoculum+and+Activity+in+AmpC-+and+Extended-Spectrum+(ESBL)-Producing+Escherichia+coli+and+Klebsiella+pneumoniae+Clinical+Isolates+Tested+by+Using+NCCLS+ESBL+Methodology.">Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inoculum+Effect+in+the+Era+of+Multidrug+Resistance:+Minor+Differences+in+Inoculum+Have+Dramatic+Effect+on+Minimal+Inhibitory+Concentration+Determination.">The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+Testing:+Broth+Microdilution+Checkerboard+and+Broth+Macrodilution+Methods.">Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Kill+Assay+for+Determining+Synergy.">Time-Kill Assay for Determining Synergy.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Hindler, J. A., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+MIC+variability+by+method+for+contemporary+clinical+isolates+of+multidrug-resistant+gram-negative+bacilli.">Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).</li><li>Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+add+or+not+to+add+Polysorbate+80:+Impact+on+colistin+MICs+for+clinical+strains+of+Enterobacteriaceae+and+Pseudomonas+aeruginosa+and+quality+controls.">To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).</li><li>Fuchs, P. C., Barry, a. L., Brown, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+testing+quality+control+studies+with+fosfomycin+tromethamine.">Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine.</a> European journal of clinical microbiology &amp; infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+Bactericidal+Concentration+Testing.">Minimum Bactericidal Concentration Testing.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+in+combination+with+various+antibiotics+against+extensively+drug-resistant+Enterobacter+cloacae+with+decreased+susceptibility+to+polymyxin+B.">In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).</li><li>Bulman, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin+combinations+combat+Escherichia+coli+harboring+mcr-1+and+blaNDM-5:+Preparation+for+a+postantibiotic+Era.">Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era.</a> mBio. 8 (4), (2017).</li></ol>

Die D300 digitale Dispenser und zugehörigen Verbrauchsmaterialien wurden von Tecan (Morrisville, NC) zur Verfügung gestellt. Tecan hatte keine Rolle beim Studiendesign, Sammlung/Dateninterpretation, Manuskript Vorbereitung oder Entscheidung zu veröffentlichen.

Die beiden hier beschriebenen Methoden informieren sowohl über die Aktivität von Antibiotika in Kombination im Vergleich zu ihrer individuellen Tätigkeit verwendet. Die automatisierte, Inkjet-Drucker unterstützt digitale Abgabe Methode ist eine Adaption der Methode in der klinischen Mikrobiologie Verfahren Handbuch33beschrieben, während der Zeit-Kill-Methode genauer das entsprechende Protokoll aus dem gleichen folgt 34zu verweisen.
In der Schachbrett-Array-Methode Berechnungen zur Ermittlung das nötige Volumen von antimikrobiellen Material, das in jede Vertiefung hinzufügen sowie die Abgabe von diesen Bänden ist automatisiert, wodurch einige der wichtigsten potentiellen Quellen der Fehler in einem Handbuch schachbrettartige Anordnung. Noch wesentlicher ist jedoch, dass der Prüfer bestimmt, dass die ursprünglichen Bestände bei der geplanten Konzentration erfolgen und Ziel Endkonzentrationen in die D300-Software korrekt eingegeben werden. Hinzufügen die antimikrobielle Federung, Brunnen in einem 384-Well-Platte kann am Anfang schwierig sein und erfordert Sorgfalt um sicherzustellen, dass Pipette Tipps geben Sie die entsprechenden Vertiefungen und der Flüssigkeit nicht spritzen bis die Kanten der Brunnen. Ein automatisierte liquider Handler kann anstelle einer handgeführten Mehrkanal-Pipette verwendet werden, erhöhen die Geschwindigkeit und Genauigkeit mit dem Brunnen der Bakteriensuspension hinzugefügt wird. Wie im Protokoll beschrieben, erfordert die D300 die Zugabe von Tensiden, Polysorbat 20 (P-20), für die ordnungsgemäße Handhabung von Flüssigkeiten. Ein anderes Tensid, Polysorbat 80, bei einer Konzentration von 0,002 % verzeichnen, Colistin Mikrofone für Organismen mit Colistin Mikros von senken < 2 µg/mL im standard Brühe Microdilution Assays. 35 , 36 unser Labor zuvor gezeigt, dass P-20 in Konzentrationen bis zu 0,0015 % hatten keine Auswirkungen auf D300-gestützte MIC Ergebnisse im Vergleich zu verweisen BMD14. Im hier vorgestellten Assay-Beispiel ist die maximale P-20 Konzentration 0.0014 %.
Ein Problem begegneten wir mit einigen Schachbrett Array Assays wurde eine große Anzahl der übersprungenen Brunnen. Dies geschah zu einem überproportional mit bestimmten Antibiotika. Insbesondere in einem Bildschirm-Kombinationen mit einer Sammlung von Carbapenem-resistente Enterobacteriaceaefanden wir, dass während 49 521 Studien (9,4 %) waren unbrauchbar aufgrund mehrerer übersprungenen Brunnen, 2 der 12 Antibiotika getestet (Fosfomycin und Hemmhof) entfielen 46 dieser Studien (94 %). So erhöhte Preise möglicherweise eher in Drogen, die besonders anfällig für das Inokulum Effekt31,32,37. Der Hinweis empfiehlt CLSI testen Fosfomycin in Brühe Verdünnung25 aufgrund von Bedenken über die Zuverlässigkeit der Ergebnisse mit dieser Methode, was, die unzuverlässigen Ergebnissen gesehen mit diesem Medikament erklären könnte nicht. Einige Änderungen können automatisierte Schachbrett-Methode je nach Prüfer vorgenommen werden. Antibiotika können in Platten bereits mit Bakteriensuspension anstatt in leeren Brunnen, verzichtet werden, wenn dies aus Gründen der Workflow innerhalb des Labors vorzuziehen ist. Während 384-Well Platten hier verwendet wurden, kann die Methode auch in 96-Well-Platte-Assays mit entsprechender Modifikation auch Volumen erfolgen. Die Verwendung des Formats einer 96-Well-Platte kann in reduzierenden übersprungenen Brunnen für Antibiotika helfen, die besonders empfindlich auf kleine Änderungen im Inokulum. Bei der Berechnung der FICichmöglicherweise Situationen, wo das MIC off-Skala (d. h. höher als getestet), einschließlich Situationen wo das Medikament getestet wird keine Aktivität einzeln gegen den Typ des Organismus getestet hat. In diesen Fällen kann die FIC berechnet basierend auf vorausgesetzt, das Mikrofon ist eine Verdünnung höher als die höchste Konzentration getestet. Dies ist der am meisten konservative Strategie, da es die maximalen möglichen FIC-Wert für jede Verdünnung übernimmt wo Hemmung während der Synergie Tests beobachtet wird. Beispielsweise würden die tatsächlichen MIC stattdessen zwei Verdoppelung Verdünnungen oben getestet, die höchste Konzentration, dann die entsprechenden FICs zweifach niedriger als die konservative Zuordnungen, und So weiter wäre.
Um die bakterizide Aktivität von Drogen in einem Zeit-Kill-Assay einschätzen zu können, ist es unerlässlich, dass Kulturen Zunahme der logarithmischen Phase sein, besonders wenn aktive Zellwand Antibiotika getestet28sind. Für die schnell wachsenden Bakterien verwendet in diesem Beispiel (K. Pneumoniae), 3 Stunden Inkubation mit schütteln war angebracht, diese Wachstumsphase zu erreichen, aber unterschiedlich viel Zeit können für verschiedene Organismen notwendig sein. Im Allgemeinen sollte die Kultur sichtbar aber nicht stark trüb erscheinen. Die entsprechende Menge an Zeit kann bestimmt werden, durch den Bau einer Wachstumskurs mit Kolonie zählt bei seriellen Zeit Punkte (z. B. alle 30 min. für 4-6 h)38genommen. Wichtig ist auch die beabsichtigte Start Inokulum in der Zeit-Kill-Studie. Die Zielkonzentration des Inokulums Start ist ca. 5 x 105 bis 1 x 106 KBE/mL. Die hier beschriebenen Verdünnung (100 μl einer 1,0 McFarland Suspension in 10 mL Medien) erzeugt dieses Inokulum für Klebsiella Pneumoniae und andere Enterobacteriaceae -Arten, auf die wir es getestet haben. Wenn die Dichte der Ausgangspunkt Impfkulturen in einem Experiment mit verschiedenen Organismen deutlich höher oder niedriger ist, kann eine andere Verdünnung erforderlich sein. (Die entsprechende Verdünnung erforderlich für eine bestimmte Tierart kann bestimmt werden durch Ausführen einer Keimzahl von 0,5 oder 1,0 McFarland Aussetzung wie viele Organismen bestimmen diese Trübung dann die Berechnung mit dem ersten aufgehängt werden müssen stellt, verdünnt, um die entsprechende endgültige Konzentration zu erreichen.) Wenn zur Überprüfung der Platte zählt der Synergy-Studie, Start Inokulum eines Antibiotika-haltigen Röhren gefunden wird, deutlich niedriger als der Ausgangspunkt Inokulum der Wachstumskontrolle gewesen zu sein, dies deutet entweder Antibiotika Übertrag oder sehr schnelle Tötung von Bakterien in der kurzen Zeit zwischen von Bakterien gegen Antibiotika-haltigen Rohr hinzufügen und Entfernen von den Aliquoten für Beschichtung. Ist die tatsächliche Anzahl der Kolonien in der unverdünnten Tropfen in einer Reihe niedriger als die Anzahl der Kolonien in nachfolgenden Verdünnungen, schlägt dies Übertrag antibiotische Wirkung. Verschiedene Optionen sind zur Verhinderung dieser Effekt, einschließlich Verbreitung einer einzigen aliquoten über eine ganze Platte38 oder Spinnen auf die Probe, überstand entfernen und erneut Aussetzung in steriler Kochsalzlösung vor dem Plattieren39beschrieben worden. Jedem Zeitpunkt in der Zeit-Kill-Methode ist es auch entscheidend für die Ermittler effizient aber genau eine Aliquote aus jeder Kultur Schlauch entfernen und Verdünnungsreihen durchführen. Verzögerungen während dieses Prozesses, besonders während der frühen Zeitpunkten, die in enger Folge auftreten kann einen längeren Zeitraum, während dessen Kulturen nicht sind, inkubiert und erschüttert, Verzicht auf unvorsichtige und Verdünnungsreihen zu ungenau Platte führen können zählt. Im Vergleich zu der Platte Verteilungsmethode Platte zu zählen, in denen 100 μL jeder Verdünnung sich über eine gesamte Agarplatte erstreckt, die Drop-Platte-Methode beschrieben ist weit mehr Rapid erfordert eine viel kleinere Anzahl von Agarplatten und ermöglicht eine schnellere zählen, als die maximale zählbare Anzahl der Kolonien für jeden Tropfen ist 30, während bis zu 300 Kolonien in der Regel von einer Ausbreitung Platte gezählt werden kann. Die Verteilungsmethode Platte ist jedoch auch eine Option, wenn Ermittler mehr mit dieser Technik vertraut sind. Wenn Tropfen verteilt nach der Entnahme mit einer Mehrkanal-Pipette ineinander, kann individuelle Anwendung mehr weit auseinanderliegende Tropfen mit einer ein-Kanal-Pipette stattdessen durchgeführt werden. Nach unserer Erfahrung schien Kühlplatten bei 4 ° C vor der Abgabe Tropfen übermäßige Verbreitung zu verringern.
Eine Einschränkung der hier beschriebenen Techniken ist, dass die Ergebnisse der zwei Arten von Synergie-Assay (schachbrettartige Anordnung und Zeit-Kill) nicht immer übereinstimmende sind, und da die meisten veröffentlichten Synergie Artikel eine Methode oder die andere, anstatt beide zusammen verwenden, sie können schwierig sein zu wissen, wie man Daten aus den zwei Arten von Tests zu integrieren. Da die automatisierte Schachbrett-Array-Methode, die wir entwickelt einfach ist und Hochdurchsatz-wir es in der Tat als eine Art Bildschirm habe, gegen eine größere Anzahl von Isolaten Kombinationen zu testen und zu bestimmen, welche Konzentration Kombinationen synergistische waren. Dann führten wir eine kleinere Anzahl von Zeit-Kill Studien, Auswahl von Kombinationen und Konzentrationen, die in die schachbrettartige Anordnung wirksam gewesen. Bemerkenswert, weil der Schachbrett-Test in der Regel auf einer Skala von Microbroth Verdünnung durchgeführt wird, während der Zeit-Kill-Assay (ähnlich wie bei einer macrobrodo Verdünnung), größere Mengen verwendet wir fanden, dass FICs manchmal anders zwischen den beiden Methoden mit höheren Konzentrationen in der Regel in der Zeit-Kill-Test erforderlich, um Aktivität zu demonstrieren. Dieses Phänomen wurde bereits festgestellt, beim Vergleich von macrobrodo und Microbroth Verdünnung MIC Untersuchungsergebnisse für gramnegative Bazillen26 und wenn größere Inokula (wie im Zeit-Kill Studien verwendet) mit den standard Inokulum verwendet verglichen werden Microbroth Verdünnung und Schachbrett Array assays32. Eine bestimmte Einschränkung die schachbrettartige Anordnung ist die inhärente Variabilität in Microbroth Verdünnung MIC Test22. Während FICich Abschaltungen für Synergy Konto für diese Variabilität mathematisch6 solche Variabilität wirft unweigerlich Bedenken hinsichtlich der Zuverlässigkeit und Konsistenz der Schachbrett-Array Ergebnisse.
Aufgrund der Einschränkungen, die alle in-vitro-Testverfahren (einschließlich der Kultivierung von Bakterien in einer künstlichen Wachstumsmedium, statische antibiotische Konzentrationen und einen begrenzten zeitlichen Verlauf) Synergie, Ergebnisse, die durch diese Methoden bestätigt werden müssen und mit ergänzenden Techniken weiter ausgewertet. Solche Methoden gehören in-vitro-Pharmakokinetische/pharmakodynamische (PK/PD) Studien (z. B. der Hohlfaser-Infektion Modell40), Tiermodellen und letztlich PK/PD und Wirksamkeit Studien am Menschen. Die automatisierte Schachbrett Array Methode beschrieben hier, indem Sie eine schnelle Methode mit dem auf Bildschirm-Kombinationen für potentielle synergistische Tätigkeit ermöglicht mehr gezielte Nutzung dieser Techniken. Weitere Automatisierung aller dieser Methoden als sowie mehr systematische Untersuchung der Beziehung zwischen in-vitro-Parametern und der klinischen Ergebnisse werden wichtig bei der Skalierung von oben die Nutzung von Synergie testen und die Erhöhung seiner klinischen Anwendbarkeit.

Die Ausbreitung der multiresistente (MDR) bakterielle Krankheitserreger, insbesondere MDR Gram-negativen Bakterien wie Carbapenem-resistente Enterobacteriaceae (CRE) hinterließ Kliniker mit zunehmend begrenzten Möglichkeiten für erfolgreiche Anti-infektive Therapie 1, ein Problem durch das schleppende Tempo der neuartige antibakterielle Drogen Entdeckung2,3verschärft. Antimikrobielle Synergie, in denen zwei Medikamente in Kombination ein größer als Zusatzstoff wirken, bietet die Möglichkeit bestehende Antibiotika für Behandlung von MDR Bakterien, Bergung, auch wenn diese Bakterien resistent gegen eines oder beider sind die Antibiotika individuell. Erlauben Sie in diesem Artikel beschriebenen Techniken bieten zwei komplementäre Methoden von in-vitro-Tests, die, wenn Sie zusammen, verwendet Synergien Ermittler effizient Bildschirm antimikrobielle Kombinationen von Interesse für Beweis der synergistische Tätigkeit (automatisierte Schachbrett-Array-Methode) und dann weiter bewerten die Kinetik der Hemmung und Tötung zeigt vielversprechende Kombinationen in der Screening-Phase (die manuelle Zeit-Kill-Methode) identifiziert.
Eines der am häufigsten verwendeten Testmethoden in-vitro-Synergie ist der Schachbrett-Array-Assay, eine Änderung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Prüfung in dem isolieren die inhibitorische Aktivität von zwei verschiedenen Antibiotika gegen eine bakterielle getestet über einen Bereich von Konzentration Kombinationen4,5. Wenn die beiden Medikamente größer als Additiv Tätigkeit gemeinsam ausüben, gilt die Kombination synergistische6. Eine schachbrettartige Anordnung manuell einrichten beinhaltet jedoch eine Reihe von Berechnungen und verdünnen und Pipettieren Schritte, die umständlich und anfällig für menschliche Fehler sind. Diese Einschränkungen haben die Wirkung der Begrenzung der Nutzung von Synergie in erster Linie auf die Retrospektive Auswertung einer kleinen Zahl von Antibiotika-Kombinationen und bakterielle Isolate testen und Ergebnisse wurden nicht immer konsistent unter Studien7, 8,9,10,11. Darüber hinaus trug die Komplexität der Synergie Prüfung ihrer Nichtverfügbarkeit in klinischer Mikrobiologie Labor und praktisch keine in-vitro-Synergie Testdaten aus klinischen Studien Kombination Therapie12, 13.
Um die Effizienz und den Durchsatz der Schachbrett-Array-Methode zu erhöhen, haben wir konsequent verzichten Kleinmengen und nutzen eine automatisierte MIC Test zuvor entwickelte Technik in unserem Labor, die Inkjet-Drucktechnologie, genau verwendet der Antibiotika-Stammlösung in Vertiefungen in einem Mikrotiter-Platte-14. Die Plattform entfällt die Notwendigkeit für komplexe Berechnungen und mehrere Pipettieren Schritte. Die dazugehörige Software berechnet und verzichtet auf entsprechende Mengen von Antibiotika eine zweidimensionale schachbrettartige Anordnung erstellen, wenn der Benutzer einfach die gewünschte Konzentrationsbereich Eingaben und Stammlösung Konzentration der Antibiotika. Wir zunächst diese Methode gegen eine Sammlung von CRE Isolate15 getestet und anschließend auf Colistin-haltigen Kombinationen für Aktivität gegen Colistin-beständige Isolate16Tests konzentriert haben. Colistin ist ein Medikament der letzten Instanz in der Regel für die Verwendung bei der Behandlung von MDR gramnegative Erreger17,18und Colistin Widerstand reserviert bereits MDR Bakterien fast Pan-resistente19, wodurch sie ideal macht Kandidaten für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien mit Drogen, deren individuell unempfindlich sind. Wir fanden, dass die Kombination von Colistin und Protein-Synthese-Hemmer Antibiotika Minocyclin eine sehr hohe Rate der Synergie, sogar gegen Stämme, die resistent gegen jedes dieser Medikamente individuell, vermutlich waren weil Colistin eine subinhibitory ausübt permeabilizing Wirkung auf noch Colistin-resistente Bakterien. Wir haben diese Kombination als ein Beispiel in diesem Artikel verwenden ausgewählt. Der Hinweis Synergie Tests auch lässt sich für verbesserte Wirksamkeit der beiden Medikamente zu bewerten, die sowohl effektive individuell sind.
Die automatisierte Schachbrett-Array-Methode ermöglicht schnelle, Hochdurchsatz-Synergie zu testen. Die Schachbrett-Array-Methode muss jedoch Einschränkungen. Als eine modifizierte MIC-Assay es liefert Daten nur auf der Hemmung des Bakterienwachstums und nicht auf Tötung, und liefert keine Daten auf antibiotische Wirkung im Laufe der Zeit. Im Gegensatz dazu, manuelle Leistung von Zeit-Kill Synergie-Assays ist mehr arbeitsintensiv aber informiert über Hemmung und Tötung über eine 24 h Zeit Kurs20,21. Wir verwendet Zeit-Kill Analyse auf eine geringere Anzahl von Isolaten, um unsere Schachbrett Array Ergebnisse zu bestätigen und um festzustellen, ob die synergistischen Kombinationen, die wir identifiziert auch bakterizide waren.
Beide Schachbrett-Array und Zeit-Kill Synergie-Methoden liefern wertvolle Informationen über die Tätigkeit der Medikamenten-Kombinationen und sind besonders nützlich bei der Bewertung der potenziellen neuartige Therapieoptionen für bakterielle Erreger sehr widerstandsfähig. Die Methoden haben auch Einschränkungen. Die standard Microbroth-Verdünnungsmethode MIC hat vielfältige bekannten erwartete Fehler 1 zweifache Verdünnung22, der erhöht wird, wenn zwei Medikamente in eine schachbrettartige Anordnung zusammen getestet werden. Die Standarddefinition der Synergie, die Auffassung, dass eine synergistische Kombination nur, wenn die Medikamente zusammen auf ein Viertel ihrer jeweiligen Mikrofone6, sind dies berücksichtigt erwartet Variabilität, aber solche Variabilität (die vermutlich führen aus eine Kombination von biologischen und technischen Schwankungen23) zwangsläufig erzeugt unsicher über die Zuverlässigkeit der Synergie Ergebnisse. Der Mangel an etablierten Qualitätsstandards zu Testzwecken Synergie ist auch eine Strombegrenzung. Vielleicht ist die bedeutendste Einschränkung alle Synergie Testmethoden das Fehlen von etablierten Korrelationen zwischen in-vitro-Ergebnisse und klinische Ergebnisse bei Kombinationen sind zur Behandlung von Patienten24. Einfachere und schnellere Synergie Testmethoden wie die automatisierte Schachbrett-Array-Methode hier beschrieben wird, kann die Integration von in-vitro-Tests im Rahmen klinischer Studien oder andere Auswertungen der Ergebnisse für die Patienten um eine bessere Synergie erleichtern. charakterisieren Sie das Verhältnis zwischen in-vitro und in vivo Effekte in der Zukunft.
Die automatisierte Schachbrett Array-Methode, die wir hier präsentieren bietet eine Option für Hochdurchsatz-Screening von einer Vielzahl von Kombinationen und ermöglicht eine schnelle Auswertung von ungewöhnlichen, "hoch Risiko-hohe Belohnung" Kombinationen ohne eine große Investition von Zeit und Ressourcen. Die Zeit-Kill-Methode, die wir anschließend zu demonstrieren, kann zusätzliche Informationen unterstützend auf die synergistische Tätigkeit der Kombination und kann dazu beitragen, um seine bakterizide Aktivität und antibakterielle Kinetik zu charakterisieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain ATCC 25922</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>25922</td>
			<td>QC strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L 0.22 &#181;m bottle-top filter</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>597-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R01620 or R04050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2011-25150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-566-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>222-8032-01R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation adjusted Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control Software</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DensiCHEK Plus McFarland reader</td>
			<td>bioM&#233;rieux</td>
			<td>21250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long SHARP 10 &#181;L Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 digital dispenser</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 T8+ cassettes</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td>30097370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minocycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>14302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12-channel 10-300 &#181;L pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP-337</td>
			<td>Brand name: Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xplorer 12-channel 50-1200 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000328</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method

Da Preise von multiresistenten Erregern (MDR) steigen weiter, übertraf die Entwicklung von neuen Antibiotika, werden neuartige Ansätze zur Behandlung von MDR Bakterien zunehmend eine Notwendigkeit. Ein solcher Ansatz ist Kombinationstherapie, in denen zwei oder mehrere Antibiotika zusammen verwendet werden, um eine Infektion gegen die eine oder beide der Medikamente möglicherweise unwirksam allein. Wenn zwei Medikamente in Kombination, üben eine größere als additive Wirkung, sie gelten als synergistische. In-vitro-Untersuchung der synergistische Tätigkeit ist ein wichtiger erster Schritt bei der Bewertung der möglichen Wirksamkeit von Medikamenten-Kombinationen. Zwei wichtigsten Synergie in-vitro-Testverfahren entwickelt worden: die schachbrettartige Anordnung und die Zeit-Kill-Studie. In diesem Beitrag präsentieren wir einer automatisierte Schachbrett-Array-Methode, die nutzt Inkjet-Drucktechnologie zur Steigerung der Effizienz und Genauigkeit dieser Technik, als auch ein standard manuelle Zeit-Kill-Synergie-Methode. Automatisierte schachbrettartige Anordnung kann als Hochdurchsatz-Screening-Test dienen, während die manuelle Zeit-Kill-Studie zusätzliche, ergänzende Daten auf synergistische Tätigkeit und töten liefert.
Die schachbrettartige Anordnung ist eine Modifikation des standard minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) testen, in der Bakterien mit Antibiotika bei unterschiedlichen Konzentration Kombinationen inkubiert und bewertet für Wachstumshemmung nach der Inkubation über Nacht. Manuelle Leistung die schachbrettartige Anordnung erfordert eine aufwendige und fehleranfällige Reihe von Berechnungen und Verdünnungen. In die automatisierten Methode präsentiert hier die Berechnung und Abgabe der erforderlichen Antibiotika Stammlösung, die Bände durch den Einsatz von Inkjet-Drucker-Technologie automatisiert sind. Bakterien sind in der Zeit-Kill Synergie-Assay inkubiert mit den Antibiotika von Interesse, sowohl gemeinsam als auch einzeln und im Laufe von 24 h für quantitative Kultur in Abständen abgetastet. Die Ergebnisse können bestimmen, ob eine Kombination synergistische ist und ob es bakterizid und liefern Daten über Hemmung und Tötung von Bakterien im Laufe der Zeit.

Abbildung 1A zeigt ein Raster aus einem Schachbrett Array Synergie Experiment in welchem, die Minocyclin in einer Konzentration von 0-32 μg/mL in Kombination mit Colistin bei Konzentrationen von 0-16 μg/mL und gegen E. Coli -Stamm FDA-CDC 0494 getestet wurde. Die Werte stehen für photometrische Messungen bei optischen Dichte 600 nm (OD600). Brunnen mit OD600 Werte unterhalb von 0,07 (entspricht kein Wachstum durch Sichtkontrolle) sind rot, Brunnen mit OD600 Werte 0,07 (entspricht Wachstum durch Sichtkontrolle) grün schattiert. Für jedes Medikament ist minimale inhibitorische Konzentration (MIC; Fett) die niedrigste Konzentration des Medikaments, das Wachstum von Bakterien hemmt. Für Minocyclin Dies ist 32 μg/mL und für Colistin, ist es 8 μg/mL. Die Schattierung ist in Abbildung 1 bbeibehalten, aber Werte innerhalb der Brunnen in denen Wachstum gehemmt wird durch gebrochene hemmende Konzentration Index (FICich) Werte ersetzt werden. Diese werden wie folgt ermittelt: in jede Vertiefung der gebrochene hemmende Konzentration Index (FIC) jedes Medikament errechnet sich durch Division der Konzentration des Antibiotikums in so gut durch das Medikament MIC und die FICich errechnet sich durch Addition der beiden FICs. Brunnen mit einem FICich Wert von 0,5, welches die Cutoff für Synergie gilt, werden durch eine gebrochene Rahmenlinie angezeigt, und der Brunnen mit dem niedrigsten FICich Wert (0.094) ist Fett. Da die minimale FICich Wert im Bereich von synergistischen ist, gilt die Kombination synergistische.
Abbildung 2A und 2 b zeigen Netze analog zu denen in Abbildung 1A und 1 b Abbildung, aber in diesem Fall ist die Kombination nicht Synergie gegen das Isolat getestet (K. Pneumoniae Isolat BIDMC 4) zeigen, weil die minimale FICich an dem Wachstum gehemmt ist 1 > 0,5.
Abbildung 3 veranschaulicht die optische Dichte-Messwerte aus einem Schachbrett Synergie Raster, in dem mehrere übersprungene Brunnen (Enterobacter Weg komplexe Isolat BIDMC 27) aufgetreten ist. Übersprungene Brunnen sind Brunnen, bakterielles Wachstum trotz der Anwesenheit des Bakterienwachstums in benachbarten Brunnen mit höheren Konzentrationen von Antibiotikum gehemmt wird. Dieses Phänomen, das in MIC Standardtests sowie auftreten bekannt ist, dürfte aufgrund der biologischen Variabilität in Bakterienwachstum Merkmale von gut zu gut und die Empfindlichkeit einiger Antibiotika, kleine Unterschiede in der bakterielle Inokulum23 , 31 , 32. Wenn mehrere gut trat in eine schachbrettartige Anordnung übersprungen, wir die Ergebnisse verworfen und den Test wiederholt.
Abbildung 4 zeigt Beispiele für Zeit-Kill Synergie Ergebnisse drei Kombinationen getestet gegen K. Pneumoniae isolieren BIDMC 32. Kolonie zählt sind angegeben in einer logarithmischen Skala auf der y-Achse und die Uhrzeit in Stunden, auf das X-Achse. Der Unterschied zwischen Start Inokulum in der Röhre, enthält die Wirkstoffkombination und die Konzentration von Bakterien in diese Röhre um 24 Uhr ist durch den roten Balken und Zahl, während der Unterschied zwischen der Konzentration von Bakterien bei 24 h zwischen dem Rohr dargestellt. mit der Kombination und die Röhrchen mit den aktivsten Einzelsubstanz allein wird durch die blauen Balken und die Anzahl veranschaulicht. Abbildung 4A zeigt Ergebnisse aus der Kombination von Colistin und Minocyclin; Diese Kombination war synergistische (Differenz zwischen Konzentrationen von Bakterien ausgesetzt, Kombination und aktivsten Agent allein ≥2 Log10 KBE/mL in 24 h) und bakterizide (Rückgang ab Inokulum Konzentration bei 24 h ≥3 Log10 CFU/mL). Abbildung 4 b zeigt die Ergebnisse aus der Kombination von Colistin und Clindamycin, eine Kombination, die synergistische war, aber war nicht bakterizide. Diese Kombination verhindert Wachstum der Bakterien, die weder Drogen allein tat, aber nicht töten. Abbildung 4 zeigt, ergibt sich aus der Kombination von Colistin und Erythromycin, die weder bakterizide noch synergistische war.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg"> Abbildung 1: Schachbrettartige Anordnung ergibt demonstrierende Synergie (Minocyclin + Colistin getestet gegen E. Coli Stamm FDA-CDC 0494). (A) spektralfotometrische auslesen und Wachstum Interpretation eine schachbrettartige Anordnung. Werte in Zellen sind Lesungen der Extinktion bei 600 nm (OD600). Zellen mit OD600 Werte unterhalb von 0,07 (entsprechend kein Wachstum durch Sichtkontrolle) sind rot, während Zellen mit OD600 Werten 0,07 (entsprechend Wachstum durch Sichtkontrolle) grün schattiert. (B) gebrochene inhibitorischen Konzentration (FICich) Indexberechnung. Schattierung angibt, Wachstum oder kein Wachstum wurde beibehalten. Werte für Colistin und Minocyclin entlang X- und y-Achsen, gebrochene inhibitorischen Konzentration (FIC) oder das Verhältnis der Konzentration des Medikaments in dieser Spalte oder Zeile zu der minimalen inhibitorischen Konzentration (bzw. jetzt darstellen MIC) von diesem Medikament allein. Der Wert in jeder Zelle ist die FICich, oder die Summe der FICs beider Medikamente so gut. Das große gebrochene Linie umrandete Feld umschließt Brunnen mit einem FICich von 0,5. Die dick umrandeten Feld gibt an, der Brunnen mit der niedrigsten FICich in dem Wachstum gehemmt wird, oder die minimale FICich. Da die minimale FICich 0,5 ist, ist die Kombination synergistische betrachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg"> Abbildung 2: Schachbrett Array Ergebnisse einer Kombination, die nicht Synergie (Minocyclin + Colistin getestet gegen K. Pneumoniae BIDMC 4 isolieren) nachweisen. (A) optische Dichtewerte bei 600 nm und Wachstum Interpretation der Schachbrett-Array Ergebnisse wie bei Abbildung 1Abeschrieben. (B) gebrochene inhibitorischen Konzentration (FICich) Indexberechnung für Abbildung 1Abeschrieben. Da die minimale FICich > 0,5, die Kombination ist nicht als synergistische. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg"> Abbildung 3: Schachbrett-Array-Ergebnisse, die aufgrund nicht interpretierbar sind übersprungen Brunnen (Minocyclin + Colistin getestet gegen Enterobacter Weg komplexe isolieren BIDMC 27). Optische Dichtewerte bei 600 nm und Wachstum Interpretation der Schachbrett-Array Ergebnisse wie bei Abbildung 1Abeschrieben. Mehreren übersprungene Brunnen, in denen Bakterienwachstum, trotz der Anwesenheit des Wachstums im benachbarten Brunnen mit höheren Konzentrationen von Antibiotika gehemmt wird, werden demonstriert. Ergebnisse sind nicht interpretierbar und experimentieren muss wiederholt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg"> Abbildung 4: Zeit-Kill Synergie Ergebnisse der drei Kombinationen gegen K. Pneumoniae isolate BIDMC 32 getestet. Kolonie zählt sind angegeben in einer logarithmischen Skala auf der y-Achse und die Uhrzeit in Stunden, auf das X-Achse. Der Unterschied zwischen der Konzentration von Bakterien in der Kombination bei 24 h und ab Inokulum in der Röhre wird durch den roten Balken und Anzahl veranschaulicht. Wenn der Rückgang ab Inokulum Konzentration bei 24 h ≥3 Log10 KBE/mL ist, gilt die Kombination bakterizide. Der Unterschied zwischen der Konzentration von Bakterien bei 24 h zwischen dem Rohr, enthält die Kombination und die Röhrchen mit den aktivsten Einzelsubstanz allein ist durch den blauen Balken und die Anzahl dargestellt; ≥2 Log10 KBE/mL Reduktion ist, gilt die Kombination synergistische. (A) Colistin (CST) + Minocyclin (MIN), eine Kombination, die sowohl synergistische und bakterizide. (B) Colistin + Clindamycin (CLI), eine Kombination, die synergistische aber nicht Bakterizid ist. (C) Colistin + Erythromycin (ERY), eine Kombination, die synergistische weder bakterizide. Diese Ergebnisse wurden zunächst im Rahmen einer Studie über die synergistische Tätigkeit von Colistin-haltigen Kombinationen gegen Colistin-beständige Enterobacteriaceae, in denen wir unter Beweis, dass Colistin gestellt war mit einer Reihe von synergistischen Antibiotika, die nur einzeln aktiv sind (z.B. Clindamycin) oder in erster Linie (z.B. Erythromycin) gegen grampositive Bakterien16. (Beachten Sie, dass Erythromycin synergistische von schachbrettartige Anordnung gegen den Virusstamm gezeigt war, aber nicht durch Zeit-Kill, also es ausgewählt wurde hier als ein Beispiel für eine nicht-synergistische Kombination.) Wir theoretisierte, daß Colistin, das bekannt ist, handeln von Permeabilisierung der äußeren Membran Gram-negativen, übt eine sub-inhibitory permeabilizing Wirkung auf Colistin-beständige gramnegative Bakterien, so dass Eintrag von Drogen wie Clindamycin, die Normalerweise kann nicht die Gram-negativen Zelle eindringen. Panel (A) dieser Figur verändert wurde, vom Brennan-Krohn, Pironti und Kirby 201816, Copyright © American Society for Microbiology, antimikrobieller Mittel und Chemotherapie, 62(10), 2018, Pii: e00873-18, Doi: 10.1128/AAC.00873-18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

Antimikrobielle Synergie Prüfung dient zur Bewertung der Wirkung von zwei oder mehr Antibiotika in Kombination eingesetzt und erfolgt in der Regel durch eine von zwei Methoden: die schachbrettartige Anordnung oder die Zeit-Kill-Assay. Hier präsentieren wir eine automatisierte, Inkjet-Drucker unterstützt Schachbrett Array Synergie-Technik und eine klassische Zeit-Kill-Synergie-Studie.

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Manuelle Checkerboard-Array-Synergietests sind eine arbeitsintensive und fehleranfällige Methode. Im Gegensatz dazu verbessert unsere automatisierte, auf Tintenstrahldruckern basierende Schachbrettmethode die Geschwindigkeit, Genauigkeit und den Durchsatz erheblich. Die automatisierte Checkerboard-Methode ermöglicht es, eine große Anzahl von Medikamenten auf synergistische Kombinationen zu untersuchen, während die Time-Kill-Methode die Aktivität dieser Kombinationen bestätigen und weiter erforschen kann.Neuartige Antibiotika-Entdeckung hält nicht Schritt mit der Ausbreitung der Resistenz, aber die Untersuchung von synergistischen Kombinationen bietet eine Möglichkeit für die Rettung bestehender Medikamente zur Behandlung resistenter Bakterien. Obwohl wir diese Technik mit Antibakterien demonstrieren, könnte es auch mit anderen Klassen von antimikrobiellen Mitteln oder sogar für verschiedene Arten von Kombinationsmedikamenten oder ZusammengesetztenTests verwendet werden. In diesem Video zeigen wir eine automatisierte Checkerboard-Array-Methode und eine manuelle Time-Kill-Methode.Wir empfehlen, checkerboard-Array-Studien zuerst durchzuführen, um vielversprechende Kombinationen zu identifizieren und diese dann mit Time-Kill-Studien weiter zu untersuchen. Zunächst erstellen Sie antimikrobielle Stofflösungen aus Colistin und Minocyclin und führen Sie dann eine Qualitätskontrolle der Bestandslösungen durch, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als nächstes fügen Sie etwa einen Milliliter 0,9% Natriumchlorid, Saline, zu 12-Millimeter-x-75-Millimeter-Rundglaskulturröhren hinzu.Wählen Sie eine oder zwei Kolonien aus einer Nachtplatte von Bakterien, und legen Sie sie in die Kulturröhren. Wirbeln Sie die Rohre sanft, um die Bakterien in der Lösung zu suspendieren. Überprüfen Sie die Konzentration von Bakterien mit einem McFarland-Reader.Passen Sie die Konzentration an, indem Sie mehr Saline oder mehr Bakterien hinzufügen, um eine 0,5 McFarland Trübung zu erreichen. Verdünnen Sie dann die Bakterien einbis 300, indem Sie 100 Mikroliter der Suspension zu 30 Millilitern kation-angepasster Mueller-Hinton-Brühe in einem 50-Milliliter-Konischen Rohr hinzufügen, um eine endgültige Zelldichte von fünf mal 10 zu den fünften koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu erreichen. Bereiten Sie nun die antimikrobiellen Mittel für den Druck vor, indem Sie das begleitende Textprotokoll mitverfolgen.Speichern Sie das Protokoll, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen oben links, gefolgt von der Start-Schaltfläche. Laden Sie eine 384-Well-Platte in den Plattenhalter und drücken Sie Loaded unter der Load Plate 1 Synergy-Eingabeaufforderung. Platzieren Sie dann eine T8+-Kassette in den Kassettensteckplatz, und drücken Sie unter der Eingabeaufforderung T8+Kassette laden.Wenn Sie dazu aufgefordert werden, fügen Sie den angegebenen Reservoirs auf der Kassette eine Antibiotika-Lagerlösung hinzu. Nachdem jede Lösung hinzugefügt wurde, drücken Sie die Schaltfläche Ausgefüllt. Sobald der D300 Dispenser jedem Brunnen Antibiotikainmengen in entsprechenden Mengen hinzugefügt hat und das Feld Abgeschlossen auslaufen angezeigt wird, klicken Sie auf Schließen, entfernen Sie die Platte, und schalten Sie die D300 aus.Als nächstes gießen Sie die zuvor vorbereitete bakterielle Suspension in ein steriles Reagenzreservoir. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter der Suspension zu allen Brunnen im Schachbrett-Array hinzuzufügen. Dann 50 Mikroliter kation-angepasste Mueller-Hinton-Brühe ohne Bakterien in einen leeren Brunnen geben.Dies wird die negative Kontrolle gut, um Sterilität der Medien zu bestätigen. Inkubieren Sie in einem 35-Grad-Grad-Luft-Inkubator für 16 bis 20 Stunden. Um den Test zu analysieren, folgen Sie dem begleitenden Textprotokoll.Für den Time-Kill-Synergietest erneut die im Textprotokoll beschriebenen antimikrobiellen Bestandslösungen vorbereiten. Dann machen Sie eine 0,5 McFarland Suspension des Testorganismus in steriler Saline. Fügen Sie 100 Mikroliter der 0,5 McFarland Suspension zu fünf Milliliter NCM in einem 25 x 150 Millimeter Glas runden Boden Kulturrohr mit Edelstahlverschluss, und Wirbel sanft zu mischen.Mit einer sterilen Impfschleife, Isolierung Streifen einen Tropfen der verdünnten Suspension auf eine Blut-Agar-Platte, und inkubieren Sie die Platte bei 35 Grad Celsius in der Umgebungsluft, um inoculum Reinheit zu bestätigen. Ersetzen Sie den Verschluss an der Röhre, und inkubieren Sie ihn in einem Reagenzglasregal auf einem Shaker bei 35 Grad Celsius in der Umgebungsluft für mindestens 3 Stunden, bis das Wachstum der logarithmischen Phase erreicht ist. Während die Anfangskultur inkubiert wird, fügen Sie fünf autoklavierten Glaskulturröhren 10 Milliliter kationangepasste Mueller-Hinton-Brühe hinzu.Für eine Time-Kill-Synergie-Studie sollte mindestens ein Medikament in einer Konzentration sein, die die Wachstumskurve nicht einzeln beeinflusst. Dies kann durch die Bewertung der Auswirkungen einzelner Arzneimittelkonzentrationen vor der Synergiestudie bestimmt werden. Fügen Sie der ersten Röhre 10 Mikroliter Einmilligramm pro Milliliter Colistin-Lager hinzu, um eine endgültige Colistinkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, da dies eine Konzentration ist, die gegen den in diesem Beispiel verwendeten Stamm unwirksam ist.Für die zweite Röhre, fügen Sie 10 Mikroliter ein Milligramm pro Milliliter Minocyclin-Lager, um eine endgültige Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Diese Konzentration ist auch gegen den in diesem Beispiel verwendeten Stamm wirkungslos. In die dritte Röhre, fügen Sie 10 Mikroliter ein Milligramm pro Milliliter Minocyclin-Lager und 10 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Colistin-Lager.Dies ist die gleiche Menge an Colistin und Minocyclin in den Rohren eins und zwei verwendet. In der vierten und fünften Tube keine Antibiotika hinzufügen. Dies wird die Wachstumskontrolle bzw. die negativen Kontrollrohre sein.Als nächstes bereiten Sie 96 Tiefbrunnen-Polypropylenplatten mit Zwei-Milliliter-Bohrungen für serielle Verdünnungen vor, indem Sie 900 Mikroliter steriler Kochchen zu den Reihen B durch H der Spalten eins bis vier mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen. Wenn sich die Kultur in der logarithmischen Wachstumsphase befindet, entfernen Sie die Kulturröhre aus dem Shaker und wirbeln Sie sie sanft aus. Übertragen Sie einen Milliliter der Suspension auf ein 12 mal 75 Millimeter großes Glaskulturrohr und überprüfen Sie die Dichte mit einem McFarland-Reader.Wenn die Dichte kleiner als 1,0 McFarland ist, geben Sie die Röhre zum Shaker zurück und brüten Sie länger. Wenn es größer als 1.0 McFarland ist, fügen Sie kation-angepasste Mueller-Hinton-Brühe in die Röhre, Wirbel sanft, und Re-Sample, bis die Suspension bei 1.0 McFarland ist. Es ist wichtig, dass sich die Kultur bei der Vorbereitung des Startinokulums in der logarithmischen Wachstumsphase befindet.Sie können eine Wachstumskurve konstruieren, um zu bestimmen, wann ein Organismus diese Phase erreicht. Dann 100 Mikroliter der 1.0 McFarland Suspension zu den Röhren eins bis vier hinzufügen und sanft wirbeln. Unmittelbar nach dem Mischen und nach einer, zwei, vier, sechs und 24 Stunden, entfernen Sie ein 150-Mikroliter-Aliquot aus jedem Kulturrohr, indem Sie das Rohr so kippen, dass nur die sterile Pipettenspitze in das Rohr und nicht die unsterile Pipettenwelle während des Aliquot-Entzugs gelangt.Fügen Sie Aliquots zu aufeinanderfolgenden Brunnen in der ersten Reihe der zuvor vorbereiteten 96-Tiefbrunnenplatte hinzu. Bringen Sie Dierohre sofort nach dem Entfernen von Aliquots zu jedem Zeitpunkt an einen Reagenzglasträger auf einem Shaker in einem 35-Grad-Grad-Luft-Inkubator zurück. Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter aus Zeile A der Platte, und fügen Sie sie der Zeile B hinzu, die 900 Mikroliter Kochchen enthalten und so eine Verdünnung von 1 bis 10 bilden.Pipette die Lösung nach oben und unten vier bis fünf Mal zu mischen, und dann die Spitzen zu entsorgen. Zuerst beschriften Sie Mueller-Hinton Agar-Platten mit den zu verdünnenden Antibiotika-Bedingungen und Verdünnung. Dann die verdünnten Proben für Koloniezahlen mit der Fallplattenmethode mit einer Mehrkanalpipette mit extralangen Spitzen plattieren.Entfernen Sie 10 Mikroliter von jedem Brunnen in Spalte eins, und geben Sie sorgfältig in einer Reihe auf die entsprechend beschriftete Platte. Fahren Sie fort, bis alle Reihen auf Platten abgegeben werden. Darüber hinaus legen Sie am 24-Stunden-Zeitpunkt einen 10-Mikroliter-Tropfen, der direkt aus dem Negativkontrollrohr entnommen wird, auf die dafür vorgesehene Stelle, um die Sterilität zu testen.Dann alle Platten inumlegen und über Nacht bei 35 Grad Celsius in der Umgebungsluft bebrüten. Zählen Sie dann die Anzahl der Kolonien auf jedem Gebiet, und berechnen Sie die Zelldichte. Markieren Sie Kolonien mit einem feinspitzen permanenten Marker auf der Rückseite der Platte, um Doppelzählungen oder fehlende Kolonien zu vermeiden.Identifizieren Sie für jede Verdünnungsserie Tropfen mit drei bis 30 Kolonien. Zählen Sie die Kolonien in diesen Tropfen, und erfassen Sie die Zählung zusammen mit dem Verdünnungsfaktor. Hier ist ein Raster aus einem Schachbrett-Array-Synergieexperiment zu sehen, bei dem Minocyclin in Konzentrationen von null bis 32 Mikrogramm pro Milliliter mit Colistin in Konzentrationen von null bis 16 Mikrogramm pro Milliliter kombiniert und gegen einen E.coli-Stamm getestet wurde.Brunnen mit OD600-Werten unter 07 stellen kein Wachstum dar und sind rot schattiert, während Brunnen mit OD600-Werten über oder gleich 07 Wachstum darstellen und grün schattiert sind. Für jedes Medikament ist die minimale hemmende Konzentration die niedrigste Konzentration von Medikamenten, die das bakterielle Wachstum hemmt. Für Minocyclin, Dies ist 32 Mikrogramm pro Milliliter, und für Colistin, Es ist acht Mikrogramm pro Milliliter.Die Schattierung bleibt hier erhalten, aber Werte innerhalb der Brunnen, in denen das Wachstum gehemmt wird, werden durch fraktionelle hemmende Konzentration oder FIC-Indexwerte ersetzt. In jedem Brunnen wird der FIC-Index jedes Medikaments berechnet, indem die Konzentration von Antibiotika in diesem Brunnen durch die minimale hemmende Konzentration des Arzneimittels dividiert wird. Brunnen mit einem FIC-Index von weniger als oder gleich 0,5, der als Grenzwert für Synergien gilt, werden mit einer gebrochenen Linie angegeben, und der Brunnen mit dem niedrigsten FIC-Index wird fett gedruckt.Da sich der minimale FIC-Wert im synergistischen Bereich befindet, wird die Kombination als synergistisch betrachtet. Ein Beispiel für einen Fall, der keine Synergie zeigt, wird hier gezeigt, da der minimale FIC-Index, bei dem das Wachstum gehemmt wird, eins ist, der größer als 0,5 ist. Schließlich traten in diesem Beispiel mehrere übersprungene Brunnen auf, was ein bakterielles Wachstum darstellt, das gehemmt wird, trotz des Vorhandenseins von Bakterienwachstum in angrenzenden Brunnen mit höheren Konzentrationen von Antibiotika.Wenn mehr als ein übersprungener Brunnen in einem Schachbrett-Array aufgetreten ist, sollten die Ergebnisse verworfen und der Test wiederholt werden. Ein Beispiel für ein Diagramm, das die Ergebnisse eines Time-Kill-Synergie-Assays zeigt, wird hier vorgestellt. Einzelheiten zur Interpretation des Time-Kill-Synergie-Assays finden Sie im begleitenden Textprotokoll.Weitere Informationen über die Aktivität synergistischer Kombinationen können durch Auswertungen der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik sowie durch In-vivo-Studien mit Tiermodellen gewonnen werden. Befolgen Sie bei der Arbeit mit Bakterien immer die entsprechenden Sicherheitsverfahren, einschließlich der Verwendung persönlicher Schutzausrüstung. Wenn Sie Aerosole erzeugen oder hochriskante Krankheitserreger verwenden, führen Sie alle Arbeiten in einem Biosicherheitsschrank durch.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Forschung

Immunologie und Infektion

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