Name: antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Thea Brennan-Krohn è stata sostenuta da un Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e malattie infettive pediatriche di sviluppo umano di ricerca formazione grant (T32HD055148), un Istituto nazionale dell'allergia e malattie infettive formazione grant ( T32AI007061), borsa di studio di Boston bambini ospedale ufficio di facoltà sviluppo carriera sviluppo della facoltà e il National Institute of Allergy e malattie infettive career development award (1K08AI132716). J.E.K. è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, sotto numero premio R33 AI119114. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae:+Biology,+epidemiology,+and+management.">Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).</li><li>Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+antibiotics.">The future of antibiotics.</a> Critical Care. 18 (3), (2014).</li><li>Spellberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemic+of+antibiotic-resistant+infections:+a+call+to+action+for+the+medical+community+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).</li><li>Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+antibiotic+synergy+for+polymyxin+B-resistant+carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).</li><li>Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+dual+carbapenem+combinations+against+carbapenemase-producing+Enterobacteriaceae.">In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).</li><li>Zusman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+of+in+vitro+synergy+of+polymyxins+and+carbapenems.">Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).</li><li>Clock, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+doripenem+alone+and+in+multi-agent+combinations+against+extensively+drug-resistant+Acinetobacter+baumannii+and+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).</li><li>Hirsch, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antimicrobial+combinations+for+Klebsiella+pneumoniae+carbapenemase-producing+K.+pneumoniae.">Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).</li><li>T&#228;ngd&#233;n, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+double-+and+triple-antibiotic+combinations+for+VIM-+and+NDM-producing+klebsiella+pneumoniae+by+in+vitro+time-kill+experiments.">Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).</li><li>Tascini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activity+of+colistin+plus+rifampin+against+colistin-resistant+kpc-producing+klebsiella+pneumoniae.">Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).</li><li>Paul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+carbapenem-resistant+Gram-negative+bacteria.">Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).</li><li>Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+for+treating+carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae.">Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verification+of+an+automated,+digital+dispensing+platform+for+at-will+broth+microdilution-based+antimicrobial+susceptibility+testing.">Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).</li><li>Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+Synergistic+Activity+of+Antimicrobial+Combinations+Against+Carbapenem-Resistant+Enterobacteriaceae+Using+Inkjet+Printer-Based+Technology.">Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology.</a> J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).</li><li>Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Activity+of+Colistin-Containing+Combinations+against+Colistin-Resistant+Enterobacteriaceae.">Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin:+The+Revival+of+Polymyxins+for+the+Management+of+Multidrug-Resistant+Gram-Negative+Bacterial+Infections.">Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).</li><li>Nation, R. L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+in+the+21st+century.">Colistin in the 21st century.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).</li><li>Ah, Y. -. M., Kim, A. -. J., Lee, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+resistance+in+Klebsiella+pneumoniae.">Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).</li><li>Bratu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae+in+Brooklyn,+NY:+Molecular+epidemiology+and+in+vitro+activity+of+polymyxin+B+and+other+agents.">Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).</li><li>Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+plus+imipenem,+meropenem,+or+tigecycline+against+KPC-2-producing+Enterobacteriaceae+with+high+MICs+for+these+antimicrobials.">In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).</li><li>MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+methodology+and+implementation+of+a+semiautomated+serial+dilution+microtechnique+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing.</a> Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).</li><li>Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poisoned+well:+Enhancing+the+predictive+value+of+antimicrobial+susceptibility+testing+in+the+era+of+multidrug+resistance.">The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , (2018).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , (2018).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), 7 (1999).</li><li>Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+drop+plate+technique+for+bacterial+enumeration+by+parametric+and+nonparametric+tests.">Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests.</a> Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+6x6+drop+plate+method+for+simultaneous+colony+counting+and+MPN+enumeration+of+Campylobacter+jejuni,+Listeria+monocytogenes,+and+Escherichia+coli.">A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli.</a> Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).</li><li>Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Inoculum+and+Activity+in+AmpC-+and+Extended-Spectrum+(ESBL)-Producing+Escherichia+coli+and+Klebsiella+pneumoniae+Clinical+Isolates+Tested+by+Using+NCCLS+ESBL+Methodology.">Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inoculum+Effect+in+the+Era+of+Multidrug+Resistance:+Minor+Differences+in+Inoculum+Have+Dramatic+Effect+on+Minimal+Inhibitory+Concentration+Determination.">The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+Testing:+Broth+Microdilution+Checkerboard+and+Broth+Macrodilution+Methods.">Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Kill+Assay+for+Determining+Synergy.">Time-Kill Assay for Determining Synergy.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Hindler, J. A., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+MIC+variability+by+method+for+contemporary+clinical+isolates+of+multidrug-resistant+gram-negative+bacilli.">Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).</li><li>Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+add+or+not+to+add+Polysorbate+80:+Impact+on+colistin+MICs+for+clinical+strains+of+Enterobacteriaceae+and+Pseudomonas+aeruginosa+and+quality+controls.">To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).</li><li>Fuchs, P. C., Barry, a. L., Brown, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+testing+quality+control+studies+with+fosfomycin+tromethamine.">Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine.</a> European journal of clinical microbiology &amp; infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+Bactericidal+Concentration+Testing.">Minimum Bactericidal Concentration Testing.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+in+combination+with+various+antibiotics+against+extensively+drug-resistant+Enterobacter+cloacae+with+decreased+susceptibility+to+polymyxin+B.">In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).</li><li>Bulman, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin+combinations+combat+Escherichia+coli+harboring+mcr-1+and+blaNDM-5:+Preparation+for+a+postantibiotic+Era.">Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era.</a> mBio. 8 (4), (2017).</li></ol>

Il dosatore digitale D300 e consumabili associati sono stati forniti da Tecan (Morrisville, NC). Tecan non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta e interpretazione di dati, preparazione del manoscritto o decisione di pubblicare.

I due metodi descritti qui entrambi forniscono informazioni sull'attività di antimicrobici utilizzati in combinazione rispetto alla loro attività individuali. Automatizzato, digitale a getto d'inchiostro stampante-assistita metodo di erogazione è un adattamento del metodo descritto in Clinical Microbiology procedure manuale33, mentre il metodo time-kill segue più da vicino il protocollo corrispondente dallo stesso fare riferimento a34.
Nel metodo di matrice della scacchiera, i calcoli per determinare il volume necessario di antimicrobici stock per aggiungere a ciascun pozzetto nonché l'erogazione di questi volumi è automatizzato, eliminando così alcune delle principali fonti potenziali di errore in un manuale matrice della scacchiera. È ancora essenziale, tuttavia, che l'investigatore determina che gli stock originali sono rese a concentrazione che intendono e che le concentrazioni finali di obiettivo sono inserite correttamente nel software D300. Aggiungendo la sospensione antimicrobica per pozzetti in una piastra 384 pozzetti può essere difficile in un primo momento e richiede cura per garantire quel pipetta suggerimenti Inserire appositi pozzetti e quel liquido non splash fino ai bordi dei pozzi. Un gestore di liquido automatico utilizzabile in sostituzione di una pipetta multicanale portatile per aumentare la velocità e la precisione con cui la sospensione batterica è aggiunto ai pozzi. Come descritto nel protocollo, la D300 richiede l'aggiunta del tensioattivo, polisorbato 20 (P-20), per la corretta gestione di liquida. Un tensioattivo diverso, polisorbato 80, ad una concentrazione di 0,002%, è stato notato per abbassare il MICs colistina per organismi con colistina microfoni di < 2 µ g/mL in brodo standard microdilution saggi. 35 , 36 il nostro laboratorio precedentemente dimostrato che P-20 alle concentrazioni fino a 0,0015% non ha avuto effetto su D300-assistita MIC risultati in confronto con riferimento BMD14. Nell'esempio saggio presentato qui, la P-20 massima è concentrazione è 0,0014%.
Un problema che abbiamo incontrato con alcuni saggi di matrice della scacchiera era un gran numero di pozzi saltati. Ciò è avvenuto ad un tasso sproporzionato con alcuni antibiotici. In particolare, in una schermata di combinazioni contro una collezione di carbapenem-resistente Enterobacteriaceae, abbiamo trovato che mentre 49 di 521 prove (9,4%) erano inutilizzabili a causa di pozzi multipli saltati, 2 dei 12 antibiotici testati (Fosfomicina e cefepime) rappresentati il 46 di queste prove (94%). Tali tassi aumentati possono essere più probabili in farmaci che sono particolarmente suscettibili alla inoculo effetto31,32,37. Della nota, CLSI non consiglia test fosfomicina in brodo diluizione25 dovuto le preoccupazioni circa l'affidabilità dei risultati con questo metodo, che può spiegare i risultati inaffidabili visti con questo farmaco. Possono essere apportate alcune modifiche al metodo di scacchiera automatizzati in base alle preferenze di investigatore. Antimicrobici possono essere erogati in piastre contenenti già sospensione batterica, piuttosto che nei pozzetti vuoti, se questo è preferibile per ragioni di flusso di lavoro all'interno del laboratorio. Mentre piastre da 384 pozzetti sono state utilizzate qui, il metodo può essere effettuato in saggi di piastra a 96 pozzetti con modifica appropriata del volume ben. L'uso di un formato di piastra a 96 pozzetti può aiutare a wells riducente saltato per gli antibiotici che sono particolarmente sensibili alle piccole variazioni di inoculo. Quando calcolo FICho, potrebbe trattarsi di situazioni in cui il MIC è fuori scala (cioè, superiore a quello testato), comprese situazioni dove il farmaco da testare non ha attività singolarmente contro il tipo di organismo in fase di test. In questi casi, la FIC può essere calcolata sulla base supponendo che il microfono è una diluizione superiore alla concentrazione massima testata. Questa è la strategia più conservativa, in quanto presuppone il valore massimo possibile di FIC per qualsiasi diluizione dove l'inibizione è osservata durante la prova di sinergia. Ad esempio, se l'effettivo MIC erano invece due diluizioni raddoppio sopra la più alta concentrazione testato, allora il corrispondente FICs sarebbe duplice inferiore le assegnazioni di conservatore e così via.
Al fine di valutare con precisione l'attività battericida delle droghe in un'analisi di time-kill, è essenziale che le culture sia in fase logaritmica di crescita, particolarmente quando antibiotici attivi parete cellulare vengono testati28. Per i batteri di rapida crescita utilizzati in questo esempio (K. pneumoniae), 3 ore di incubazione con l'agitazione era appropriato per raggiungere questa fase di crescita, ma diverse quantità di tempo può essere necessaria per diversi organismi. In generale, la cultura dovrebbe apparire visibilmente ma non pesantemente torbida. La giusta quantità di tempo può essere determinata mediante la costruzione di una curva di crescita con i conteggi di Colonia presi a serial tempo punti (ad esempio, ogni 30 min per 4-6 h)38. L'inoculo iniziale previsto nello studio tempo-uccidere è anche importante. La concentrazione target dell'inoculo iniziale è di circa 5 x 105 a 1 x 106 CFU/mL. La diluizione descritta qui (100 μL di sospensione McFarland 1,0 in 10 mL di media) genera questo inoculo per Klebsiella pneumoniae e altre specie Enterobacteriaceae in cui lo abbiamo testato. Se la densità della partenza inoculi in un esperimento utilizzando diversi organismi è significativamente più alto o più basso di questo, poi una diluizione differente può essere necessaria. (La diluizione appropriata necessaria per una determinata specie può essere determinata eseguendo un conteggio di piastra di sospensione McFarland 0,5 o 1,0 per determinare quanti organismi questo torbidità rappresenta, quindi calcolare l'importo da cui la sospensione iniziale deve essere diluito per raggiungere la concentrazione finale appropriata.) Se, sulla revisione della conta su piastra dallo studio sinergia, l'inoculo iniziale di una qualsiasi delle provette contenenti antibiotico risulta sono stati significativamente più basso dell'inoculo iniziale del controllo di crescita, ciò potrebbe indicare entrambi riporto antibiotico o molto rapida uccisione dei batteri in breve tempo fra aggiunta di batteri nella provetta contenente Antibiotico e rimozione dell'aliquota per la placcatura. Se il numero effettivo delle colonie nella goccia non diluita in una serie è inferiore rispetto al numero di colonie in diluizioni successive, questo suggerisce effetto antibiotico riporto. Diverse opzioni sono state descritte per impedire questo effetto, tra cui diffusione una singola aliquota sopra un' intera piastra38 o filatura giù il campione, rimuovere il supernatante e ri-sospensione in una soluzione salina sterile prima della placcatura39. In ogni punto tempo il metodo time-kill, è anche fondamentale per lo sperimentatore per in modo efficiente ma accuratamente rimuovere un'aliquota da ciascuna provetta di cultura ed eseguire diluizioni seriali. Ritardi durante questo processo, particolarmente durante i primi punti di tempo che si verificano in stretta successione, possono portare a periodi prolungati durante i quali culture non sono state incubate e scosso, considerando che incurante di erogazione e diluizioni seriali possono portare alla piastra imprecisa conta. Rispetto al metodo di piastra diffusione di piastra conteggio, in cui 100 μL di ogni diluizione si sviluppa su una piastra di agar intero, il metodo della piastra goccia descritto è molto più veloce, richiede un numero molto inferiore di piastre di agar e permette per il conteggio più veloce, come il massimo numerabile numero di colonie per ogni goccia è 30, mentre fino a 300 colonie può in genere essere contato da una piastra di diffusione. Tuttavia, il metodo della piastra di diffusione è anche un'opzione se gli investigatori sono più comodi con questa tecnica. Se gocce diffuso in altro dopo l'erogazione con una pipetta multicanale, singola applicazione delle gocce più ampiamente distanziati con una pipetta monocanale può essere eseguita invece. Nella nostra esperienza, piastre a 4 ° C prima dell'erogazione di gocce di raffreddamento sembrava ridurre eccessiva diffusione.
Una limitazione delle tecniche descritte qui è che i risultati dei due tipi di test di sinergia (matrice di scacchiera e tempo-kill) non sono sempre concordi, e poiché gli articoli di sinergia più pubblicati utilizzano un metodo o l'altro piuttosto che entrambi insieme, può essere difficile sapere come integrare dati da due tipi di analisi. Perché il metodo di matrice automatizzato scacchiera che abbiamo sviluppato è semplice e ad alta produttività, abbiamo usato esso in effetti come una sorta di schermo per testare combinazioni contro un più grande numero di isolati e per determinare quali combinazioni di concentrazione erano sinergici. Abbiamo quindi effettuato un numero minore di studi di time-kill, selezionando combinazioni e le concentrazioni che erano stato efficace nella matrice della scacchiera. Di nota, perché l'analisi della scacchiera viene in genere eseguita su una scala di diluizione microbroth, mentre l'analisi tempo-kill utilizza più grandi volumi (simile a una diluizione di macrobroth), abbiamo trovato che FICs talvolta erano differenti fra i due metodi, con maggiore concentrazioni generalmente richieste nell'analisi tempo-uccidere per dimostrare l'attività. Questo fenomeno è stato notato in precedenza, quando macrobroth e microbroth diluizione MIC Test risultati vengono confrontati per bacilli gram-negativi26 e quando inoculi più grandi (come quello usato in studi di time-kill) vengono confrontati con l'inoculo standard utilizzato in matrice di diluizione e scacchiera microbroth dosaggi32. Un limite specifico della matrice della scacchiera è la variabilità inerente in diluizione microbroth MIC Test22. Mentre FICho tagli per conto di sinergia per questa variabilità matematicamente6 tale variabilità inevitabilmente genera preoccupazione circa l'affidabilità e la coerenza dei risultati di matrice della scacchiera.
A causa delle limitazioni inerenti alla sinergia tutto in vitro (inclusa la coltivazione di batteri in un terreno di coltura artificiale, concentrazioni di antibiotiche statiche e un corso di tempo limitato) metodi di prova, i risultati ottenuti con questi metodi devono essere confermati e ulteriormente valutato utilizzando tecniche supplementari. Tali metodi includono studi in vitro farmacocinetica/farmacodinamica (PK/PD) (ad esempio, la fibra cava infezione modello40), modelli animali e, in definitiva, gli studi umani di PK/PD e l'efficacia. Il metodo di matrice automatizzato scacchiera descritto qui, fornendo un metodo rapido con cui a combinazioni di schermo per potenziali attività sinergica, permette per più mirato l'utilizzo di queste tecniche. Ulteriormente l'automazione di tutti questi metodi, come così come più sistematica indagine sulla relazione tra parametri in vitro e gli esiti clinici, sarà importante nel ridimensionamento fino l'uso di sinergia test e aumentando la sua applicabilità clinica.

La diffusione di patogeni batterici di multidrug-resistente (MDR), in particolare batteri gram-negativi quali Enterobacteriaceae carbapenem-resistente (CRE), MDR ha lasciato i medici con le opzioni sempre più limitate per la riuscita terapia antinfettiva 1, un problema aggravato dal ritmo lento del romanzo droga antibatterica discovery2,3. Sinergia antimicrobica, in cui due farmaci usati in combinazione esercitano un effetto maggiore di additivo, offre la possibilità di recupero esistenti antibiotici per uso nel trattamento di batteri MDR, anche quando questi batteri sono resistenti a uno o entrambi i gli antibiotici individualmente. Le tecniche descritte in questo articolo forniscono due metodi complementari di sinergia in vitro test che, se utilizzati insieme, consentono gli investigatori a combinazioni di antimicrobici in modo efficiente schermo di interesse per la prova di attività sinergica (automatizzati Metodo della matrice della scacchiera) e quindi di valutare ulteriormente la cinetica di inibizione e di uccisione ha dimostrato dalle combinazioni promettenti individuati nella fase di screening (il metodo manuale di time-kill).
Uno dei metodi più comunemente usati di sinergia in vitro test è il test di matrice della scacchiera, una modificazione della concentrazione minima inibente (MIC) test in cui isolare l'attività inibitoria di due diversi antibiotici contro un batterico sono testati sopra una gamma di concentrazione combinazioni4,5. Se le due droghe esercitano maggiore attività additiva quando utilizzati insieme, la combinazione è considerata sinergico6. Tuttavia, creazione di una matrice di scacchiera manualmente comporta una serie di calcoli e passaggi di diluizione e pipettaggio che sono laboriosi e vulnerabili all'errore umano. Questi vincoli hanno avuto l'effetto di limitare l'uso di sinergia test principalmente per la valutazione retrospettiva di un piccolo numero di combinazioni antibiotiche e isolati batterici e risultati non sono sempre stati coerenti tra studi7, 8,9,10,11. Inoltre, la complessità del test di sinergia ha contribuito alla sua indisponibilità nel laboratorio di microbiologia clinica e per la virtuale assenza di dati di test in vitro sinergia da studi clinici di terapia di combinazione12, 13.
Al fine di aumentare l'efficienza e la velocità effettiva del metodo matrice della scacchiera, abbiamo fatto uso di una tecnica di test automatizzata di MIC precedentemente sviluppata nel nostro laboratorio che utilizza tecnologia di stampa a getto d'inchiostro a proprio e costantemente erogare piccoli volumi soluzione di antibiotico stock nei pozzetti in una piastra di microtitolo14. La piattaforma previene l'esigenza di calcoli complessi e più passaggi di pipettaggio. Il software associato calcola e dispensa volumi appropriati di antibiotici per creare una matrice bidimensionale della scacchiera, se l'utente semplicemente ingressi l'intervallo di concentrazione desiderata e concentrazione della soluzione di riserva degli antibiotici. Abbiamo inizialmente testato questo metodo contro una collezione di CRE isolati15 e successivamente si sono concentrati sulla prova combinazioni contenenti colistina per attività contro gli isolati resistenti colistina16. Colistina è una droga di ultimo ricorso generalmente riservato per l'uso nel trattamento di resistenza MDR patogeni Gram-negativi17,18e colistina rende già MDR batteri quasi pan-resistente19, che li rende ideali candidati per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, uso di droghe che sono insensibili individualmente. Abbiamo trovato che la combinazione di colistina e la sintesi di proteina inibitore antibiotico minociclina hanno avuti un tasso molto alto di sinergia, anche contro i ceppi che erano resistenti a ciascuno di questi farmaci singolarmente, presumibilmente perché colistina esercita un subinibitorie permeabilizing effetto sui batteri anche colistina-resistente. Abbiamo scelto questa combinazione da utilizzare come un esempio in questo documento. Della nota, sinergia test utilizzabile anche da valutare per una maggiore efficacia dei due farmaci che sono entrambi efficaci singolarmente.
Il metodo di matrice automatizzato scacchiera facilita la sinergia rapid, high throughput test. Tuttavia, il metodo di matrice della scacchiera hanno limitazioni. Come un'analisi modificata di MIC, fornisce dati solo su inibizione della crescita batterica e non per uccidere, e non fornisce dati sugli effetti antibiotici nel corso del tempo. Al contrario, manuale delle prestazioni di time-kill sinergia saggi è più laborioso ma fornisce informazioni su inibizione sia uccisione sopra un 24h tempo corso20,21. Abbiamo usato l'analisi tempo-kill su un minor numero di isolati per confermare i nostri risultati di matrice della scacchiera e per determinare se le combinazioni sinergiche abbiamo identificato erano anche battericide.
Entrambi metodi di sinergia di matrice e tempo-kill scacchiera forniscono preziose informazioni sull'attività di combinazioni di farmaci e sono particolarmente utili nella valutazione di potenziali nuove opzioni terapeutiche per altamente resistente ai batteri patogeni. I metodi hanno anche limitazioni intrinseche. Il metodo di diluizione MIC microbroth standard ha una gamma di noto errore previsto di 1 diluizioni22, che è aumentato quando due farmaci sono testati insieme in una matrice di scacchiera. La definizione standard di sinergia, che considera che una combinazione sinergica solo se i farmaci sono attivi insieme a un quarto loro rispettivi MICs6, prende in considerazione questo previsto variabilità, ma tale variabilità (che è pensata per derivare da una combinazione di fluttuazioni biologiche e tecniche23) inevitabilmente genera incertezza circa l'affidabilità dei risultati di sinergia. La mancanza di standard di controllo di qualità stabiliti per le prove di sinergia è anche una limitazione di corrente. Forse la limitazione più significativa di tutti i metodi di collaudo di sinergia è la mancanza di stabilite correlazioni tra i risultati in vitro e gli esiti clinici quando combinazioni sono usati per trattare i pazienti24. Sinergia di più semplice e più rapido test di metodi, come il metodo di matrice automatizzato scacchiera descritto qui, può facilitare l'integrazione di sinergia in vitro testing all'interno di studi clinici o altre valutazioni di risultati per il paziente al fine di meglio caratterizzare il rapporto tra gli effetti in vitro e in vivo in futuro.
Il metodo di matrice scacchiera automatizzato che presentiamo qui offre un'opzione per high throughput screening di una varietà di combinazioni e tiene conto la valutazione rapida di accostamenti insoliti, di "alto rischio-alta ricompensa" senza un grande investimento di tempo e risorse. Il metodo di time-kill, che dimostriamo successivamente, possa fornire ulteriori informazioni di supporto sull'attività sinergica della combinazione e può aiutare a caratterizzare la sua attività battericida e cinetica antibatterico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain ATCC 25922</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>25922</td>
			<td>QC strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L 0.22 &#181;m bottle-top filter</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>597-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R01620 or R04050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2011-25150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-566-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>222-8032-01R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation adjusted Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control Software</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DensiCHEK Plus McFarland reader</td>
			<td>bioM&#233;rieux</td>
			<td>21250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long SHARP 10 &#181;L Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 digital dispenser</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 T8+ cassettes</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td>30097370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minocycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>14302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12-channel 10-300 &#181;L pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP-337</td>
			<td>Brand name: Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xplorer 12-channel 50-1200 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000328</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method

Come tassi di patogeni di multidrug-resistente (MDR) continuano a salire, superando lo sviluppo di nuovi agenti antimicrobici, nuovi approcci al trattamento di batteri MDR stanno diventando sempre più una necessità. Un tale approccio è la terapia di combinazione, in cui due o più antibiotici sono utilizzati insieme per trattare un'infezione contro cui uno o entrambi i farmaci possono essere inefficaci da solo. Quando i due farmaci, in combinazione, esercitano una maggiore rispetto a effetto additivo, sono considerati sinergici. Ricerca in vitro di attività sinergica è un primo passo importante nel valutare l'eventuale efficacia di combinazioni di farmaci. Due metodi di prova principale sinergia in vitro sono stati sviluppati: la matrice di scacchiera e lo studio di time-kill. In questa carta, presentiamo un metodo di matrice scacchiera automatizzato che fa uso di tecnologia di stampa a getto d'inchiostro per aumentare l'efficienza e la precisione di questa tecnica, come pure un metodo standard manuale sinergia di time-kill. La matrice di scacchiera automatizzato può servire come un test di screening ad alta resa, mentre lo studio di time-kill manuale fornisce dati aggiuntivi, complementari su uccisione e attività sinergica.
La matrice della scacchiera è una modifica di standard concentrazione inibitoria minima (MIC) test, in cui i batteri sono incubati con antibiotici alle combinazioni differenti concentrazioni e valutati per l'inibizione della crescita dopo incubazione overnight. Manuale delle prestazioni della matrice della scacchiera richiede una laboriosa ed error-prone serie di diluizioni e calcoli. Nel metodo automatizzato presentati qui, il calcolo e l'erogazione della soluzione stock antibiotico necessari volumi sono automatizzati attraverso l'uso di tecnologia di stampa a getto d'inchiostro. Nell'analisi della sinergia di time-kill, batteri sono incubati con gli antibiotici di interesse, sia insieme che singolarmente e campionati a intervalli nel corso di 24 h per coltura quantitativa. I risultati possono determinare se una combinazione è sinergica e se è battericida e fornire dati sull'inibizione e uccisione dei batteri nel corso del tempo.

Figura 1A presenta una griglia da un esperimento di sinergia di matrice scacchiera nella quale minociclina a concentrazioni di 0-32 μg/mL è stato combinato con colistina alle concentrazioni di 0-16 μg/mL e testato contro Escherichia coli ceppo FDA-CDC 0494. I valori rappresentano letture spettrofotometriche a densità ottica 600 nm (OD600). Pozzetti con valori di600 OD inferiore a 0,07 (che corrisponde a nessuna crescita mediante ispezione visiva) sono rosso sfumato, mentre pozzi con valori di OD600 0.07 (che corrisponde alla crescita mediante ispezione visiva) sono verde sfumato. Per ogni farmaco, la concentrazione inibitoria minima (MIC; in grassetto) è la più bassa concentrazione di farmaco che inibisce la crescita batterica. Per minociclina, si tratta di 32 μg/mL e per colistina, è 8 μg/mL. L'ombreggiatura viene mantenuta in Figura 1B, ma i valori all'interno dei pozzetti in cui la crescita è inibita vengono sostituiti dai valori di indice (FICio) concentrazione inibitoria frazionario. Questi sono determinati come segue: in ciascun pozzetto, l'indice di concentrazione inibitoria frazionario (FIC) di ogni droga è calcolato dividendo la concentrazione di antibiotico in quel pozzo di MIC della droga, e la FICmi viene calcolato sommando i due FICs. Pozzetti con un FICho valore di 0,5, che è considerato il cut-off per sinergia, sono indicati con un bordo rotto, e il pozzo con il valore più basso FICho (0,094) è in grassetto. Poiché il minimo valore FICho è nella gamma sinergica, la combinazione è considerata sinergica.
Figura 2A e 2B figura mostrano griglie analoghi a quelli in Figura 1A e 1B di figura, ma in questo caso la combinazione non dimostra sinergia contro l'isolato testato (K. pneumoniae isolato 4 BIDMC), perché il minimo FICio in cui la crescita è inibita è 1, che è > 0.5.
La figura 3 illustra le letture di densità ottica da una griglia di sinergia della scacchiera in cui diversi pozzi saltati, si è verificato (l'enterobatterio cloache complesso isolato BIDMC 27). Saltato pozzi sono pozzi in cui è inibita la crescita batterica nonostante la presenza di crescita batterica in pozzetti adiacenti con le più alte concentrazioni di antibiotico. Questo fenomeno, che è conosciuto per accadere in standard MIC Test pure, è probabilmente dovuto la variabilità biologica nelle caratteristiche di crescita batterica da bene per bene e la sensibilità di alcuni antibiotici per piccole differenze di inoculo batterico23 , 31 , 32. se più di uno saltato bene si è verificato in una matrice di scacchiera, abbiamo scartato i risultati e ripetuto il dosaggio.
Figura 4 presenta esempi di risultati di time-kill sinergia di tre combinazioni testati contro K. pneumoniae isolano BIDMC 32. Conteggi di Colonia sono indicati in una scala logaritmica sul y-axis e tempo, in ore, sulla x-asse. La differenza tra l'inoculo iniziale nella provetta contenente la combinazione di farmaci e la concentrazione dei batteri in quel tubo a 24 h è illustrata dalla barra rossa e numero, mentre la differenza tra la concentrazione di batteri a 24 h tra il tubo contenente la combinazione e la provetta contenente l'agente singolo più attivo da solo è illustrata dalla barra blu e dal numero. Figura 4A Mostra risultati dalla combinazione di colistina e minociclina; Questa combinazione era sinergica (differenza tra le concentrazioni di batteri esposti a combinazione e a più attivo agente solo ≥ 2 log10 CFU/mL a 24 h) e battericida (declino da a partire di inoculo per concentrazione alle 24 h ≥ 3 log10 CFU/mL). Figura 4B Mostra i risultati dalla combinazione di colistina e clindamicina, una combinazione che era sinergica ma non era battericida. Questa combinazione ha inibito la crescita dei batteri, che né droga ha fatto da solo, ma non li uccidono. Figura 4 Mostra i risultati dalla combinazione di eritromicina, che non era né battericida che sinergici e colistina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg"> Figura 1: Matrice di Checkerboard risultati dimostrando sinergia (minociclina + colistina testato contro Escherichia coli ceppo 0494 FDA-CDC). (A) spettrofotometrica interpretazione della lettura e la crescita di una matrice di scacchiera. I valori nelle celle sono le letture di densità ottica a 600 nm (OD600). Le celle con valori di600 OD inferiore a 0,07 (corrispondenti a nessuno sviluppo mediante ispezione visiva) sono rosso sfumato, mentre le celle con valori di OD600 0.07 (corrispondente alla crescita mediante ispezione visiva) sono verde sfumato. Calcolo dell'indice (FICio) concentrazione inibitoria frazionario (B). Ombreggiatura che indica crescita o nessuna crescita è stata mantenuta. Valori per colistina e minociclina lungo x- e y-assi, rispettivamente, ora rappresentano la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC), o il rapporto tra la concentrazione del farmaco in tale colonna o riga alla concentrazione minima inibente ( MIC) di quella droga da solo. Il valore in ogni cella è il FICio, o la somma di FICs dei due farmaci in quel pozzo. La grande scatola linea-bordered rotta racchiude pozzi con un FICsono pari a 0,5. La cella di spessore-bordered indica il pozzo con il più basso FICio in cui la crescita è inibita, o il minimo FICio. Poiché il minimo FICho è 0,5, la combinazione è considerata sinergica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg"> Figura 2: Risultati della matrice della scacchiera di una combinazione che non dimostrano sinergia (minociclina + colistina testato contro K. pneumoniae isolare BIDMC 4). i valori di densità ottica (A) a 600 nm e crescita ' interpretazione dei risultati di matrice scacchiera come descritto nella figura1a. Calcolo dell'indice (FICio) concentrazione inibitoria frazionario (B) come descritto nella figura1a. Perché il minimo FICmi è > 0.5, la combinazione non è considerata sinergica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg"> Figura 3: Risultati di matrice scacchiera che sono non interpretabili dovuto saltato pozzi (minociclina + colistina testato contro l'enterobatterio cloache complesso isolare BIDMC 27). i valori di densità ottica a 600 nm e crescita ' interpretazione dei risultati di matrice scacchiera come descritto nella figura1a. Diversi pozzi saltati, in cui è inibita la crescita batterica nonostante la presenza di crescita in pozzetti adiacenti con le più alte concentrazioni di antibiotico, sono dimostrati. Risultati non sono interpretabili e sperimentare ha bisogno di essere ripetuta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg"> Figura 4: Risultati di sinergia di Time-kill di tre combinazioni testati contro K. pneumoniae isolato BIDMC 32. Conteggi di Colonia sono indicati in una scala logaritmica sul y-axis e tempo, in ore, sulla x-asse. La differenza tra la concentrazione dei batteri nella combinazione a 24 h e l'inoculo iniziale nel tubo è illustrata dalla barra rossa e dal numero. Se il declino di avvio inoculo a concentrazione a 24 h è ≥ 3 log10 UFC/mL, la combinazione è considerata battericida. La differenza tra la concentrazione di batteri a 24 h tra il tubo contenente la combinazione e la provetta contenente l'agente singolo più attivo da solo è illustrata dalla barra blu e numero; Se c'è ≥ 2 log10 riduzione CFU/mL, la combinazione è considerata sinergica. (A) colistina (CST) + minociclina (MIN), una combinazione che sia sinergico e battericida. (B) colistina + clindamicina (CLI), una combinazione che è sinergica ma non battericida. (C) colistina + eritromicina (ERY), una combinazione che non è né sinergico che battericida. Questi risultati sono stati inizialmente pubblicati come parte di uno studio dell'attività sinergica di colistina-contenenti combinazioni contro colistina-resistente Enterobacteriaceae, in cui abbiamo dimostrato che colistina era sinergica con un numero di antibiotici che operano solo singolarmente (es. clindamicina) o principalmente (ad es. eritromicina) contro batteri Gram-positivi16. (Nota che l'eritromicina era sinergica di matrice scacchiera contro il ceppo indicato, ma non da tempo di uccidere, così è stato selezionato qui come un esempio di una combinazione non sinergica.) Abbiamo supposto che colistina, che è noto per agire di permeabilizzazione della membrana esterna gram-negativa, esercita un effetto permeabilizing Sub su batteri gram-negativi resistenti alla colistina, che consenta l'immissione di farmaci come la clindamicina che normalmente non può entrare nella cellula gram-negativa. Pannello (A) di questa figura è stato modificato da Brennan-Krohn, Pironti e Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, agenti antimicrobici e chemioterapia, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

Antimicrobica sinergia test viene utilizzato per valutare l'effetto di due o più antibiotici usati in combinazione e viene in genere eseguita da uno dei due metodi: la matrice della scacchiera o il dosaggio di time-kill. Qui, presentiamo un automatizzato, a getto d'inchiostro stampante-assistita scacchiera matrice sinergia tecnica e uno studio classico tempo-kill sinergia.

Antimicrobica sinergia test di stampante a getto d'inchiostro-assistita Checkerboard automatizzato matrice e il metodo di Time-kill manuale

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Il test di sinergia manuale dell'array di scacchiera è un metodo ad alta intensità di lavoro e soggetto a errori. Al contrario, il nostro metodo di scacchiera automatizzato basato su stampante a getto d'inchiostro migliora notevolmente la velocità, la precisione e la velocità effettiva. Il metodo di scacchiera automatizzato consente di migliorare un gran numero di farmaci per combinazioni sinergiche, mentre il metodo time-kill può confermare ed esplorare ulteriormente l'attività di queste combinazioni.La scoperta di nuovi antibiotici non è al passo con la diffusione della resistenza, ma lo studio delle combinazioni sinergiche offre la possibilità di recuperare i farmaci esistenti per trattare i batteri resistenti. Sebbene dimostriamo questa tecnica con antibatterici, potrebbe anche essere utilizzata con altre classi di antimicrobici o anche per diversi tipi di farmaci combinati o test composti. In questo video, dimostriamo un metodo di array di scacchiera automatizzato e un metodo di uccisione manuale del tempo.Suggeriamo di eseguire prima studi sugli array di scacchiera per identificare combinazioni promettenti, quindi indagarle ulteriormente con studi di uccisione del tempo. Per iniziare, creare soluzioni antimicrobiche stock di colistina e minociclina, quindi eseguire il controllo di qualità sulle soluzioni stock come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Aggiungere quindi circa un millilitro di cloruro di sodio allo 0,9%, salino, a tubi di coltura del vetro rotondi da 12 millimetri per 75 millimetri.Selezionare una o due colonie da una piastra di batteri durante la notte e posizionarle nei tubi di coltura. Vortice i tubi delicatamente per sospendere i batteri nella soluzione. Controllare la concentrazione di batteri utilizzando un lettore McFarland.Regolare la concentrazione aggiungendo più saline o più batteri per ottenere una lettura della torbidità di 0,5 McFarland. Quindi, diluire i batteri uno a 300 aggiungendo 100 microlitri della sospensione a 30 millilitri di brodo Mueller-Hinton regolato dal catione in un tubo conico da 50 millilitri per raggiungere una densità cellulare finale di cinque volte 10 alla quinta unità di formazione della colonia per millilitro. Ora, prepara gli antimicrobici per la stampa seguendo il protocollo di testo di accompagnamento.Salvare il protocollo e quindi fare clic sul pulsante Esegui in alto a sinistra, seguito dal pulsante Start. Caricare una piastra da 384 po' nel supporto della piastra e premere Caricato sotto il prompt Synergy della piastra di carico 1. Quindi, inserire una cassetta T8+ nello slot della cassetta e premere Caricato sotto il prompt Carica t8+cassetta.Quando richiesto, aggiungere la soluzione di stock antibiotico ai serbatoi indicati sulla cassetta. Dopo aver aggiunto ogni soluzione, premere il pulsante Riempito. Una volta che il distributore D300 ha aggiunto scorte di antibiotici in volumi appropriati a ciascun pozzo e viene visualizzata la casella Esegui completato, fare clic su Chiudi, rimuovere la piastra e spegnere il D300.Quindi, versare la sospensione batterica precedentemente preparata in un serbatoio di reagente sterile. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri della sospensione a tutti i pozzi dell'array di scacchiera. Quindi, aggiungere 50 microlitri di brodo Mueller-Hinton regolato dal catione senza batteri a un pozzo vuoto.Questo sarà il controllo negativo bene per confermare la sterilità dei media. Incubare in un incubatore di aria ambiente Celsius di 35 gradi per 16-20 ore. Per analizzare il test, seguire il protocollo di testo di accompagnamento.Per il test di sinergia time-kill, preparare nuovamente le soluzioni stock antimicrobiche come descritto nel protocollo di testo. Quindi, effettuare una sospensione di 0,5 McFarland dell'organismo di prova in soluzione salina sterile. Aggiungere 100 microlitri della sospensione McFarland da 0,5 a cinque millilitri di CAMHB in un tubo di coltura del fondo rotondo in vetro da 25 per 150 millimetri con chiusura in acciaio inossidabile e vortice delicatamente da mescolare.Utilizzando un anello inoculato sterile, striature di isolamento una goccia della sospensione diluita su una piastra di agar del sangue e incubare la piastra a 35 gradi Celsius nell'aria ambiente per confermare la purezza dell'inoculo. Sostituire la chiusura sul tubo e incubarla in un rack della provetta su uno shaker a 35 gradi Celsius nell'aria ambiente per almeno 3 ore, fino a raggiungere la crescita in fase logaritmica. Mentre la coltura iniziale è in incubazione, aggiungere 10 millilitri di brodo Mueller-Hinton regolato dal catione a cinque tubi di coltura del vetro autoclavato.Per uno studio di sinergia time-kill, almeno un farmaco dovrebbe essere a una concentrazione che non influisce individualmente sulla curva di crescita. Questo può essere determinato valutando gli effetti delle singole concentrazioni di farmaci prima dello studio sinergico. Al primo tubo, aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di celenina per ottenere una concentrazione finale di colistina di un microgrammo per millilitro, poiché si tratta di una concentrazione inefficace contro il ceppo utilizzato in questo esempio.Per il secondo tubo, aggiungere 10 microlitri di un milligrammo per millilitro di minociclina per ottenere una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Questa concentrazione è anche inefficace contro il ceppo utilizzato in questo esempio. Al terzo tubo aggiungere 10 microlitri di calcio di minociclina da un milligrammo per millilitro e 10 microlitri di celenina da un milligrammo per millilitro.Questa è la stessa quantità di colistina e minociclina utilizzata nei tubi uno e due. Nel quarto e nel quinto tubi, non aggiungere antibiotici. Questo sarà rispettivamente il controllo della crescita e i tubi di controllo negativi.Successivamente, preparare 96 piastre in polipropilene a pozzo profondo con pozzetti da due millilitri per diluizioni seriali aggiungendo 900 microlitri di soluzione salina sterile alle file da B a H di colonne da uno a quattro con pipetta multicanale. Quando la coltura è in fase di crescita logaritmica, rimuovere il tubo di coltura dallo shaker e vortice delicatamente. Trasferire un millilitro della sospensione in un tubo di coltura del vetro da 12 per 75 millimetri e controllare la densità con un lettore McFarland.Se la densità è inferiore a 1,0 McFarland, riportare il tubo allo shaker e incubare più a lungo. Se è maggiore di 1,0 McFarland, aggiungere il brodo Mueller-Hinton regolato dal catione al tubo, il vortice delicatamente e ricampare fino a quando la sospensione è a 1,0 McFarland. È importante che la cultura sia nella fase di crescita logaritmica quando si prepara l'inoculo iniziale.È possibile costruire una curva di crescita per determinare quando un organismo raggiunge questa fase. Quindi, aggiungere 100 microlitri della sospensione 1.0 McFarland ai tubi da uno a quattro e vortice delicatamente. Immediatamente dopo la miscelazione e in una, due, quattro, sei e 24 ore, rimuovere un'aliquota di 150 microliter da ogni tubo di coltura inclinando il tubo in modo che solo la punta sterile della pipetta entri nel tubo e non nell'albero del pipettor non sterile durante il prelievo dell'aliquota.Aggiungere aliquote, rispettivamente, a pozzi consecutivi nella prima fila della piastra a pozzo profondo 96 precedentemente preparata. Riportare i tubi su un rack della provetta su uno shaker in un incubatore di aria ambiente Celsius di 35 gradi immediatamente dopo aver rimosso le aliquote in ogni punto di tempo. Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere 100 microlitri dalla riga A della piastra e aggiungerla alla riga B, contenente 900 microlitri di soluzione salina, creando una diluizione uno-a-10.Pipettare la soluzione su e giù da quattro a cinque volte per mescolare, quindi scartare le punte. In primo luogo, etichettare le piastre di agar Mueller-Hinton con le condizioni antibiotiche e la diluizione da placcare. Quindi, placcare i campioni diluiti per il conteggio delle colonie utilizzando il metodo della piastra di caduta, utilizzando una pipetta multicanale con punte extra-lunghe.Rimuovere 10 microlitri da ogni pozzo nella prima colonna e distribuire con cura in fila sulla piastra opportunamente etichettata. Continuare fino a quando tutte le file non vengono erose sulle piastre. Inoltre, nel momento di 24 ore, posizionare una goccia di 10 microliter prelevata direttamente dal tubo di controllo negativo sul punto dedicato a questo al fine di testare la sterilità.Quindi, invertire tutte le piastre e incubarle durante la notte a 35 gradi Celsius nell'aria ambiente. Quindi, contare il numero di colonie su ogni area e calcolare la densità cellulare. Contrassegnare le colonie con un pennarello permanente a punta fine sul retro della piastra per evitare il doppio conteggio o le colonie mancanti.Per ogni serie di diluizione, identifica le gocce da tre a 30 colonie. Conta le colonie in queste gocce e registra il conteggio insieme al fattore di diluizione. Qui è mostrata una griglia di un esperimento sinergico checkerboard array in cui la minociclina in concentrazioni da zero a 32 microgrammi per millilitro è stata combinata con colinina a concentrazioni da zero a 16 microgrammi per millilitro e testata contro un ceppo di E.coli.I pozzi con valori OD600 inferiori a 07 non rappresentano crescita e sono ombreggiati di rosso, mentre i pozzi con valori OD600 superiori o uguali a 07 rappresentano la crescita e sono ombreggiati di verde. Per ogni farmaco, la concentrazione inibitoria minima è la più bassa concentrazione di farmaco che inibisce la crescita batterica. Per la minociclina, si tratta di 32 microgrammi per millilitro, e per la colistina, è di otto microgrammi per millilitro.L'ombreggiatura viene mantenuta qui, ma i valori all'interno dei pozzi in cui la crescita è inibita sono sostituiti da valori di indice inibitori frazionari, o FIC. In ogni pozzo, l'indice FIC di ogni farmaco viene calcolato dividendo la concentrazione di antibiotico in quel pozzo per la concentrazione inibitoria minima del farmaco. I pozzi con un indice FIC inferiore o uguale a 0,5, che è considerato il cutoff per la sinergia, sono indicati con un bordo a linea rotta e il pozzo con l'indice FIC più basso è in grassetto.Poiché il valore FIC minimo è nell'intervallo sinergico, la combinazione è considerata sinergica. Un esempio di un caso che non dimostra sinergia è mostrato qui, come l'indice FIC minimo in cui la crescita è inibita è uno, che è maggiore di 0,5. Infine, in questo esempio, si sono verificati diversi pozzi saltati, che rappresentano una crescita batterica che è inibita, nonostante la presenza di crescita batterica in pozzi adiacenti con concentrazioni più elevate di antibiotico.Se più di un pozzo saltato si è verificato in una matrice di scacchiera, i risultati devono essere scartati e il test ripetuto. Qui viene presentato un esempio di grafico che dimostra i risultati di un saggio di sinergia time-kill. Si prega di consultare il protocollo di testo di accompagnamento per i dettagli sull'interpretazione del saggio di sinergia time-kill.Ulteriori informazioni sull'attività delle combinazioni sinergiche possono essere ottenute attraverso valutazioni della farmacocinetica e della farmacodinamica e attraverso studi in vivo con modelli animali. Seguire sempre le procedure di sicurezza appropriate, incluso l'uso di dispositivi di protezione individuale, quando si lavora con i batteri. Se si generano aerosol o si utilizzano agenti patogeni ad alto rischio, eseguire tutto il lavoro in un armadio di biosicurezza.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Un giorno Scheme flusso di lavoro per batterica Rilevazione dei patogeni e test di resistenza antimicrobica dalle emocolture

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Valutare alterazioni metaboliche epatiche durante la colonizzazione progressiva di Germe senza mouse da 1 H spettroscopia NMR

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche Mec Tipi I a V, resistente alla meticillina<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analisi del danno epiteliale Prodotto da<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infezione

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture e il suo uso in Antimicrobial Host Defense Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Stampato Glycan Array: Una tecnica sensibile per l'analisi del repertorio di anticorpi anti-carboidrati nei piccoli animali

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Analisi del comportamento di grande c. elegans popolazioni utilizzando un ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma automatizzata

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...