Name: antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00
Duration: 12 min 3 s
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テア ・ ブレナン-クローンによって、ユーニス · ケネディ シュライバー国立衛生研究所の子を支えられたし、発達小児感染症研究研修助成金 (T32HD055148)、国立研究所のアレルギーと感染症研修助成金 (T32AI007061)、ボストン子供病院部開発部キャリア開発局親睦と国立研究所のアレルギー ・感染症キャリア開発賞 (1K08AI132716)。J.E.K. は、国立研究所のアレルギーと感染症受賞番号 R33 AI119114 の下で健康の国民の協会によって支持されました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

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D300 デジタル ディスペンサーと関連付けられている消耗品は、テカンジャパン (モリスヴィル, ノースカロライナ) によって提供されました。テカンジャパン研究デザイン、データ収集/解析、原稿を準備する、または発行するという決定の役割がなかった。

ここで説明する 2 つの方法両方は彼らの個々 の活動と比較しての組み合わせで使用される抗菌薬のアクティビティに関する情報を提供します。自動、インク ジェット プリンタによるデジタル時間 kill メソッドより密接に同じ対応するプロトコルに続く中33臨床微生物学手続きハンドブック」で説明した方法の適応は、塗布方式34を参照します。
市松模様の配列メソッドで必要な量の各ウェルに加える抗菌株式だけでなく、これらのボリュームの調剤を割り出すための計算が自動化され、したがって手動で検出されたエラーの主要な潜在的なソースのいくつかを排除すること市松模様の配列。しかし、捜査官は、元株式が目的の濃度に作られています、目標の最終濃度が D300 ソフトウェアに正しく入力されている判断が不可欠です。384 ウェル プレートでの井戸に抗菌のサスペンションが最初に挑戦することができ、注意が必要ですを追加して、そのピペットを確保するためのヒントは、適切な井戸を入力、その液体にスプラッシュ井戸の端までないです。自動液体ハンドラーは、速度と精度の細菌懸濁液が井戸に追加されますを高めるため手持ちのマルチ チャンネル ピペットの代わりに使用できます。プロトコルに記載されている、D300 の適切な液体処理ポリソルベート 20 (P-20)、界面活性剤の添加が必要です。異なる界面活性剤、ポリソルベート 80、0.002% の濃度ではコリスチンのマイクで生物のコリスチン マイクを下げるため指摘されている < 標準液微量液体希釈法で 2 μ g/mL。35,36本研究室以前実証 0.0015% が D300 補助マイクと比較結果に影響しない低濃度で P-20 BMD14を参照します。ここで紹介のアッセイ例、最大 P-20 は濃度は 0.0014% です。
いくつかのチェッカー ボードの配列の試金で発生した問題の 1 つはだったスキップされた井戸の数が多いです。これは、特定の抗生物質に不均衡なレートで発生しました。具体的には、カルバペネム耐性腸内細菌科のコレクションに対して組み合わせ画面で分かった 521 試験 (9.4%) の 49 中複数のスキップされた井戸のため使用できなくなった 2 12 抗生物質のテスト (ホスホマイシンとセフェピム) 46 これらの試験 (94%) を占めています。このような増加率は、特に接種効果31,32,37を受けやすい薬の可能性が高い可能性があります。注記のうち、CLSI ではホスホマイシンをスープの希釈の25の結果の信頼性についての懸念のためにこの薬で見て信頼性の低い結果を説明するかもしれないこの方法でテストをお勧めしません。治験責任医師の好みに応じて自動チェッカー ボード メソッドにいくつかの変更が可能です。これが研究室内のワークフローの理由のために望ましい場合空井戸ではなく、既に細菌懸濁液を含んでいる版を使用して抗菌剤を省くことができます。384 ウェル プレートは、ここで使用した、メソッドは、よくボリュームの適切な変更の 96 ウェル プレート アッセイ行うことが。96 ウェル プレート形式の使用は、特に接種の小さな変化に敏感である抗生物質のため削減スキップされた井戸で助けるかもしれない。FIC は私を計算するときマイクが状況をスケール (すなわち、テストよりも高い)、テストされている薬物は、テストされている生物の種類に対して個別に活動がない状況を含むかもしれません。これらのケースで、FIC が計算されますベース マイクが 1 つ希釈テスト最高の濃度よりも高い。これは最も保守的な戦略は、希釈する相乗効果のテスト中に抑制を観察する場所の最大可能な FIC 値を想定しています。たとえば場合実際マイク代わりに上記 2 つの 2 倍希釈最高濃度テスト、対応する FICs は保守的な割り当ておよびのより低い 2 倍になります。
時間を殺すアッセイで薬の殺菌活性を正確に評価するには、アクティブな抗生物質の細胞壁はテスト28されるときに特に対数相成長で文化ができることが重要です。揺れと孵化の 3 時間 (k)、この例で使用される急速に成長している細菌のこの成長期に到達する適切なだったが、時間の異なる量の異なる生物の必要があります。一般に、文化は目に見えないが、重くない濁った表示されます。シリアル時間ポイント (例えば、毎 30 分 4-6 時間)38で撮影したコロニー数と成長曲線を作成することにより時間の適切な量を決定ことができます。時間を殺す研究目的開始接種も重要です。開始菌の濃度は約 5 × 105 1 × 106 CFU/mL です。ここで説明した希釈 (1.0 マクファーランド メディアの 10 mL で懸濁液 100 μ L) は、肺炎桿菌や他の腸内細菌科の種を我々 はそれをテストしているのこの菌を生成します。別の生物を用いた実験開始接種の密度は大幅これより高いまたは低い、別の希釈が必要かもしれない。(特定の種のために必要な適切な希釈を判別できる 0.5 または 1.0 マクファーランド サスペンションのプレート数を実行することによってこの濁度を表し、算定した初期の懸濁液がある必要がありますどのように多くの生物を決定します。適切な最終濃度に到達する希薄化後)。このいずれかの抗生物質の持ち越しが発生する可能性がある場合、プレート カウントの相乗効果研究からのレビュー、抗生物質含有チューブのいずれかの開始の接種がある成長制御の開始の接種よりかなり低いこと、または非常にめっき用抗生物質含有チューブへの細菌の追加および削除、因数の間の短い時間で細菌の急速な殺害。シリーズの原液のドロップで植民地の実際の数が低くその後希釈でのコロニー数よりも、これは抗生物質持ち越し効果を示唆しています。さまざまなオプションは、この効果は、1 つの因数を広がって全体プレート38サンプルを回転または、上清を除去、39をめっき前に滅菌生理食塩水で再懸濁などを防止するために記載されています。各時間の時点での時間を殺す方法、効率的に、正確に各カルチャ チューブから、因数を削除しシリアル希薄を実行調査官の重要なもです。この過程で、特に、立て続けに発生する早期の時点の間に遅延がその中に文化はない長時間につながることが培養され、動揺、不注意な調剤およびシリアルの希薄は不正確なプレートにつながるに対しカウントします。各希釈の 100 μ L が全体寒天プレート上で広がっている、プレート カウントの拡散板法と比較して記載されているドロップ プレートははるかに多く急速に寒天の少数を必要とし、高速カウント、最大値としては、可算各ドロップのコロニー数は 30、拡散板から最大 300 コロニーをカウント通常ことができます一方です。しかし、拡散プレート法はオプションも捜査官がこの手法でより快適な場合です。滴は、マルチ チャンネル ピペットで分注後お互いに広がりより広く間隔をあけられたシングル チャンネル ピペット滴の個々 のアプリケーションが代わりに実行できます。我々 の経験で滴を塗布する前に 4 ° C でプレートを冷却過剰な広がりを抑えるように見えた。
ここで説明する手法の 1 つの制限は、シナジー分析 (市松模様配列と時間を殺す) の 2 つの種類の結果は常に一致ではなく、ほとんど公開の記事を相乗効果は、一緒に 1 つの方法または他よりもむしろ両方を使用、のでそれがすることができます。試金の 2 種類のデータを統合する方法を知ることは困難であります。我々 が開発した自動チェッカー ボード配列方法は簡単、高スループット、我々 として使用している有効画面の種類に対して分離株の大きい数の組み合わせをテストするのには、どの濃度の組み合わせが相乗効果を決定するため。我々 は、組み合わせとされていた市松模様の配列に効果的な濃度を選択する時間を殺す研究のより小さい数を実行されます。注記のうち、時間殺すアッセイ (macrobroth 希釈と同様) より大きなボリュームを使用して、市松模様の試金は microbroth 希釈規模で通常実行されるためことが判明した FICs 時々 2 つのメソッド間で異なると高い一般的に動作をデモする時間殺すアッセイに必要な濃度。この現象は、macrobroth と microbroth の希釈マイク アッセイ結果グラム陰性桿菌26の大規模接種 (時間を殺す研究で使用される) と比較した時で使用される標準的な接種と比較すると以前指摘されていますmicrobroth の希釈と市松の配列は、32を試金します。Microbroth 希釈テスト22マイク固有の変動は, 市松模様配列の固有の制限です。FIC私ヒューズこの可変性のシナジー アカウントの中数学6そのような変動必然的に発生するもので信頼性と市松模様配列の結果の整合性についての懸念。
試験方法 (人工培、静的抗生物質濃度と期間限定コースの細菌の耕作を含む) すべての in vitro 相乗効果に固有の制限があるためこれらの方法によって得られた結果を確認する必要があり、さらに補足の技術を使用して評価されます。このようなメソッドの in vitro 薬物動態/薬力学 (PK/PD) 研究 (例えば、中空糸感染モデル40)、動物モデルを含めると、最終的には、PK/PD と有効性の研究。潜在的な相乗的活動のため画面の組み合わせに、迅速法を提供することによって、ここで説明自動チェッカー ボード配列メソッドを使用するより多くのこれらの技術の利用を対象とします。さらに in vitro におけるパラメーターと臨床転帰の関係のよりも体系的な調査として、これらのメソッドのすべてのオートメーションはスケーリングに重要なるテストとその臨床への適用性を増加の相乗効果の使用をアップします。

多剤耐性 (MDR) 病原性細菌、特に MDR グラム陰性細菌カルバペネム耐性腸内細菌科 (CRE) などの普及は、成功した抗感染治療ますます限られた選択肢と臨床医を残しています。1、新規抗菌薬発見2,3の低迷のペースによって悪化問題。組み合わせで使用されている 2 つの薬が大きいよりも添加剤効果を発揮を抗菌薬の相乗効果は、これらの細菌が 1 つまたは両方の抵抗力がある時でさえ、MDR 細菌の治療で使用するため既存の抗生物質をサルベージの可能性を提供します抗生物質個別に。研究者 (自動化された相乗的な活性の証拠のための興味の効率的に画面抗菌薬併用するを許可このペーパーで説明したテクニックを提供体外のシナジーを併用する場合、テストの 2 つの相補的な方法市松模様の配列法) し、さらに抑制および選考 (マニュアル時殺菌法) で特定された有望な組み合わせによって示される殺害の動態を評価します。
In vitro における相乗効果をテストの最も一般的に使用される方法の 1 つは市松模様の配列分析、細菌に対して 2 種類の抗生物質の阻害活性を分離、最小発育阻止濃度 (MIC) テストの変更をテスト濃度の組み合わせ4、5の範囲。2 つの薬を一緒に使用する添加物の活動をより発揮、組み合わせは相乗6と見なされます。ただし、市松模様配列を手動で設定、一連計算と、骨の折れるとヒューマン エラーに対する脆弱性希釈、分注の手順にはが含まれます。これらの制約は主に抗生物質の組み合わせと分離された細菌の小さな数字の回顧的評価テストの相乗効果の使用を制限する効果があったし、の結果が常に研究7の間で一貫性のあるされていません。 8,9,10,11。さらに、複雑な相乗効果のテストの臨床微生物学研究室でその入手不可能と組み合わせ療法12,の臨床試験からの in vitro 相乗効果試験データの仮想不在貢献しています13。
以前インク ジェット印刷技術を使用して、正確に私たちの研究室で開発した自動化されたマイクのテスト手法の使用し、一貫して少量を分配しましたが、効率性と市松模様の配列法のスループットを高めるためにマイクロタイター プレート14の井戸に抗生物質原液のプラットフォームには、複雑な計算や複数の分注ステップの必要があります。関連ソフトウェアを計算し、ユーザーは単に必要な濃度範囲を入力する場合市松模様の二次元配列を作成するために抗生物質の適切なボリュームと抗生物質の原液濃度を分配します。我々 は、当初 CRE 株15のコレクションに対してこのメソッドをテストし、その後16コリスチン耐性菌に対する活性のコリスチンを含む組み合わせのテストに焦点を当てています。コリスチンは一般に MDR グラム陰性病原菌17,18, とコリスチンの抵抗の治療で使用するために予約の最後の手段の薬剤既に MDR 細菌耐性がほぼパン19、最適なレンダリングします彼らは敏感な個別に薬を使用して新規治療戦略の開発のための候補者。コリスチンとタンパク質合成阻害の抗生物質ミノサイクリンの組み合わせがそれぞれ、これらの薬剤に抵抗力がある個別に推定上あったコリスチン発揮を阻害するので株に対しても、相乗効果の非常に高い率を持っていたことがわかった構造の違いもコリスチン耐性菌に対する効果。本稿では例として使用するこの組み合わせを選択しました。注記のうち、相乗効果のテストも使用できます個別に効果的な両方である 2 つの薬の効果を評価します。
自動チェッカー ボード配列メソッドを容易に急速に、高スループットの相乗試験。ただし、市松模様の配列メソッドには制限があります。変更されたマイクの試金としての細菌増殖抑制だけであり、殺害ではなくデータを提供し、時間をかけて効果が抗生物質のないデータを提供しません。対照的に、時間を殺すシナジー アッセイのマニュアルのパフォーマンスより労働集約的が 24 h 時間コース20,21上抑制と殺害の情報を提供します。市松模様の配列結果を確認して、相乗的な組み合わせがわかりましたが殺菌もあったかどうかを決定する菌の数を減らして時間を殺す分析を使いました。
市松模様配列と時間を殺すの相乗効果の両方の方法は薬の組み合わせのアクティビティに関する貴重な情報を提供、非常に耐性の細菌性病原体の潜在的な新規治療オプションの評価に特に有用です。また、方法には制約があります。標準 microbroth 希釈マイク法 1 2 倍希釈の22、市松模様の配列で一緒に 2 つの薬をテストするときに増加した知られている誤差範囲があります。相乗的組み合わせ薬が一緒に 4 分の 1 がそれぞれマイクで6、アクティブな場合にのみ考慮これを考慮した相乗効果の標準的な定義 (結果と考えられているそのような変動が変動が期待生物的および技術的な変動23の組み合わせ) から必然的に生成確かに相乗効果の結果の信頼性について。相乗効果をテストするための品質管理基準の欠如も現在の制限です。おそらくすべての相乗効果試験方法の最も重要な制限は、24患者の治療に使用される組み合わせの in vitro の結果と臨床転帰の間確立された相関の欠如です。ここで説明自動チェッカー ボード配列メソッドなどのメソッドをテストより簡単なとより迅速なシナジーが体外の相乗効果がより良いために臨床試験や患者の転帰の他の評価テストの統合を促進するかもしれない生体外でそして生体内での効果、将来的に関係を特徴付けます。
ここで紹介する自動チェッカー ボード配列法はさまざまな組み合わせの高速スクリーニングのためのオプションを提供しています、時間の主要な投資をせず、珍しい「高リスク ・高報酬」組み合わせ迅速に評価することができますし、、リソース。その後示すために、時間を殺す方法の組み合わせの相乗的な活性の追加の支援情報を提供し、その殺菌力と抗菌速度を特徴付けることができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain ATCC 25922</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>25922</td>
			<td>QC strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L 0.22 &#181;m bottle-top filter</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>597-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R01620 or R04050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2011-25150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-566-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>222-8032-01R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation adjusted Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control Software</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DensiCHEK Plus McFarland reader</td>
			<td>bioM&#233;rieux</td>
			<td>21250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long SHARP 10 &#181;L Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 digital dispenser</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 T8+ cassettes</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td>30097370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minocycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>14302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12-channel 10-300 &#181;L pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP-337</td>
			<td>Brand name: Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xplorer 12-channel 50-1200 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000328</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method

多剤耐性 (MDR) 病原体の速度上昇を続けて、新しい抗菌薬の開発を上回っている、小説 MDR 菌治療への取り組みがますます必要になっています。このようなアプローチの 1 つは併用療法は、2 つ以上抗生物質はに対して感染症を治療するために使用の 1 つまたは両方の薬の効果がないかだけで。時の組み合わせで、2 つの薬を出す大きい添加剤の効果も相乗的と見なされます。相乗的な活性の in vitro で調査は薬剤の組み合わせの可能な有効性の評価に重要な最初のステップです。2 つのメインの in vitro 相乗効果試験方法が開発されている: 市松模様配列と時間を殺す研究。本稿で示す自動チェッカー ボード配列メソッド インク ジェット印刷技術を使用して、効率と標準的な手動時間殺すシナジー メソッドと同様に、この手法の精度を高めます。自動チェッカー ボード配列は、手動時間殺す研究相乗活性および殺害に追加、補足データを提供しますが、高スループット スクリーニング アッセイとして使用できます。
市松模様の配列は、標準最小発育阻止濃度 (MIC) テスト、細菌が抗生物質の組み合わせに異なる濃度で培養し、一晩インキュベートした後成長阻害の評価の変更です。市松模様配列の手動のパフォーマンスには、面倒でエラーを起こしやすい一連の計算と希釈が必要です。計算とボリュームは、インク ジェット プリンター技術を使用して自動化されている必要な抗生物質原液の塗布、自動化された方法でここで紹介。時間を殺す相乗効果の分析で細菌は一緒におよび個別に関心の抗生物質で孵化、定量培養の 24 時間にわたって間隔でサンプリングします。結果の組み合わせが相乗効果かどうか、それが殺菌、かどうかを決定し、抑制と細菌の殺害時間をかけてデータを提供します。

図 1A 0 32 の濃度であるミノサイクリンの μ g/mL が 0-16 μ g/mL の濃度でコリスチン併用、大腸菌 FDA CDC 0494に対してテストされた市松模様配列の相乗効果実験からのグリッドが表示されます。値は、(外径600) 光学密度 600 nm 吸光光度測定値を表します。(目視による成長なしに対応) から 0.07 下外径600値と井戸が、OD600値 0.07 (目視による成長に対応) すると井戸が緑色、赤色で表示。各薬剤の最小発育阻止濃度 (MIC; 太字) 細菌の増殖を阻害する薬の最低濃度であります。ミノサイクリン、これは 32 μ g/mL とコリスチン、8 μ g/mL です。シェーディングは、図 1 bで保持されますが、成長が阻害される井戸内の値は、小数の発育阻止濃度 (FIC私) インデックス値で置き換えられます。これらは次のように決定されます: 各ウェルに各薬品の小数の発育阻止濃度指数 (FIC) は薬剤の MIC、よく抗生物質の濃度で割って算出し、FIC は私は 2 つの FICs の合計によって計算されます。FIC私の値を 0.5、相乗効果のためのカットオフとされる井戸が壊れて線の境界線で示されます、最小値を持つ FIC私(0.094) 井戸は太字で表示されます。最小 FIC私値は相乗効果の範囲なので組み合わせは相乗的であると見なされます。
図 2 aおよび図 2 bを示すグリッド図 1 a 図 1 bのそれらに類似しているが、この場合の組み合わせを示していないテスト分離 (k分離 BIDMC 4) に対する相乗効果のため、最小 FIC私の成長を抑制するはである 1 > 0.5。
図 3は、いくつかスキップされた井戸が発生した (エンテロバクター cloacae複雑な分離 BIDMC 27) 市松シナジー グリッドから光学密度の測定値を示しています。スキップされた井戸がある井戸抗生物質の高濃度の隣接する井戸における細菌増殖の存在にもかかわらず、細菌の増殖を抑制します。標準的なマイクもテストで発生すること知られているこの現象はから細菌の増殖特性の生物学的変動可能性があります同様によく、菌23の小さな違いにいくつかの抗生物質の感受性に,31,32します。 1 つ以上スキップも市松模様配列で発生した、我々 は結果を破棄され、アッセイを繰り返されます。
図 4プレゼントkに対してテストした 3 つの組み合わせの時間を殺すの相乗効果の結果の例は、BIDMC 32 を分離します。コロニー カウント、 yに対数スケールで示されます-軸と時間、 x-軸。薬の組み合わせと 24 h でその管の細菌の集中を含む管内開始接種の違いは赤いバーと番号、チューブ間の 24 h での細菌の濃度差によって示されています。最も活動的な 1 つのエージェントだけを含む管との組み合わせを含む青色のバーと番号で示されています。図 4 aは、コリスチンとミノサイクリン; の組み合わせから結果を示しています。この組み合わせは相乗 (細菌の組み合わせ及び最もアクティブなエージェントだけで ≥2 ログ10 CFU/mL で 24 h の濃度差) と殺菌 (衰退 24 h 3 ログ10濃度に接種を始めてからCFU/mL)。図 4 bは、コリスチンとクリンダマイシンの組み合わせ、相乗効果が、なかった殺菌の組み合わせから結果を示しています。この組み合わせは、どちらも薬だけでしたが、それらを殺していない細菌の増殖を阻害しました。コリスチンとエリスロマイシン、殺菌も相乗効果もなかったの組み合わせから結果を図 4に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg"> 図 1: 市松模様配列 (ミノサイクリン + コリスチン大腸菌に対してテストひずみ FDA CDC 0494) 示す相乗効果を結果します。チェッカー ボード配列の (A) 吸光光度読み出しと成長の解釈。セルの値が 600 で光学濃度測定値 nm (外径600)。(目視による成長なしに対応) 0.07 以下 OD600の値を持つセルは、(目視による成長に対応) 外径600値 0.07 を持つセルが緑色、赤色で表示。(B) 小数阻害濃度 (FIC私) インデックス計算。成長か成長なしを示す陰影が残されています。コリスチンとミノサイクリンxとyの値の軸はそれぞれ、今に小数の発育阻止濃度 (FIC) は、またはその列または最小発育阻止濃度 (行で薬の濃度の比を表すMIC) 単独で薬物の。各セルの値は、FIC は私、または 2 つの FICs の合計がよく中医薬品します。大型の壊れた線枠線のボックス、FIC私0.5 と井戸を囲みます。厚い隣接セルを示します最低 FIC は私の成長が抑制され、または最小 FIC は私も。最小 FIC は私は 0.5、組み合わせは相乗的であると見なされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg"> 図 2: (ミノサイクリン + コリスチンkに対してテスト BIDMC 4 を分離) の相乗効果を示していない組み合わせの市松模様の配列の結果。(A) 光密度値チェッカー ボード配列結果図 1 aのとおりの 600 nm と成長の解釈で。(B) 小数の発育阻止濃度 (FIC私) インデックス計算図 1 aのとおりです。最小 FIC は私だ > 0.5、組み合わせを相乗的には考慮されません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg"> 図 3: 市松模様配列結果が解釈するためスキップ (ミノサイクリン + コリスチンエンテロバクター cloacae複雑なに対してテスト分離 BIDMC 27) 井戸。チェッカー ボード配列結果図 1 aのとおりの 600 nm と成長の解釈で光密度値。抗生物質の高濃度の隣接する井戸の成長の存在にもかかわらず、細菌の増殖を抑制、いくつかスキップされた井戸の例を示します。結果は、解釈であり、繰り返されるニーズを実験します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg"> 図 4: k分離 BIDMC 32 に対してテストした 3 つの組み合わせの相乗効果結果を時間を殺す。コロニー カウント、 yに対数スケールで示されます-軸と時間、 x-軸。チューブの 24 h の組み合わせで細菌の集中そして開始の接種材料の違いは、赤いバーと番号で示されています。24 h で濃度に接種を始めてから減少が 3 ログ10 CFU/mL の組み合わせが殺菌と見なされます。24 h の組み合わせを含むチューブと単独で最も活動的な 1 つのエージェントを含むチューブの間に細菌の濃度の違いが青色のバーと数字によって示されています。≥2 ログ10 CFU/mL 低減、組み合わせは相乗的であると見なされます。(A) コリスチン (CST) + ミノサイクリン (分)、相乗効果と殺菌の組み合わせ。(B) コリスチン + クリンダマイシン (CLI) 相乗効果がない殺菌の組み合わせ。(C) コリスチン + エリスロマイシン (ERY)、相乗効果も殺菌の組み合わせ。これらの結果はコリスチン含むの相乗的な活性の研究の一環として公開された最初コリスチン耐性腸内細菌科、そのコリスチンを実証我々 に対しての組み合わせは相乗効果の数個別にのみアクティブになっている抗生物質 (例えばクリンダマイシン) または主に (例えばエリスロマイシン) グラム陽性菌16に対して。(エリスロマイシンは、ひずみに対して市松模様配列によって、相乗的が時間殺す、だからそれは選択されていない非相乗的組み合わせの例としてここで)。私たちと仮定コリスチンは、グラム陰性菌の外膜の透過によって行動する知られている、クリンダマイシンなどの薬物のエントリを許可するコリスチン耐性のグラム陰性菌の抗生物質 permeabilizing の効果を発揮グラム陰性菌の細胞は通常入力できません。この図のパネル (A)、ブレナン クローン、Pironti、および星のカービィ 2018年16著作権 © アメリカ微生物学、抗菌剤、化学療法学会から変更された 62(10)、2018、pii: e00873-18 土井: 10.1128/AAC.00873-18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

抗菌相乗効果テストの組み合わせで使用される 2 つ以上の抗生物質の効果を評価するために使用し、は通常 2 つの方法のいずれかで実行されます: 市松模様配列または時間を殺すの試金。ここでは、自動、インク ジェット プリンターによる市松模様配列シナジー技術と古典的な時間殺すシナジー研究を提案します。

インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカー ボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

手動チェッカーボードアレイの相乗効果テストは、手間がかかり、エラーが発生しやすい方法です。これに対し、当社の自動インクジェットプリンターベースのチェッカーボード方式は、スピード、精度、およびスループットを劇的に向上させます。自動化されたチェッカーボード法は、相乗的な組み合わせのために多数の薬物をスクリーニングすることを可能にし、タイムキル法はこれらの組み合わせの活性をさらに確認し、さらに探求することができる。新しい抗生物質の発見は抵抗性の広がりに追いついていないが、相乗的な組み合わせの調査は、耐性細菌を治療するために既存の薬物を救う可能性を提供する。抗菌剤でこの技術を実証していますが、他のクラスの抗菌剤や異なる種類の併用薬や化合物検査にも使用できます。このビデオでは、自動チェッカーボード配列方式と手動の時間キル方式を示します。まず、有望な組み合わせを特定するためにチェッカーボードアレイ研究を行い、次にこれらをタイムキル研究でさらに調査することをお勧めします。まず、コリスチンとミノサイクリンの抗菌ストック溶液を作り、付随するテキストプロトコルに記載されているようにストック溶液の品質管理を行います。次に、約1ミリリットルの0.9%塩化ナトリウム、生理食塩水を12ミリメートル/75ミリメートルの丸底ガラス培養チューブに加えます。一晩の細菌のプレートから1つまたは2つのコロニーを選択し、培養管に入れます。溶液中の細菌を懸濁させるチューブを穏やかに渦液。マクファーランドの読者を使用して細菌の濃度を確認してください。0.5マクファーランド濁度の読み取りを達成するために、より多くの生理的またはより多くの細菌を追加することによって濃度を調整します。次いで、50ミリリットルの円錐管中のカチオン調整されたミューラー・ヒントンブロスの30ミリリットルに懸濁液の100マイクロリットルを加えて細菌を1〜300に希釈し、5倍の5倍のコロニー形成単位に1ミリリットルの最終的な細胞密度に達する。さて、付随するテキストプロトコルに沿って従って印刷するための抗菌剤を準備する。プロトコルを保存し、左上の [実行] ボタンをクリックし、[開始] ボタンをクリックします。プレートホルダーに384ウェルプレートをロードし、ロードプレート1シナジープロンプトの下でロードを押します。次に、カセットスロットに T8+カセットを挿入し、T8+カセットのロードプロンプトの下で「ロード」を押します。プロンプトが表示されたら、カセットの示された貯蔵所に抗生物質ストック溶液を加えます。各ソリューションを追加したら、[塗りつぶし] ボタンを押します。D300 ディスペンサーが適切な量の抗生物質ストックを各ウェルに追加し、[実行完了]ボックスが表示されたら、[閉じる]をクリックしてプレートを取り外し、D300 をオフにします。次に、以前に調製した細菌懸濁液を滅菌試薬貯留槽に注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルのサスペンションをチェッカーボードアレイ内のすべてのウェルに追加します。その後、空の井戸に細菌なしでカチオン調整されたミューラーヒントンスープの50マイクロリットルを追加します。これは、メディアの無菌性を確認するネガティブコントロールウェルになります。35°Cの周囲空気インキュベーターで16〜20時間インキュベートします。テストを分析するには、付属のテキスト プロトコルに従ってください。タイムキルシナジーテストのために、再びテキストプロトコルに記載されているように抗菌ストック溶液を準備する。その後、滅菌生理液中の試験生物の0.5マクファーランド懸濁液を作る。0.5マクファーランド懸濁液の100マイクロリットルを、ステンレススチールクロージャー付きの25/150ミリメートルガラス丸底培養チューブのCAMHBの5ミリリットルに加え、渦をそっと混ぜます。滅菌接種ループを使用して、希釈された懸濁液の滴を血液寒天プレートに引き落とし、周囲の空気で35°Cでプレートをインキュベートして接種純度を確認する。チューブの閉鎖を交換し、対数相成長に達するまで、少なくとも3時間は周囲の空気で摂氏35度のシェーカーの試験管ラックにインキュベートします。最初の培養がインキュベートされている間に、5つのオートクレーブガラス培養チューブにカチオン調整されたミューラーヒントンスープを10ミリリットル加えます。タイムキルシナジー研究の場合、少なくとも1つの薬物は、成長曲線に個別に影響を与えない濃度にする必要があります。これは、シナジー研究の前に個々の薬物濃度の影響を評価することによって決定することができる。最初のチューブに、1ミリグラム/ミリリットルコリスチンストックの10マイクロリットルを加えて、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終的なコリスチン濃度を得る。2つ目のチューブでは、1ミリグラム1ミリリットルのミノサイクリンストックを10マイクロリットル加え、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度を得る。この濃度は、この例で使用されている株に対しても効果がありません。3番目のチューブに、1ミリグラム/ミリリットルミノサイクリンストックの10マイクロリットルと1ミリリットル/ミリリットルコリスチンストックの10マイクロリットルを追加します。これは、チューブ1と2で使用されるコリスチンとミノサイクリンの同じ量です。4本目と5本目のチューブに抗生物質を加えずに。これは、それぞれ成長制御と負のコントロールチューブになります。次に、列1~4列の行BからHに900マイクロリットルの無菌生理食塩水をマルチチャンネルピペットで加えることで、シリアル希釈用の2ミリリットルのウェルを備えた96個のディープウェルポリプロピレンプレートを調製します。培養が対数成長期にある場合は、シェーカーから培養管を取り出し、それを穏やかに渦液にします。1ミリリットルの懸濁液を12〜75ミリメートルのガラス培養チューブに移し、マクファーランドのリーダーで密度を確認します。密度が1.0マクファーランド未満の場合は、チューブをシェーカーに戻し、より長くインキュベートします。1.0 マクファーランドより大きい場合は、カチオン調整されたミューラーヒントンスープをチューブに追加し、渦をそっとボルテックスし、サスペンションが1.0マクファーランドになるまで再サンプリングします。開始接種を準備する際に、文化が対数成長段階にあることが重要です。成長曲線を構築して、生物がこの段階に達した時期を決定できます。その後、1.0マクファーランドサスペンションの100マイクロリットルをチューブ1から4に加え、穏やかに渦を出します。混合直後、2時間、4時間、6時間、24時間で、各培養管から150マイクロリットルのアリコートを取り除き、無菌ピペットチップだけがチューブに入り、アリコート引き出し中に無菌ピペットシャフトが入るようにします。アリコートを、それぞれ、前に準備した96深層プレートの最初の列の連続したウェルに追加する。各時点でアリコートを取り除いた直後に、35°Cのアンビエントエアインキュベーターでシェーカーの試験管ラックにチューブを戻します。マルチチャンネルピペットを使用して、プレートの行Aから100マイクロリットルを取り出し、900マイクロリットルの生理食塩水を含む行Bに追加し、1対10希釈を作成します。溶液を上下に4〜5回ピペットして混ぜ、その後、チップを捨てます。まず、メッキする抗生物質条件と希釈液を持つミューラー・ヒントン寒天プレートにラベルを付けます。次に、ドロッププレート法を使用してコロニーカウント用希釈サンプルをプレートし、超長いチップを備えたマルチチャンネルピペットを使用します。1列目の各ウェルから10マイクロリットルを取り出し、適切にラベル付けされたプレートに慎重に一列に塗布します。すべての行がプレートに分配されるまで続けます。さらに、24時間のタイムポイントで、負のコントロールチューブから直接取り出した10マイクロリットルのドロップを、無菌性をテストするために専用のスポットに配置します。その後、すべてのプレートを反転し、周囲の空気中で摂氏35度で一晩インキュベートします。次に、各領域のコロニー数をカウントし、細胞密度を計算する。二重カウントや欠落したコロニーを避けるために、プレートの逆に細かい先端の永久マーカーでコロニーをマークします。各希釈系列について、3〜30コロニーの滴を特定する。これらの滴にコロニーを数え、希釈係数と共にカウントを記録します。ここに示されているのは、1ミリリットル当たり0〜32マイクログラムの濃度のミノサイクリンを1ミリリットル当たり0〜16マイクログラムの濃度でコリスチンと組み合わせ、大腸菌株に対して試験したチェッカーボードアレイシナジー実験のグリッドです。07 未満の OD600 値を持つウェルは成長を表さないので、赤くシェーディングされ、OD600 値が 07 以上の井戸は成長を表し、緑でシェーディングされます。各薬剤について、最小阻害濃度は細菌の増殖を阻害する薬物の最低濃度である。ミノサイクリンの場合、これは1ミリリットル当たり32マイクログラムであり、コリスチンの場合は1ミリリットル当たり8マイクログラムである。ここではシェーディングは保持されますが、成長が阻害されるウェル内の値は、分数抑制濃度(FIC)のインデックス値に置き換えられます。各井戸では、各薬物のFIC指数は、その中の抗生物質の濃度を薬物の最小阻害濃度で除くことによって計算される。FIC指数が0.5以下のウェルは、シナジーのカットオフと見なされ、破線の境界線で示され、最も低いFIC指数を持つ井戸は太字で示されます。最小FIC値は相乗的範囲にあるため、この組み合わせは相乗的であると考えられる。成長が阻害される最小FIC指数が1であり、0.5を超える場合として、相乗効果を発揮しない場合の例を示します。最後に、この例では、いくつかのスキップされた井戸が発生し、これは、抗生物質の濃度が高い隣接する井戸に細菌増殖が存在するにもかかわらず、阻害される細菌の増殖を表す。チェッカーボード配列で複数のスキップがうまく発生した場合、結果は破棄され、アッセイは繰り返されます。タイムキル相乗計アッセイの結果を示すグラフの例をここに示す。タイムキルシナジーアッセイの解釈の詳細については、付随するテキストプロトコルを参照してください。相乗的な組み合わせの活性に関するさらなる情報は、薬物動態および薬力学の評価および動物モデルとのインビボ研究を通じて得ることができる。細菌を扱う場合は、個人保護具の使用を含め、常に適切な安全手順に従ってください。エアロゾルを生成したり、危険度の高い病原体を使用する場合は、バイオセーフティキャビネットですべての作業を行います。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

マイクロタイタープレート形式で液体希釈法により、第一、第二ラインの薬のための結核菌の複合体の抗菌薬感受性試験

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

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無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 H NMR分光法

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

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Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

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プロデュース上皮損傷の解析<em&gt;赤痢アメーバ</em&gt;感染症

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

ザ<em&gt; ex vivoで</em&gt;コロン器官培養および抗菌生体防御研究におけるその使用

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

印刷された糖鎖の配列: 小動物対策炭水化物抗体のレパートリーの分析のための高感度な技術

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

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自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカー ボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果

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