Name: antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Thea Brennan-Krohn ble støttet av en Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og menneskelig utvikling pediatric smittsomme sykdommer forskning trening grant (T32HD055148), National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer trening grant ( T32AI007061), en Boston Children's Hospital Office av fakultetet utvikling fakultetet karriereutvikling fellesskap, og en National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer karriere development award (1K08AI132716). J.E.K. ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer i National Institutes of Health prisen nummer R33 AI119114. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae:+Biology,+epidemiology,+and+management.">Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).</li><li>Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+antibiotics.">The future of antibiotics.</a> Critical Care. 18 (3), (2014).</li><li>Spellberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemic+of+antibiotic-resistant+infections:+a+call+to+action+for+the+medical+community+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).</li><li>Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+antibiotic+synergy+for+polymyxin+B-resistant+carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).</li><li>Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+dual+carbapenem+combinations+against+carbapenemase-producing+Enterobacteriaceae.">In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).</li><li>Zusman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+of+in+vitro+synergy+of+polymyxins+and+carbapenems.">Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).</li><li>Clock, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+doripenem+alone+and+in+multi-agent+combinations+against+extensively+drug-resistant+Acinetobacter+baumannii+and+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).</li><li>Hirsch, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antimicrobial+combinations+for+Klebsiella+pneumoniae+carbapenemase-producing+K.+pneumoniae.">Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).</li><li>T&#228;ngd&#233;n, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+double-+and+triple-antibiotic+combinations+for+VIM-+and+NDM-producing+klebsiella+pneumoniae+by+in+vitro+time-kill+experiments.">Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).</li><li>Tascini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activity+of+colistin+plus+rifampin+against+colistin-resistant+kpc-producing+klebsiella+pneumoniae.">Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).</li><li>Paul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+carbapenem-resistant+Gram-negative+bacteria.">Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).</li><li>Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+for+treating+carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae.">Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verification+of+an+automated,+digital+dispensing+platform+for+at-will+broth+microdilution-based+antimicrobial+susceptibility+testing.">Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).</li><li>Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+Synergistic+Activity+of+Antimicrobial+Combinations+Against+Carbapenem-Resistant+Enterobacteriaceae+Using+Inkjet+Printer-Based+Technology.">Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology.</a> J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).</li><li>Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Activity+of+Colistin-Containing+Combinations+against+Colistin-Resistant+Enterobacteriaceae.">Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin:+The+Revival+of+Polymyxins+for+the+Management+of+Multidrug-Resistant+Gram-Negative+Bacterial+Infections.">Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).</li><li>Nation, R. L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+in+the+21st+century.">Colistin in the 21st century.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).</li><li>Ah, Y. -. M., Kim, A. -. J., Lee, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+resistance+in+Klebsiella+pneumoniae.">Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).</li><li>Bratu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae+in+Brooklyn,+NY:+Molecular+epidemiology+and+in+vitro+activity+of+polymyxin+B+and+other+agents.">Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).</li><li>Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+plus+imipenem,+meropenem,+or+tigecycline+against+KPC-2-producing+Enterobacteriaceae+with+high+MICs+for+these+antimicrobials.">In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).</li><li>MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+methodology+and+implementation+of+a+semiautomated+serial+dilution+microtechnique+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing.</a> Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).</li><li>Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poisoned+well:+Enhancing+the+predictive+value+of+antimicrobial+susceptibility+testing+in+the+era+of+multidrug+resistance.">The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , (2018).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , (2018).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), 7 (1999).</li><li>Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+drop+plate+technique+for+bacterial+enumeration+by+parametric+and+nonparametric+tests.">Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests.</a> Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+6x6+drop+plate+method+for+simultaneous+colony+counting+and+MPN+enumeration+of+Campylobacter+jejuni,+Listeria+monocytogenes,+and+Escherichia+coli.">A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli.</a> Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).</li><li>Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Inoculum+and+Activity+in+AmpC-+and+Extended-Spectrum+(ESBL)-Producing+Escherichia+coli+and+Klebsiella+pneumoniae+Clinical+Isolates+Tested+by+Using+NCCLS+ESBL+Methodology.">Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inoculum+Effect+in+the+Era+of+Multidrug+Resistance:+Minor+Differences+in+Inoculum+Have+Dramatic+Effect+on+Minimal+Inhibitory+Concentration+Determination.">The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+Testing:+Broth+Microdilution+Checkerboard+and+Broth+Macrodilution+Methods.">Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Kill+Assay+for+Determining+Synergy.">Time-Kill Assay for Determining Synergy.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Hindler, J. A., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+MIC+variability+by+method+for+contemporary+clinical+isolates+of+multidrug-resistant+gram-negative+bacilli.">Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).</li><li>Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+add+or+not+to+add+Polysorbate+80:+Impact+on+colistin+MICs+for+clinical+strains+of+Enterobacteriaceae+and+Pseudomonas+aeruginosa+and+quality+controls.">To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).</li><li>Fuchs, P. C., Barry, a. L., Brown, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+testing+quality+control+studies+with+fosfomycin+tromethamine.">Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine.</a> European journal of clinical microbiology &amp; infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+Bactericidal+Concentration+Testing.">Minimum Bactericidal Concentration Testing.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+in+combination+with+various+antibiotics+against+extensively+drug-resistant+Enterobacter+cloacae+with+decreased+susceptibility+to+polymyxin+B.">In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).</li><li>Bulman, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin+combinations+combat+Escherichia+coli+harboring+mcr-1+and+blaNDM-5:+Preparation+for+a+postantibiotic+Era.">Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era.</a> mBio. 8 (4), (2017).</li></ol>

D300 Digital Dispenser og tilknyttede forbruksvarer ble levert av Tecan (Morrisville, NC). Tecan ikke hadde noen rolle i studien design, data samling/tolkning, manuskriptet forberedelse eller beslutning om å publisere.

De to metodene beskrevet her gir begge informasjon om aktiviteten av poesi aksent i kombinasjon i forhold til deres individuelle aktivitet. Automatisert inkjet-skriver-assistert digitale dispensing metoden er en tilpasning av metoden beskrevet i klinisk mikrobiologi prosedyrer Handbook33, mens metoden tid-kill følger nærmere tilsvarende protokollen fra samme referere til34.
I metoden sjakkbrett matrise beregninger for å fastslå den nødvendige mengden antimikrobielle lager til hver brønn og utlevering av disse volumene er automatisert, dermed eliminere noen av de store potensielle kildene til feil i en manual Sjakkbrett matrise. Det er fortsatt viktig, men at etterforskeren bestemmer at opprinnelige aksjer er gjort på den tiltenkte konsentrasjonen og at målet siste konsentrasjoner er angitt i D300 programvaren riktig. Legge til antimikrobielle suspensjon brønner i en 384-vel plate kan være utfordrende først og krever omsorg for å sikre at pipette tips angir passende brønnene og at væske splash opp ikke kantene av brønnene. En automatisert flytende behandling kan brukes i stedet for en håndholdt flerkanals pipette for å øke hastigheten og nøyaktigheten som bakteriell suspensjon legges til brønner. Som beskrevet i protokollen, må D300 surfactant, polysorbat 20 (P-20), for riktig flytende håndtering. En annen surfactant, polysorbat 80, i en konsentrasjon av 0,002%, har vært nevnt for å senke colistin mikrofoner for organismer med colistin mikrofoner av < 2 µg/mL i standard kjøttkraft microdilution analyser. 35 , 36 vårt laboratorium tidligere viste at P-20 i konsentrasjoner til 0.0015% hadde ingen effekt på D300-assistert MIC resultater i sammenligning med referanse BMD14. I eksemplet analysen presenteres her, er den maksimale P-20 konsentrasjon er 0.0014%.
Et problem vi møtte med noen sjakkbrett matrise analyser var et stort antall hoppet over brønner. Dette skjedde på en uforholdsmessig hastighet med enkelte antibiotika. Spesielt i skjermen kombinasjoner mot en samling av carbapenem-motstandsdyktig Enterobacteriaceaefant vi at mens 49 521 forsøk (9,4%) ble ødelagt på grunn av flere hoppet over brønner, 2 av 12 antibiotika testet (fosfomycin og cefepime) sto for 46 av disse rettssaker (94%). Slike økte priser kan være mer sannsynlig i medisiner som er spesielt utsatt for inoculum effekt31,32,37. Av notatet anbefaler ikke CLSI testing fosfomycin i kjøttkraft fortynning25 bekymringer om pålitelighet resultatene med denne metoden, som kan forklare upålitelige resultatene sett med dette stoffet. Noen endringer kan gjøres til automatiske sjakkbrett metoden i henhold til etterforsker preferanser. Poesi aksent kan bli utlevert til plater allerede inneholder bakteriell suspensjon, og ikke i tomme brønner, hvis dette er å foretrekke av arbeidsflyten laboratoriet. Mens 384-vel platene ble brukt her, kan metoden også bæres i 96-brønnen plate analyser med riktig endring av godt volum. Bruk av en 96-brønns plate format kan hjelpe redusere hoppet over brønner for antibiotika som er spesielt følsomme for små endringer i inoculum. Når du beregner FICjeg, kan det være situasjoner der MIC av skala (dvs., høyere enn testet), inkludert situasjoner hvor stoffet blir testet har ingen aktivitet individuelt mot av organismen testes. I disse tilfellene kan FIC beregnes basert på antar MIC er en fortynning høyere enn den høyeste konsentrasjonen testet. Dette er den mest konservative strategien, som det antas at maksimal mulig FIC verdien for alle fortynning der hemming er observert under synergi testing. For eksempel hvis faktiske MIC var to dobling fortynninger over den høyeste konsentrasjonen testet, og de tilsvarende FICs ville være to ganger lavere enn konservative tildelinger og så videre.
For å nøyaktig vurdere bakteriedrepende aktiviteten av stoffer i en tid-kill analysen, er det viktig at kulturer være i logaritmisk-fase vekst, spesielt når celleveggen aktive antibiotika blir testet28. For raskt voksende bakterier brukes i dette eksemplet (K. pneumoniae), 3 timers inkubasjon med skjelvende var riktig å nå denne vekstfase, men forskjellige mengder tid kan være nødvendig for ulike organismer. Generelt, skal kultur vises tydelig, men ikke tungt grumset. Riktig mengde tid kan bestemmes ved å opprette en vekstkurve med kolonien teller tatt på seriell tid poeng (f.eks enhver 30 min 4-6 h)38. Den tiltenkte starter inoculum i tid-kill studien er også viktig. Målet konsentrasjonen av den første inoculum er ca 5 x 105 til 1 x 106 CFU/mL. Fortynning beskrevet her (100 μL av en 1,0 McFarland suspensjon i 10 mL av media) genererer denne inoculum for Klebsiella pneumoniae og andre Enterobacteriaceae arter som vi har testet den. Hvis tettheten av de første inocula i et eksperiment ved hjelp av ulike organismer er betydelig høyere eller lavere enn dette, kanskje så en annen fortynning behøves. (Riktig fortynning kreves for artene kan bestemmes ved å utføre plate antall en 0,5 eller 1.0 McFarland suspensjon å bestemme hvor mange organismer denne turbiditet representerer, deretter beløpet som første suspensjon må være utvannet for å nå riktig siste konsentrasjonen.) Hvis, på gjennomgang av platen teller fra synergi studien, den første inoculum av antibiotika inneholder rør er funnet å ha vært betydelig lavere enn de første inoculum i kontrollen vekst, kan det tyde begge antibiotika carryover eller svært rask drepe bakterier i kort tid mellom tillegg bakterier mot antibiotika inneholder røret og fjerning av aliquot for plating. Hvis det faktiske antallet koloniene i ufortynnet fall i en serie er lavere enn koloniene i påfølgende fortynninger, foreslår dette antibiotika carryover effekt. Ulike alternativer er beskrevet for å hindre denne effekten, inkludert sprer en enkelt aliquot over en hel tallerken38 eller spinne ned prøven, fjerne nedbryting og å suspendere i sterilt saltvann før plating39. På hvert punkt i metoden tid-kill er det også avgjørende for etterforsker effektivt men nøyaktig fjerne en aliquot fra hver kultur rør og utføre føljetong fortynninger. Forsinkelser under denne prosessen, spesielt i løpet av tidlig tidspunkt som oppstår i nær hverandre, kan føre til lengre perioder der kulturer ikke er er ruges og ristet, mens uforsiktig dispensing og føljetong fortynninger kan føre til unøyaktige plate teller. Slipp plate metoden beskrevet i forhold til spredning plate metoden for plate teller, der 100 μL av hver fortynning er spredt over en hel agar plate, er langt mer rask, krever en mye mindre antall agar plater, og gir raskere teller, som maksimum countable antall koloniene for hver dråpe er 30, mens opp til 300 kolonier kan vanligvis regnes fra en spredning plate. Men er metoden spredning plate også et alternativ hvis etterforskere er mer komfortabel med denne teknikken. Hvis dråper spredt i hverandre etter dispensing med en flerkanals pipette, utføres personlige anvendelsen av mer avstand dråper med en enkanals pipette i stedet. I vår erfaring syntes kjøling plater på 4 ° C før utlevering drops å redusere overdreven spre.
En begrensning teknikkene som beskrives her er at resultatene av de to typene synergi analysen (sjakkbrett matrise og tid-kill) er ikke alltid overensstemmende, og siden mest publiserte synergi artikler bruker en metode eller andre stedet begge sammen, kan det være vanskelig å vite hvor å integrere data fra to typer analyser. Fordi metoden for automatiske sjakkbrett-matrise vi utviklet er enkel og høy gjennomstrømming, vi har brukt det i praksis som en slags skjermen å teste kombinasjoner mot et større antall isolerer og avgjøre hvilke konsentrasjon kombinasjoner var synergistisk. Vi har utført et mindre antall tid-kill studier, velge kombinasjoner og konsentrasjoner som hadde vært effektiv i sjakkbrett matrisen. Av notatet, fordi sjakkbrett analysen utføres vanligvis i microbroth fortynning skala, mens tid-kill analysen bruker større volumer (ligner på en macrobroth fortynning), fant vi at FICs var noen ganger annerledes mellom de to metodene, med høyere konsentrasjoner vanligvis nødvendig i tid-kill analysen å demonstrere aktivitet. Dette fenomenet har vært nevnt tidligere når macrobroth og microbroth fortynning MIC analyseresultatene sammenlignes for Gram-negative bakterier26 og når større inocula (som brukes i tid-kill studier) sammenlignes med den standard inoculum som brukes i microbroth fortynning og sjakkbrett utvalg søk32. En bestemt begrensning av sjakkbrett matrisen er iboende variasjon i microbroth fortynning MIC tester22. Mens FICjeg konsentrasjon synergi konto for denne variasjonen matematisk6 slik variasjon uunngåelig reiser bekymring pålitelighet og konsekvens av sjakkbrett matrise resultater.
Resultatene av disse metodene må bekreftes på grunn av begrensninger knyttet til alle i vitro synergi testmetoder (inkludert dyrking av bakterier i en kunstig vekst medium, statisk antibiotikumet konsentrasjonene og en begrenset tid selvfølgelig), og Videre evalueres ved hjelp av flere teknikker. Slike metoder omfatter i vitro farmakokinetiske/Farmakodynamiske (PK/PD) studier (f.eks, hul fiber infeksjon modell40), dyr modeller, og til slutt, menneskelige PK/PD og effekt studier. Automatiske sjakkbrett matrise metoden beskrevet her, ved å gi en rask metode som skjermen kombinasjoner for potensielle samvirkningen, gjør det mer målrettet utnyttelse av disse teknikkene. Videre automatisering av alle disse metodene, som vel som mer systematisk undersøkelse av forholdet mellom i vitro parametere og kliniske utfall, vil være viktig å skalere opp bruk av synergi testing og øke brukbarheten klinisk.

Spredning av multidrug-resistente (MDR) bakteriell patogener, spesielt MDR Gram-negative bakterier som carbapenem-resistente Enterobacteriaceae (Grobunn), har forlatt klinikere med stadig mer begrensede muligheter for vellykket anti-infective terapi 1, et problem forverret av treg tempoet roman antibakterielle stoff oppdagelsen2,3. Antimikrobielle synergi, der to stoffene i kombinasjon øve en større-enn-additiv effekt, gir mulighet for hevingen eksisterende antibiotika for bruk i behandling av MDR bakterier, selv når disse bakteriene er motstandsdyktig mot en eller begge av de antibiotika individuelt. Teknikkene som beskrives i denne artikkelen gir utfyllende metodene i vitro synergi tester som, når de brukes sammen, spesialopplæring for etterforskere slik effektivt skjermen antimikrobielle kombinasjoner av interesse for bevis på samvirkningen (den automatiserte Sjakkbrett matrisemetode) og så videre evaluere the kinetics av hemming og drap demonstrert av lovende kombinasjoner i screening scenen (manuell tid-kill-metoden).
En av de mest brukte metodene i vitro synergi testing er sjakkbrett array analysen, en endring av minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testing som hemmende aktiviteten til to forskjellige antibiotika mot en bakteriell isolere testes over en rekke konsentrasjon kombinasjoner4,5. Hvis de to stoffene utøve større enn additiv aktivitet når de brukes sammen, regnes kombinasjonen synergistisk6. Imidlertid innebærer sette opp et sjakkbrett utvalg manuelt en rekke beregninger og utvannende og pipettering trinnene som er arbeidskrevende og sårbare for menneskelige feil. Disse betingelsene har hatt effekt av å begrense bruken av synergi testing hovedsakelig til retrospektiv evalueringen av liten numrene av antibiotika kombinasjoner og bakteriell isolerer og resultatene har ikke alltid vært konsekvente blant studier7, 8,9,10,11. Videre har kompleksiteten i synergi testing bidratt til sin utilgjengelighet i klinisk mikrobiologi og i fravær av i vitro synergi tester data fra kliniske studier kombinasjon terapi12, 13.
For å øke effektiviteten og gjennomstrømningen av metoden sjakkbrett matrise, gjort vi bruk av et automatisert MIC tester teknikk utviklet i vårt laboratorium som bruker blekk trykking teknologien å nøyaktig og konsekvent dispensere små volumer plate14av antibiotika lagerløsning i brønner i en microtiter. Plattformen obviates behovet for komplekse beregninger og flere pipettering trinn. Den tilknyttede programvaren beregner og dispenses passende mengder antibiotika for å opprette en todimensjonal sjakkbrett matrise hvis brukeren bare innganger området ønsket konsentrasjon og lagerløsning konsentrasjon av antibiotika. Vi testet først denne metoden mot en samling av Grobunn isolerer15 og senere har fokusert på testing colistin inneholder kombinasjoner for aktivitet mot colistin-resistente isolerer16. Colistin er et stoff som siste utvei vanligvis reservert for bruk i behandlingen av MDR Gram-negative patogener17,18, og colistin gjør allerede MDR bakterier nesten pan-resistente19, noe som gjør dem ideelle kandidater til utviklingen av romanen strategier bruker narkotika som de er ufølsomme individuelt. Vi fant at kombinasjonen av colistin og protein syntese hemmer antibiotika minocycline hadde en meget høy rate av synergi, selv mot stammer som var resistente mot hver av disse stoffene, antagelig fordi colistin har en subinhibitory permeabilizing effekt på selv colistin-resistente bakterier. Vi har valgt denne kombinasjonen å bruke som et eksempel i denne artikkelen. Av notatet, kan synergi testing også brukes til å vurdere for forbedret effekten av to stoffene som begge effektiv individuelt.
Automatiske sjakkbrett matrise metoden muliggjør rask, høy gjennomstrømming synergi testing. Men har metoden sjakkbrett matrise begrensninger. Som en modifisert MIC analysen, det gir data bare på hemming av bakterievekst og ikke drepe, og det gir ikke data på antibiotika effekter over tid. Derimot manuell ytelsen til tid-kill synergi analyser er mer arbeidsintensiv, men gir informasjon om både hemming og drap over 24 h klokkeslett kurs20,21. Vi brukte tid-kill analyse på et mindre antall isolerer å bekrefte vår sjakkbrett matrise resultater og å finne ut om synergistisk kombinasjonene vi identifisert var også bakteriedrepende.
Både sjakkbrett matrise og tid-kill synergi metoder gir verdifull informasjon om aktiviteten på rusmiddelkombinasjoner, og er spesielt nyttige i å vurdere potensielle romanen behandlingsalternativer for svært motstandsdyktig bakteriell patogener. Metodene har iboende begrensninger. Standard microbroth fortynning MIC metoden har mange kjente forventet feil 1 todelt fortynning22, som øker når to stoffer er testet sammen i et sjakkbrett array. Standard definisjon av synergi, som vurderer en kombinasjon synergistisk hvis narkotika er aktive sammen på en fjerdedel deres respektive mikrofoner6, tar hensyn til dette forventet variasjon, men slike variasjoner (som antas å resultere fra en kombinasjon av biologiske og tekniske svingninger23) uunngåelig genererer usikkert om påliteligheten til synergi resultater. Mangel på etablerte kvalitetskontroll standarder for synergi testing er også en gjeldende begrensning. Kanskje er den viktigste begrensningen av alle synergi testmetoder mangel på etablerte sammenhenger mellom i vitro resultater og kliniske utfall når kombinasjoner brukes til å behandle pasienter24. Enklere og raskere synergi testing metoder, for eksempel automatisert sjakkbrett matrise metoden beskrevet her, kan lette integrasjon i vitro synergi testing i kliniske studier eller andre vurderinger av pasientens utfall for å bedre beskrive forholdet mellom i vitro og in vivo effekter i fremtiden.
Automatiske sjakkbrett matrise metoden som vi presenterer her tilbyr et alternativ for høy gjennomstrømming screening av en rekke kombinasjoner og gir mulighet for rask vurdering av uvanlig, "høy risiko-høy belønning" kombinasjoner uten en større investering av tid og ressurser. Metoden tid-kill, som vi senere viser, kan gi støttende tilleggsinformasjon om samvirkningen av kombinasjonen og kan bidra til å karakterisere den bakteriedrepende aktivitet og antibakterielle kinetics.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain ATCC 25922</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>25922</td>
			<td>QC strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L 0.22 &#181;m bottle-top filter</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>597-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R01620 or R04050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2011-25150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-566-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>222-8032-01R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation adjusted Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control Software</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DensiCHEK Plus McFarland reader</td>
			<td>bioM&#233;rieux</td>
			<td>21250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long SHARP 10 &#181;L Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 digital dispenser</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 T8+ cassettes</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td>30097370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minocycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>14302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12-channel 10-300 &#181;L pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP-337</td>
			<td>Brand name: Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xplorer 12-channel 50-1200 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000328</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method

Som priser multidrug-resistente (MDR) patogener fortsetter å stige, outpacing utviklingen av nye hemmestoffer, blir stadig mer romanen tilnærminger til behandling av MDR bakterier en nødvendighet. En slik tilnærming er Kombinasjonsbehandling, i som to eller flere antibiotika brukes sammen til å behandle en infeksjon mot en eller begge av narkotika kan være ineffektiv alene. Når to stoffer, i kombinasjon, utøve større enn additiv effekt, de anses synergistisk. In vitro undersøkelse av samvirkningen er et viktig første skritt i å vurdere mulige effekten av rusmiddelkombinasjoner. To viktigste i vitro synergi testmetoder er utviklet: sjakkbrett matrisen og tid-kill studien. I dette papiret, vi presentere en automatisert sjakkbrett matrisemetode som gjør bruk av blekk trykking teknologien for å øke effektivitet og nøyaktighet av denne teknikken, i tillegg til standard manuell tid-kill synergi metode. Automatiske sjakkbrett matrisen kan tjene som en høy gjennomstrømming screening analysen, mens manuelle tid-kill studien gir ekstra, utfyllende data om samvirkningen og drap.
Sjakkbrett matrisen er en modifikasjon av standard minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC) testing, hvor bakterier inkubert med antibiotika på ulike konsentrasjon kombinasjoner og vurdert for vekst hemming etter overnatting inkubasjon. Manuell ytelse i sjakkbrett matrisen krever en arbeidskrevende og feilutsatte rekke beregninger og fortynninger. I det automatiserte metoden presenteres her, beregning og utlevering av nødvendige antibiotika lagerløsning volumer er automatisert gjennom bruk av inkjet-skriverteknologi. I tid-kill synergi analysen, er bakterier inkubert med antibiotika interesse, både sammen og individuelt og samplet i intervaller i løpet av 24 timer for kvantitative kultur. Resultatene kan avgjøre om en kombinasjon er synergistiske og om det er bakteriedrepende og gi data på hemming og drap av bakterier over tid.

Figur 1A presenterer et rutenett fra et sjakkbrett matrise synergi eksperiment i hvilket minocycline i konsentrasjoner på 0-32 μg/mL kombinert med colistin i konsentrasjoner av 0-16 μg/mL og testet mot E. coli belastning FDA-CDC 0494. Verdiene representerer Spektrofotometri opplesninger ved optisk densitet 600 nm (OD600). Brønner med OD600 verdier under 0,07 (som tilsvarer ingen vekst av visuell inspeksjon) er skyggelagt rød, mens brønner med OD600 verdier 0,07 (som tilsvarer vekst av visuell inspeksjon) er skyggelagt grønn. For hvert legemiddel er på minimum inhibitoriske konsentrasjon (MIC, uthevet) den laveste konsentrasjonen av stoff som hemmer bakterievekst. For minocycline, dette er 32 μg/mL, og colistin, er det 8 μg/mL. Skyggeleggingen beholdes i figur 1B, men verdiene i brønnene som veksten er hemmet, erstattes av brøk inhibitoriske konsentrasjon indeks (FICjeg) verdier. Disse bestemt som følger: i hver brønn, fractional inhibitoriske konsentrasjon indeksen (FIC) av hvert legemiddel beregnes ved konsentrasjonen av antibiotika i det godt med stoffets MIC, og at FICjeg beregnes ved å summere de to FICs. Brønner med FICjeg verdien 0,5, som er ansett som cut-off etter synergi, angis med en delt kantlinje, og brønnen med lavest FICjeg verdi (0.094) er uthevet. FICjeg minimumsverdien er i synergistisk området, anses kombinasjonen synergistisk.
Figur 2A og 2B figur viser rutenett slik som i figur 1A og figur 1B, men i dette tilfellet kombinasjonen har ikke viser synergi mot isolere testet (K. pneumoniae isolere BIDMC 4), fordi den minimum FICjeg som veksten hemmes er 1, som er > 0,5.
Figur 3 viser optisk densitet målinger fra et sjakkbrett synergi rutenett der flere hoppet over brønner oppstod (Enterobacter cloacae komplekse isolere BIDMC 27). Hoppet over brønner er brønner som bakteriell vekst er hemmet tross av tilstedeværelsen av bakterievekst i tilstøtende brønner med høyere konsentrasjoner av antibiotika. Dette fenomenet, som er kjent for å oppstå i standard MIC tester også, skyldes dette sannsynligvis biologisk variasjon i bakterievekst egenskaper fra godt til vel og til følsomheten til noen antibiotika til små forskjeller i bakteriell inoculum23 , 31 , 32. Hvis mer enn én hoppet også skjedde i et sjakkbrett array, vi forkastet resultatene og gjentatt analysen.
Figur 4 presenterer eksempler på tid-kill synergi resultatene av tre kombinasjoner testet mot K. pneumoniae isolere BIDMC 32. Kolonien teller angis i en logaritmisk skala på y-aksen og tid, i timer på x-aksen. Forskjellen mellom den første inoculum i røret som inneholder legemidlet kombinasjonen og konsentrasjonen av bakterier i at tube på 24 h er illustrert av den røde linjen og tall, mens forskjellen mellom konsentrasjonen av bakterier på 24 h mellom røret inneholder kombinasjonen og røret som inneholder den mest aktive enkelt agenten alene er illustrert av den blå linjen og antallet. Figur 4A viser resultater fra kombinasjonen av colistin og minocycline; denne kombinasjonen var synergistisk (forskjell mellom konsentrasjoner av bakterier utsatt kombinasjon og mest aktive agent alene ≥2 Logg10 CFU/mL på 24 h) og bakteriedrepende (nedgang starter inoculum til konsentrasjon på 24 h ≥3 Logg10 CFU/mL). Figur 4B viser resultater fra kombinasjonen av colistin og clindamycin, en kombinasjon som var synergistisk men var ikke bakteriedrepende. Denne kombinasjonen hemmet veksten av bakterier, som verken narkotika gjorde alene, men ikke drepe dem. Figur 4C viser resultater fra kombinasjonen av colistin og erythromycin, som var bakteriedrepende verken synergistisk.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg"> Figur 1: Sjakkbrett array resulterer demonstrere synergi (minocycline + colistin testet E. coli belastning FDA-CDC 0494). (A) Spektrofotometri avlesning og vekst tolkning av et sjakkbrett utvalg. Verdiene i cellene er optisk densitet målinger på 600 nm (OD600). Celler med OD600 verdier under 0,07 (tilsvarende ingen vekst av visuell inspeksjon) er skyggelagt rød, mens celler med OD600 verdier 0,07 (tilsvarende vekst av visuell inspeksjon) er skyggelagt grønn. (B) Fractional inhibitoriske konsentrasjon (FICjeg) indeksberegning. Skyggelegging viser vekst eller ingen vekst har blitt beholdt. Verdier for colistin og minocycline langs x- og y-akser, henholdsvis nå representerer Brøkdelen inhibitoriske konsentrasjon (FIC) eller forholdet mellom konsentrasjonen av stoffet i kolonnen eller raden minimum inhibitoriske konsentrasjon ( MIC) av at stoffet alene. Verdien i hver celle er den FICjegeller summen av FICs av to narkotika i at godt. Den store ødelagte line-grenser boksen omslutter brønner med en FICjeg på 0,5. Tykk-grenser cellen angir brønnen med den laveste FICjeg der veksten er hemmet, eller den minste FICjeg. Den minste FICjeg er 0,5, anses kombinasjonen synergistisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg"> Figur 2: Sjakkbrett matrise resultater en kombinasjon som ikke viser synergi (minocycline + colistin testet mot K. pneumoniae isolere BIDMC 4). (A) optisk densitet på 600 nm og vekst tolkning av sjakkbrett matrise resultater som figur 1A. (B) Fractional inhibitoriske konsentrasjon (FICjeg) indeksberegning som figur 1A. Fordi den minste FICjeg > 0,5 kombinasjonen er ikke vurdert synergistisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg"> Figur 3: Sjakkbrett matrise resultater som er uninterpretable grunn utelatt brønner (minocycline + colistin testet mot Enterobacter cloacae komplekse isolere BIDMC 27). Optisk densitet på 600 nm og vekst tolkning av sjakkbrett matrise resultater som figur 1A. Flere hoppet over brønner, som bakteriell vekst er hemmet tross av tilstedeværelsen av vekst i tilstøtende brønner med høyere konsentrasjoner av antibiotika, er vist. Resultatene er ikke interpretable, og eksperimenter må gjentas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg"> Figur 4: Tid-kill synergi resultatene av tre kombinasjoner testet mot K. pneumoniae isolere BIDMC 32. Koloni teller angis i en logaritmisk skala på y-aksen og tid, i timer på x-aksen. Forskjellen mellom konsentrasjonen av bakterier i kombinasjonen på 24 h og den starter inoculum i røret er illustrert av den røde linjen og antallet. Hvis nedgangen starter inoculum til konsentrasjon på 24 h er ≥3 Logg10 CFU/mL, vil kombinasjonen anses bakteriedrepende. Forskjellen mellom konsentrasjonen av bakterier på 24 h mellom røret som inneholder kombinasjonen og røret som inneholder den mest aktive enkelt agenten alene er illustrert av den blå linjen og tall. Hvis det er ≥2 Logg10 CFU/mL reduksjon, anses kombinasjonen synergistisk. (A) Colistin (CST) + minocycline (MIN), en kombinasjon som er både synergistiske og bakteriedrepende. (B) Colistin + clindamycin (CLI), en kombinasjon som synergistisk men ikke bakteriedrepende. (C) Colistin + erythromycin (ERY), en kombinasjon som verken synergistisk eller bakteriedrepende. Disse resultatene ble opprinnelig utgitt som en del av en studie av samvirkningen av colistin inneholder kombinasjoner mot colistin mot Enterobacteriaceae, der vi viste at colistin var synergistisk med en rekke antibiotika som er aktive individuelt bare (f.eks clindamycin) eller hovedsakelig (f.eks erythromycin) mot Gram-positive bakteriene16. (Merk at erythromycin var synergistisk med sjakkbrett matrisen mot belastningen vises, men ikke av tid-drepe, så det har blitt valgt som et eksempel på en ikke-synergistisk kombinasjon.) Vi hypotesen at colistin, som er kjent til å handle permeabilization av Gram-negative ytre membranen, har en sub-inhibitory permeabilizing effekt på colistin-resistente Gram-negative bakterier, slik at oppføring av stoffer som clindamycin som normalt kan ikke angi Gram-negative cellen. Panel (A) av dette tallet har blitt endret fra Brennan-Krohn, Pironti og Kirby 201816, copyright © American Society for mikrobiologi, antimikrobielle midler og kjemoterapi, 62(10), 2018, pii: e00873 18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

Antimikrobielle synergi testing brukes til å evaluere effekten av to eller flere antibiotika som brukes i kombinasjon og utføres vanligvis av en av to metoder: sjakkbrett matrisen eller tid-kill analysen. Her presenterer vi en automatisert, inkjet-skriver-assistert sjakkbrett matrise synergi teknikk og en klassisk tid-kill synergi studie.

Antimikrobielle synergi Testing av blekkskriver-assistert automatiske sjakkbrett matrise og metoden for manuell tid-kill

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Manuell kontrollør array synergi testing er en arbeidskrevende og feilutsatt metode. I motsetning til dette forbedrer vår automatiserte blekkskriverbaserte kontrollbrettmetode dramatisk hastighet, nøyaktighet og gjennomstrømming. Den automatiserte sjakkbrettmetoden gjør det mulig å screene et stort antall legemidler for synergistiske kombinasjoner, mens tidsdrapsmetoden kan bekrefte og utforske aktiviteten til disse kombinasjonene ytterligere.Ny antibiotikaoppdagelse holder ikke tritt med spredningen av resistens, men undersøkelsen av synergistiske kombinasjoner gir en mulighet for å redde eksisterende legemidler for å behandle resistente bakterier. Selv om vi demonstrerer denne teknikken med antibakterielle, kan den også brukes med andre klasser av antimikrobielle eller til og med for ulike typer kombinasjonsmedisin eller sammensatt testing. I denne videoen demonstrerer vi en automatisert rutebordmatrisemetode og en manuell tidsdrapsmetode.Vi foreslår at du utfører rutetebordarraystudier først for å identifisere lovende kombinasjoner, og deretter undersøke disse videre med tidsdrapsstudier. Til å begynne med, lage antimikrobielle lagerløsninger av colistin og minocyklin, og utfør deretter kvalitetskontroll på lagerløsningene som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Deretter legger du til omtrent en milliliter med 0,9% natriumklorid, saltvann, til 12-millimeter-by-75-millimeter runde bunnglasskulturrør.Velg en eller to kolonier fra en nattplate med bakterier, og plasser dem i kulturrørene. Vortex rørene forsiktig for å suspendere bakteriene i løsningen. Kontroller konsentrasjonen av bakterier ved hjelp av en McFarland-leser.Juster konsentrasjonen ved å legge til mer saltvann eller flere bakterier for å oppnå en 0,5 McFarland turbiditetsavlesning. Deretter fortynner bakteriene en til 300 ved å legge til 100 mikroliter av suspensjonen til 30 milliliter kationjustert Mueller-Hinton kjøttkraft i et 50-milliliter konisk rør for å nå en endelig celletetthet på fem ganger 10 til de femte kolonidannende enhetene per milliliter. Nå, forberede antimikrobielle for utskrift ved å følge med i den medfølgende tekstprotokollen.Lagre protokollen, og klikk deretter på Kjør-knappen øverst til venstre, etterfulgt av Start-knappen. Legg en 384-brønnsplate i plateholderen, og trykk Lastet under ledeplaten 1 Synergy-ledeteksten. Plasser deretter en T8+kassett i kassettsporet, og trykk Lastet inn under ledeteksten Legg i en T8+kassett.Når du blir bedt om det, tilsett antibiotikalagerløsning i de angitte reservoarene på kassetten. Når hver løsning er lagt til, trykker du på Fylt-knappen. Når D300 Dispenser har lagt til antibiotikalager i passende volumer til hver brønn og Kjør fullført-boksen vises, klikker du Lukk, fjerner platen og slår av D300.Hell deretter den tidligere forberedte bakterielle suspensjonen i et sterilt reagensreservoar. Bruk en flerkanals pipette til å legge til 50 mikroliter av suspensjonen til alle brønnene i sjakkbrettet. Deretter legger du til 50 mikroliter kationjustert Mueller-Hinton-kjøttkraft uten bakterier til en tom brønn.Dette vil være den negative kontrollen godt for å bekrefte sterilitet av media. Inkuber i en 35-graders Celsius omgivelsesluftinkubator i 16 til 20 timer. Følg med i den medfølgende tekstprotokollen for å analysere testen.For tidsdrepe synergitesten, klargjør du igjen de antimikrobielle lagerløsningene som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter gjør en 0,5 McFarland suspensjon av testorganismen i steril saltvann. Tilsett 100 mikroliter av 0,5 McFarland-fjæringen til fem milliliter CAMHB i et 25 ganger 150 millimeter glass rundt bunnkulturrør med lukking i rustfritt stål, og vortex forsiktig for å blande.Ved hjelp av en steril inoculating loop, isolasjon stripe en dråpe av fortynnet suspensjon på en blod agar plate, og inkubere platen på 35 grader Celsius i omgivelsesluft for å bekrefte inokuleum renhet. Bytt ut lukningen på røret, og inkuber den i et reagensrørstativ på en shaker ved 35 grader Celsius i omgivelsesluft i minst 3 timer, til logaritmisk fasevekst er nådd. Mens den første kulturen inkuberer, legg til 10 milliliter kationjustert Mueller-Hinton kjøttkraft til fem autoklaverte glasskulturrør.For en tidsdraps synergistudie bør minst ett stoff være i en konsentrasjon som ikke påvirker vekstkurven individuelt. Dette kan bestemmes ved å evaluere effekten av individuelle legemiddelkonsentrasjoner før synergistudien. Til det første røret, tilsett 10 mikroliter av en mg per milliliter colistin lager for å oppnå en endelig colistin konsentrasjon av ett mikrogram per milliliter, da dette er en konsentrasjon som er ineffektiv mot belastningen som brukes i dette eksemplet.For det andre røret, tilsett 10 mikroliter av ett mg per milliliter minocyklin lager for å oppnå en endelig konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter. Denne konsentrasjonen er også ineffektiv mot belastningen som brukes i dette eksemplet. Til det tredje røret, legg til 10 mikroliter av en mg per milliliter minocyklin lager og 10 mikroliter av en mg per milliliter colistin lager.Dette er den samme mengden colistin og minocyklin som brukes i rør en og to. I fjerde og femte rør, legg til ingen antibiotika. Dette vil være vekstkontroll og de negative kontrollrørene, henholdsvis.Deretter forbereder du 96 dypbrønns polypropylenplater med to milliliter brønner for seriell fortynning ved å tilsette 900 mikroliter steril saltvann til radene B til H av kolonne en til fire med en flerkanals pipette. Når kulturen er i logaritmisk vekstfase, fjern kulturrøret fra shakeren, og virvler det forsiktig. Overfør en milliliter av suspensjonen til et 12-by-75-millimeter glasskulturrør, og kontroller tettheten med en McFarland-leser.Hvis tettheten er mindre enn 1,0 McFarland, returnerer du røret til shakeren og inkuberer lenger. Hvis det er større enn 1,0 McFarland, legg til kation-justert Mueller-Hinton kjøttkraft til røret, vortex forsiktig, og re-sample til suspensjonen er på 1,0 McFarland. Det er viktig at kulturen er i den logaritmiske vekstfasen når du forbereder startinokuset.Du kan konstruere en vekstkurve for å avgjøre når en organisme når denne fasen. Deretter legger du til 100 mikroliter av 1,0 McFarland-fjæringen til rørene en til fire, og virvler dem forsiktig. Umiddelbart etter blanding og på en, to, fire, seks og 24 timer, fjerne en 150-mikroliter aliquot fra hver kultur rør ved å vippe røret slik at bare den sterile pipette spissen kommer inn i røret og ikke unsterile pipettor aksel under aliquot tilbaketrekking.Legg henholdsvis aliquots til påfølgende brønner i første rad av den tidligere forberedte 96 dypbrønnplaten. Returner rørene til et reagensrørstativ på en shaker i en 35-graders Celsius omgivelsesluftinkubator umiddelbart etter å ha fjernet aliquots på hvert tidspunkt. Bruk en flerkanals pipette til å fjerne 100 mikroliter fra rad A av platen, og legg den til rad B, som inneholder 900 mikroliter saltvann, og skaper en 1-til-10 fortynning.Pipette oppløsningen opp og ned fire til fem ganger for å blande, og kast deretter tuppene. Først merke Mueller-Hinton agar plater med antibiotika og fortynning som skal belagt. Deretter plate de fortynnede prøvene for koloni teller ved hjelp av drop plate metoden, ved hjelp av en flerkanals pipette med ekstra lange spisser.Fjern 10 mikroliter fra hver brønn i kolonne en, og dispenser forsiktig på rad på riktig merket plate. Fortsett til alle radene er dispensert på platene. I tillegg, på 24-timers tidspunkt, plasser en 10-mikroliters dråpe tatt direkte fra det negative kontrollrøret på stedet dedikert til dette for å teste for sterilitet.Deretter inverter alle plater, og inkuber dem over natten ved 35 grader Celsius i omgivelsesluft. Deretter teller du antall kolonier på hvert område, og beregner celletettheten. Merk kolonier med en fin-tip permanent markør på baksiden av platen for å unngå dobbelttelling eller manglende kolonier.For hver fortynningsserie, identifiser dråper med tre til 30 kolonier. Tell koloniene i disse dråpene, og registrer tellingen sammen med fortynningsfaktoren. Vist her er et rutenett fra et sjakkbrett array synergi eksperiment der minocyklin i konsentrasjoner på null til 32 mikrogram per milliliter ble kombinert med colistin ved konsentrasjoner på null til 16 mikrogram per milliliter og testet mot en stamme av E.coli.Brønner med OD600-verdier under 07 representerer ingen vekst og er skyggelagt røde, mens brønner med OD600-verdier over eller lik 07 representerer vekst og er skyggelagt grønne. For hvert legemiddel er den minste hemmende konsentrasjonen den laveste konsentrasjonen av stoffet som hemmer bakteriell vekst. For minocyklin er dette 32 mikrogram per milliliter, og for colistin er det åtte mikrogram per milliliter.Skyggeleggingen beholdes her, men verdier innenfor brønnene der veksten hemmes erstattes av fraksjonell hemmende konsentrasjon, eller FIC, indeksverdier. I hver brønn beregnes FIC-indeksen for hvert legemiddel ved å dele konsentrasjonen av antibiotika i det brønnen ved stoffets minste hemmende konsentrasjon. Brønner med en FIC-indeks på mindre enn eller lik 0,5, som regnes som cutoff for synergi, er indikert med en brutt linje, og brønnen med den laveste FIC-indeksen er fet.Fordi den minste FIC-verdien er i synergistisk område, anses kombinasjonen synergistisk. Et eksempel på en sak som ikke viser synergi vises her, da den minste FIC-indeksen der veksten hemmes er en, som er større enn 0,5. Til slutt, i dette eksemplet, skjedde flere hoppet brønner, noe som representerer bakteriell vekst som hemmes, til tross for tilstedeværelsen av bakteriell vekst i tilstøtende brønner med høyere konsentrasjoner av antibiotika.Hvis det oppstod mer enn én hoppet godt i en rutebordmatrise, bør resultatene forkastes og analysen gjentas. Et eksempel på en graf som viser resultater av en tidsdraps synergianalyse presenteres her. Se den medfølgende tekstprotokollen for detaljer om tolkning av den tidsbemannede synergianalysen.Ytterligere informasjon om aktiviteten til synergistiske kombinasjoner kan oppnås gjennom evalueringer av farmakokinetikk og farmakodynamikk og gjennom in vivo-studier med dyremodeller. Følg alltid egnede sikkerhetsprosedyrer, inkludert bruk av personlig verneutstyr, når du arbeider med bakterier. Hvis du genererer aerosoler eller bruker høyrisikopatogener, utfør alt arbeid i et biosikkerhetsskap.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En dag Workflow Scheme for bakteriell deteksjon av patogen og resistensutvikling Testing fra blodkulturer

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Vurdere Nedsatt Metabolske endringer under Progressive Colonization of Germ-free Mouse av 1 H NMR spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multipleks PCR-analyse for typing av stafylokokk Cassette Kromosom Mec Typer I til V i Meticillinresistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse av epitelisk skade produsert av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infeksjon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Høy gjennomstrømning, Real-time, Dual-avlesning Testing av intracellulær antimikrobiell aktivitet og eukaryote celle Cytotoksisitet

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Kultur og dets bruk i Antimicrobial Host forsvarsstudier

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering og karakterisering rensing av makrofager fra vev av fedme-relaterte betennelse

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Utskrevne Glycan matrise: En følsom teknikk for analyse av repertoaret av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer i små dyr

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatisert atferdsdata analyse av store C. elegans bestander bruke et bredt felt-of-view sporing Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...