Name: antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00
Duration: 12 min 3 s
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Thea Brennan-Krohn foi apoiada por uma Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Infectologia Pediátrica desenvolvimento humano pesquisa formação grant (T32HD055148), um Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (de subsídio de formação T32AI007061), bolsa de Hospital escritório da faculdade Faculdade carreira desenvolvimento infantil Boston e o Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas carreira desenvolvimento award (1K08AI132716). J.E.K. foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas dos institutos nacionais de saúde, sob número prêmio R33 AI119114. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

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O distribuidor Digital D300 e consumíveis associados foram fornecidas por Tecan (Morrisville, NC). Tecan não tinha qualquer papel no projeto de estudo, recolha e interpretação de dados, preparação de manuscrito ou decisão de publicação.

Os dois métodos descritos aqui ambos fornecem informações sobre a atividade dos antimicrobianos utilizados em combinação em relação à sua atividade individual. O automatizado, jato de tinta impressora assistida digital método de distribuição é uma adaptação do método descrito no manual de procedimentos de Microbiologia clínica33, enquanto o método kill-tempo segue mais pròxima o protocolo correspondente da mesma referência34.
No método de matriz de tabuleiro de damas, cálculos para determinar o volume necessário de estoque antimicrobiana para adicionar para cada poço, bem como a distribuição desses volumes é automatizada, eliminando assim algumas das principais fontes potenciais de erro encontrado em um manual matriz do tabuleiro de damas. É ainda essencial, entretanto, que o investigador determina que ações originais são feitas na concentração pretendida e que concentrações finais de gol são inseridas o D300 software corretamente. Adicionando suspensão do antimicrobiana para poços de uma placa de 384 pode ser um desafio no início e requer cuidados de garantir essa pipeta dicas entram os poços apropriados e o líquido não molha faz até as bordas dos poços. Um manipulador de líquido automático pode ser usado no lugar de uma pipeta multicanal portátil para aumentar a velocidade e precisão com a qual a suspensão bacteriana é adicionada aos poços. Conforme descrito no protocolo, a D300 requer a adição de tensoativo, polissorbato 20 (P-20), para manipulação de líquidos adequada. Um surfactante diferente, Polissorbato 80, em uma concentração de 0,002%, tem sido observado para abaixar a colistina microfones para organismos com colistina microfones de < 2 µ g/mL em caldo padrão como ensaios. 35 , 36 o nosso laboratório anteriormente demonstrou que P-20 em concentrações até 0,0015% não teve efeito na D300-assistida MIC resultados em comparação com referência a BMD14. No exemplo do ensaio apresentado aqui, a máxima P-20 é concentração é 0.0014%.
Um problema que encontramos com alguns ensaios de matriz de xadrez foi um grande número de poços saltados. Isso ocorreu em uma taxa desproporcional com certos antibióticos. Especificamente, em uma tela de combinações contra uma coleção de resistentes aos carbapenemas Enterobacteriaceae, descobrimos que enquanto 49 de 521 ensaios (9,4%) estava inutilizável devido a vários poços saltados, 2 dos 12 antibióticos testados (Fosfomicina e cefepime) representaram 46 desses ensaios (94%). Tal aumento das taxas pode ser mais provável em drogas que são particularmente suscetíveis ao inóculo efeito31,32,37. Digno de nota, CLSI não recomenda testar Fosfomicina em caldo diluição25 devido a preocupações sobre a fiabilidade dos resultados com este método, o que pode explicar os resultados não-confiáveis vistos com esta droga. Algumas modificações podem ser feitas ao método automatizado quadriculado de acordo com a preferência do investigador. Agentes antimicrobianos podem ser dispensados em chapas já contendo a suspensão bacteriana, ao invés de nos poços vazios, se isso é preferível por motivos de fluxo de trabalho dentro do laboratório. Enquanto placas boas 384 foram usadas aqui, o método também pode ser realizado em ensaios de placa de 96 poços, com modificação apropriada de volume bem. O uso de um formato de placa de 96 poços pode ajudar a reduzir poços saltados para antibióticos que são particularmente sensíveis a pequenas mudanças no inóculo. Ao calcular a FICeu, pode haver situações em que o MIC é fora de escala (ou seja, mais do que testado), incluindo situações onde a droga que está sendo testada não tem atividade individualmente contra o tipo de organismo a ser testado. Nestes casos, a FIC pode ser calculada com base na assumindo que o MIC é uma diluição maior do que a maior concentração testada. Esta é a estratégia mais conservadora, vez que assume o valor FIC máximo possível para qualquer diluição onde a inibição é observada durante o teste de sinergia. Por exemplo, se o MIC real em vez disso foram duas diluições dobra acima maior concentração testada, então os FICs correspondentes seria duas vezes mais baixo do que o conservadoras atribuições e assim por diante.
Para avaliar com precisão a atividade bactericida de drogas em um ensaio de tempo de matar, é essencial que as culturas em fase logarítmica de crescimento, particularmente quando ativo antibióticos parede celular estão sendo testado28. Para que as bactérias de rápido crescimento usadas neste exemplo (K. pneumoniae), 3 horas de incubação com agitação era apropriado para chegar a esta fase de crescimento, mas diferentes quantidades de tempo podem ser necessárias para organismos diferentes. Em geral, a cultura deve aparecer visivelmente mas não fortemente turva. A quantidade adequada de tempo pode ser determinada através da construção de uma curva de crescimento com contagens de colônia tomadas no tempo serial pontos (por exemplo, cada 30 min para 4-6 h)38. O inóculo inicial pretendido no estudo de tempo-mate também é importante. A concentração alvo do inóculo inicial é aproximadamente 5 x 105 1 x 106 UFC/mL. A diluição descrita aqui (100 μL de 1,0 suspensão McFarland em 10 mL de mídia) gera este inóculo para Klebsiella pneumoniae e outras espécies de Enterobacteriaceae em que nós testamos. Se a densidade das partida inóculos em um experimento usando diferentes organismos é significativamente mais alto ou mais baixo do que isso, pode ser necessária uma diluição diferente. (A diluição adequada necessária para uma dada espécie pode ser determinada através da realização de uma contagem de placa de uma suspensão de McFarland 0,5 ou 1,0 para determinar quantos organismos esta turbidez representa, em seguida, calcular o montante pelo qual a suspensão inicial deve ser diluído para atingir a concentração final apropriada). Se, na avaliação das contagens das placas do estudo de sinergia, encontra-se o inóculo inicial de qualquer um dos tubos contendo antibiótico ter sido significativamente menor do que o inóculo inicial do controle de crescimento, isso pode indicar qualquer antibiótico reporte ou muito morte rápida de bactérias no breve tempo entre a adição de bactérias no tubo contendo antibiótico e eliminação da alíquota para o chapeamento. Se o número real de colônias na gota não diluída em uma série é menor que o número de colônias nas diluições subsequentes, isto sugere efeito antibiótico reporte. Diferentes opções têm sido descritas para evitar este efeito, incluindo espalhando uma única alíquota sobre um prato inteiro de38 ou girando a amostra, remover o sobrenadante e re-suspensão em soro fisiológico estéril antes do chapeamento39. Em cada ponto de tempo no método tempo-matar, também é fundamental para o investigador eficientemente, mas com precisão remover uma alíquota de cada tubo de cultura e executar diluições em série. Atrasos durante este processo, particularmente durante os primeiros pontos de tempo que ocorrem em sucessão fechar, podem levar a períodos prolongados, durante o qual as culturas não são foram incubados e abalada, Considerando que o manuseio descuidado e diluições em série podem levar a placa imprecisa conta. Em comparação com o método de placa de propagação de contagem de placa, na qual 100 μL de cada diluição é espalhada sobre uma placa de ágar inteiro, o método de placa de drop descrito é muito mais rápida, exige um número muito menor de placas de ágar e permite a contagem mais rápido, como o máximo número contável de colónias por cada gota é 30, Considerando que até 300 colônias normalmente pode ser contada de uma placa de expansão. No entanto, o método de placa de expansão também é uma opção se os investigadores estão mais confortáveis com esta técnica. Se gotas se espalhou no outro, depois com uma pipeta multicanal de distribuição, pode ser realizada aplicação individual de gotas mais amplamente espaçadas, com uma pipeta de canal único. Em nossa experiência, refrigerar placas a 4 ° C, antes da distribuição de gotas parecia reduzir a propagação excessiva.
Uma limitação das técnicas descritas aqui é que os resultados dos dois tipos de ensaio de sinergia (matriz de tabuleiro de damas e tempo-kill) nem sempre são concordantes, e como mais artigos publicados de sinergia usam um método ou o outro ao invés de ambos juntos, pode ser difícil saber como integrar dados entre os dois tipos de ensaios. Porque o método de matriz de quadriculado automatizado desenvolvemos é simples e elevado-throughput, usamos isso em vigor como uma espécie de tela para testar combinações contra um maior número de isolados e para determinar quais combinações de concentração são sinérgicas. Realizamos então um número menor de estudos... matar tempo, selecionando combinações e concentrações que tinham sido eficazes na matriz do tabuleiro de damas. Digno de nota, porque o ensaio de xadrez geralmente é executado em uma escala de diluição de microbroth, enquanto o ensaio de tempo-mate usa volumes maiores (semelhantes a uma diluição de macrobroth), encontramos que FICs às vezes eram diferentes entre os dois métodos, com maior concentrações geralmente exigidas no ensaio de tempo... matar para demonstrar a atividade. Este fenómeno tem sido observado anteriormente, quando macrobroth e microbroth diluição MIC ensaio resultados são comparados para bacilos Gram-negativos26 e quando inóculos maiores (como usado em estudos de tempo-mata) são comparados com o inóculo padrão usado em matriz de diluição e xadrez microbroth ensaios32. Uma limitação específica da matriz quadriculado é a variabilidade inerente em diluição microbroth MIC teste22. Enquanto FICeu cortes por conta de sinergia para esta variabilidade matematicamente6 tal variabilidade inevitavelmente gera preocupação sobre a confiabilidade e a consistência dos resultados de matriz do tabuleiro de damas.
Devido às limitações inerentes à sinergia tudo in vitro testar métodos (incluindo o cultivo de bactérias em um meio de crescimento artificial, concentrações de antibiótico estáticas e um curso de tempo limitado), os resultados obtidos por esses métodos devem ser confirmados e mais avaliada usando técnicas complementares. Tais métodos incluem estudos in-vitro farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) (por exemplo, a fibra oca infecção modelo40), modelos animais e, finalmente, estudos humanos PK/PD e eficácia. O método de matriz de quadriculado automatizado descrito aqui, fornecendo um método rápido com os quais a combinações de tela para potencial atividade sinérgica, permite mais direcionado a utilização destas técnicas. Ainda mais a automação de todos estes métodos, como a investigação bem como mais sistemática da relação entre parâmetros in vitro e os resultados clínicos, será importante no dimensionamento até o uso de sinergia, testes e aumentando a sua aplicabilidade clínica.

A disseminação de patógenos multirresistentes do bacterianas de (MDR), particularmente MDR bactérias Gram-negativas como Enterobacteriaceae carbapenem-resistente (CRE), deixou os médicos com opções cada vez mais limitadas para a terapia anti-infecciosa sucesso 1, um problema agravado pelo lento ritmo de novela droga antibacteriana descoberta2,3. Antimicrobiana sinergia, no qual duas drogas usadas em combinação exercem um efeito maior do que o aditivo, oferece a possibilidade de salvar os antibióticos existentes para uso no tratamento de bactérias MDR, mesmo quando estas bactérias são resistentes a um ou ambos os antibióticos individualmente. As técnicas descritas neste artigo fornecem dois métodos complementares de sinergia in vitro, teste que, quando usados em conjunto, permitem que os investigadores para eficientemente tela antimicrobiana as combinações de interesse para a evidência da atividade sinérgica (o automatizado método de matriz de quadriculado) e depois ainda avaliar a cinética de inibição e matança demonstrada por combinações promissoras identificadas na fase de triagem (o método manual de tempo-kill).
Um dos métodos mais comumente utilizados de testes in vitro sinergia é o ensaio de matriz do tabuleiro de damas, uma modificação do teste de concentração inibitória mínima (CIM), em que a atividade inibitória de dois antibióticos diferentes contra um bacteriano isolar são testados ao longo de um intervalo de concentração combinações4,5. Se as duas drogas exercem maior atividade aditiva quando usados juntos, a combinação é considerada sinérgicos6. No entanto, configurando uma matriz quadriculado manualmente envolve uma série de cálculos e diluição e pipetagem etapas que são vulneráveis ao erro humano e laborioso. Essas restrições tiveram o efeito de limitar a utilização de testes principalmente para a avaliação retrospectiva de um pequeno número de combinações antibióticas e isolados bacterianos de sinergia, e os resultados não foram consistentes entre estudos7, 8,9,10,11. Além disso, a complexidade dos testes de sinergia tem contribuído para sua indisponibilidade no laboratório de Microbiologia clínica e a virtual ausência de dados de teste in-vitro sinergia de estudos clínicos de terapia de combinação12, 13.
A fim de aumentar a eficiência e a produtividade do método de matriz de tabuleiro de damas, fizemos uso de uma técnica de teste MIC automatizada anteriormente desenvolvida em nosso laboratório que usa a tecnologia de impressão jato de tinta para precisamente e consistentemente dispensar volumes pequenos da solução antibiótica em poços de uma placa de microtitulação14. A plataforma elimina a necessidade de cálculos complexos e várias etapas de pipetagem. O software associado calcula e dispensa volumes adequados de antibióticos para criar uma matriz bidimensional quadriculado, se o usuário simplesmente insere o intervalo de concentração desejada e a concentração da solução das ações dos antibióticos. Inicialmente testamos esse método contra uma coleção de isolados CRE15 e posteriormente concentraram-se em testar combinações contendo colistina para atividade contra isolados resistentes colistina16. Colistina é uma droga de último recurso geralmente reservado para uso no tratamento da resistência MDR patógenos Gram-negativos17,18e colistina já processa MDR bactérias quase panresistente19, tornando-os ideais candidatos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas usando drogas ao qual eles são insensíveis individualmente. Descobrimos que a combinação de colistina e a inibidor de síntese de proteína minociclina antibiótico tinha uma taxa muito alta de sinergia, mesmo contra as estirpes que eram resistentes a cada uma destas drogas individualmente, presumivelmente porque colistina exerce uma subinhibitory permeabilizing efeito sobre bactérias mesmo resistentes a colistina. Escolhemos esta combinação para usar como exemplo neste artigo. Digno de nota, sinergia testes também podem ser usado para a maior eficácia de dois medicamentos que são eficazes tanto individualmente.
O método de matriz de quadriculado automatizado facilita testes sinergia rápida, alta produtividade. No entanto, o método de matriz de xadrez tem limitações. Como um ensaio modificado do MIC, fornece dados somente na inibição do crescimento bacteriano e não na morte, e ele não fornece dados sobre os efeitos de antibióticos ao longo do tempo. Por outro lado, desempenho manual de ensaios de sinergia de vez... matar é mais trabalhoso, mas fornece informações sobre ambos inibição e matança sobre um 24h tempo curso20,21. Nós usamos análise tempo-mate em um número menor de isolados para confirmar nossos resultados de matriz do tabuleiro de damas e para determinar se as combinações sinergéticas identificamos também bactericidas.
Ambos os métodos de sinergia de matriz e tempo-kill quadriculado fornecem informações valiosas sobre a atividade de combinações de drogas e são particularmente úteis na avaliação de potenciais novas opções terapêuticas para patógenos bacterianos altamente resistentes. Os métodos também têm limitações inerentes. O método de diluição MIC microbroth padrão tem uma gama de erro esperada conhecido de 1 dupla diluição22, que é aumentado quando dois medicamentos são testados juntos em uma matriz de tabuleiro de damas. Espera-se a definição padrão de sinergia, que considera que uma combinação sinérgica somente se as drogas são ativas juntos em um quarto seus respectivos microfones6, leva em conta esta variabilidade, mas tal variabilidade (que é pensada para resultar de uma combinação de flutuações biológicas e técnicas23) inevitavelmente gera incerteza sobre a fiabilidade dos resultados de sinergia. A falta de padrões de controle de qualidade estabelecidos para o teste de sinergia é também uma limitação atual. Talvez a mais significativa limitação de todos os métodos de ensaio de sinergia é a falta de estabelecidas correlações entre os resultados in vitro e os resultados clínicos quando as combinações são usadas para tratar pacientes24. Sinergia mais simples e mais rápida testar métodos, como o método de matriz de quadriculado automatizado descrito aqui, pode facilitar a integração de sinergia em vitro testes em ensaios clínicos ou outras avaliações de resultados pacientes a fim de melhor caracteriza a relação entre efeitos in vitro e in vivo no futuro.
O método de matriz de quadriculado automatizado que apresentamos aqui oferece uma opção para seleção da elevado-produção de uma variedade de combinações e permite a avaliação rápida de combinações de "alto risco-alto recompensa" incomum, sem um grande investimento de tempo e recursos. O método tempo-kill, que posteriormente demonstramos, pode fornecer informações adicionais de apoia sobre a atividade sinérgica da combinação e pode ajudar a caracterizar sua atividade bactericida e cinética antibacteriana.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain ATCC 25922</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>25922</td>
			<td>QC strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L 0.22 &#181;m bottle-top filter</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>597-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R01620 or R04050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2011-25150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-566-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>222-8032-01R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation adjusted Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control Software</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DensiCHEK Plus McFarland reader</td>
			<td>bioM&#233;rieux</td>
			<td>21250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long SHARP 10 &#181;L Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 digital dispenser</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 T8+ cassettes</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td>30097370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minocycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>14302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12-channel 10-300 &#181;L pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP-337</td>
			<td>Brand name: Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xplorer 12-channel 50-1200 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000328</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method

Como taxas de patógenos multirresistentes de (MDR) continuam a aumentar, ultrapassando o desenvolvimento de novos antimicrobianos, novas abordagens para o tratamento de bactérias MDR são cada vez mais se tornando uma necessidade. Uma tal abordagem é a terapia de combinação, na quais dois ou mais antibióticos são usados juntos para tratar uma infecção contra qual uma ou ambas as drogas podem ser ineficazes em paz. Quando as duas drogas, em combinação, exercem um maior do que o efeito aditivo, são considerados sinérgicos. Investigações in vitro da atividade sinérgica é um primeiro passo importante em avaliar a possível eficácia das combinações de drogas. Desenvolveram-se dois métodos de teste principal sinergia in vitro: a matriz do tabuleiro de damas e o estudo de tempo... matar. Neste trabalho, apresentamos um método de matriz de quadriculado automatizado que faz uso da tecnologia de impressão jato de tinta para aumentar a eficiência e precisão desta técnica, bem como um método manual padrão tempo matar sinergia. A matriz de quadriculado automatizado pode servir como um ensaio de rastreio com throughput alto, enquanto o estudo de tempo... matar manual fornece dados adicionais, complementares na matança e atividade sinérgica.
A matriz do tabuleiro de damas é uma modificação do padrão concentração inibitória mínima (CIM) ensaios, em que bactérias são incubadas com antibióticos em combinações diferentes de concentração e avaliadas para inibição do crescimento após incubação durante a noite. Desempenho manual da matriz quadriculado requer uma série de cálculos e diluições trabalhosa e propenso a erros. No método automatizado apresentado aqui, o cálculo e distribuição da necessária solução antibiótica volumes são automatizados através do uso de tecnologia de impressão jato de tinta. No ensaio de tempo-matar sinergia, bactérias são incubadas com os antibióticos de interesse, tanto juntos e individualmente e amostradas em intervalos ao longo de 24h para cultura quantitativa. Os resultados podem determinar se uma combinação é sinérgica e seja bactericida e fornecer dados sobre a inibição e matança das bactérias ao longo do tempo.

A figura 1A apresenta uma grade de uma experiência de sinergia de matriz de xadrez no qual minociclina em concentrações de 0-32 μg/mL foi combinado com colistina em concentrações de 0-16 μg/mL e testada contra a estirpe de e. coli 0494 FDA-CDC. Os valores representam as leituras espectrofotométricas em densidade óptica 600 nm (OD600). Poços com valores de600 OD abaixo 0.07 (que corresponde a nenhum crescimento por inspeção visual) são sombreado vermelho, enquanto poços com valores de600 OD 0.07 (que corresponde ao crescimento por inspeção visual) são sombreada verde. Para cada droga, a concentração inibitória mínima (MIC; em negrito) é a menor concentração de fármaco que inibe o crescimento bacteriano. Para minociclina, isto é 32 μg/mL e para colistina, é 8 μg/mL. O sombreamento é retido na figura 1B, mas valores dentro dos poços em que o crescimento é inibido são substituídos por valores de índice (FICeu) concentração inibitória fracional. Estas são determinadas como segue: em cada poço, o índice de concentração inibitória fracional (FIC) de cada droga é calculado dividindo-se a concentração de antibiótico no poço pelo MIC da droga, e a FICeu é calculado somando-se a duas FICs. Poços com um FICeu valor de 0,5, que é considerado o corte de sinergia, são indicados com uma borda de linha quebrada, e o poço com o valor mais baixo FICeu (0.094) está em negrito. Porque o FICeu valor mínimo está na faixa sinérgica, a combinação é considerada sinérgica.
Figura 2A e 2B figura mostram redes análogas às indicadas na figura 1A e figura 1B, mas neste caso a combinação não demonstram sinergia contra o isolado foi testado (K. pneumoniae isolado 4 BIDMC), porque o mínimo FICeu no qual o crescimento é inibido é 1, o que é > 0.5.
A Figura 3 ilustra as leituras da densidade óptica de uma grade de sinergia de xadrez no qual vários poços saltados ocorreram (Enterobacter cloacae complexo isolar BIDMC 27). Saltado poços são poços em que o crescimento bacteriano é inibido apesar da presença de crescimento bacteriano em poços adjacentes com altas concentrações de antibiótico. Este fenômeno, que é conhecido para ocorrer em padrão MIC testing também, é provavelmente devido a variabilidade biológica das características de crescimento bacteriano de bem para bem e para a sensibilidade de alguns antibióticos para pequenas diferenças de inóculo bacteriano23 , 31 , 32. se mais de um ignorado bem ocorreu em uma matriz de tabuleiro de damas, estamos descartados os resultados e repetido o ensaio.
Figura 4 apresenta exemplos de resultados de tempo-matar sinergia das três combinações testadas contra K. pneumoniae isolam BIDMC 32. Colônia contagens são indicadas em uma escala logarítmica no y-axis e tempo, em horas, no x-eixo. A diferença entre o inóculo inicial no tubo que contém a combinação de drogas e a concentração de bactérias naquele tubo em 24h é ilustrada pelo número, enquanto a diferença entre a concentração de bactérias em 24 h entre o tubo e barra vermelha que contém a combinação e o tubo contendo o agente único mais ativo sozinho é ilustrado pela barra azul e número. A figura 4A mostra resultados da combinação de colistina e minociclina; Esta combinação foi sinérgica (diferença entre as concentrações de bactérias expostas a combinação e a mais ativa agente sozinho ≥2 log10 UFC/mL em 24 h) e bactericido (declínio de iniciar o inóculo a concentração às 24h ≥3 log10 CFU/mL). Figura 4B mostra os resultados da combinação de colistina e clindamicina, uma combinação que foi sinérgica, mas não era bactericida. Esta combinação inibiu o crescimento das bactérias, que nem droga fiz sozinho, mas não os mate. A Figura 4 mostra os resultados da combinação de colistina e eritromicina, que não era nem bactericida sinérgica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg"> Figura 1: Matriz de xadrez resultados demonstra sinergia (minociclina + colistina testado contra e. coli estirpe 0494 FDA-CDC). (A) espectrofotométrico interpretação leitura e crescimento de uma matriz de tabuleiro de damas. Os valores nas células são leituras da densidade óptica em 600 nm (OD600). Células com valores de600 OD abaixo 0.07 (correspondente a nenhum crescimento por inspeção visual) são sombreado vermelho, enquanto as células com valores de600 OD 0.07 (correspondente ao crescimento por inspeção visual) são sombreada verde. Cálculo de índice (FICeu) (B) concentração inibitória fracional. Sombreamento, indicando o crescimento ou o crescimento não foi mantido. Valores para colistina e minociclina ao longo de x- e y-eixos, respectivamente, agora representam a concentração inibitória fracional (FIC), ou a relação entre a concentração da droga em que a coluna ou linha para a concentração inibitória mínima ( MIC) daquela droga sozinho. O valor em cada célula é a FICeu, ou a soma das FICs das duas drogas naquele poço. Quebrado faz fronteira com linha caixa grande inclui poços com uma FICeu de 0,5. A célula de espessura-fronteira indica o poço com o mais baixo FICeu no qual o crescimento é inibido, ou o mínimo FICeu. Porque o mínimo FICeu é 0,5, a combinação é considerada sinérgica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg"> Figura 2: Resultados de matriz quadriculado de uma combinação que não demonstram sinergia (minociclina + colistina testado contra K. pneumoniae isolar BIDMC 4). Valores de densidade óptica (A) em 600 nm e crescimento interpretação dos resultados da matriz quadriculado conforme descrito para a figura 1A. (B) concentração inibitória fracional índice (FICeu) cálculo conforme descrito para a figura 1A. Porque o mínimo FICeu é > 0,5, a combinação não é considerada sinérgica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg"> Figura 3: Resultados de matriz de xadrez que são difíceis de interpretar devido a ignorada poços (minociclina + colistina testado contra Enterobacter cloacae complexo isolar BIDMC 27). Valores de densidade óptica em 600 nm e crescimento interpretação dos resultados da matriz quadriculado conforme descrito para a figura 1A. Vários poços saltados, em que o crescimento bacteriano é inibido apesar da presença de crescimento em poços adjacentes com altas concentrações de antibiótico, são demonstrados. Os resultados não são interpretáveis e experimentar precisa ser repetido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg"> Figura 4: Resultados de sinergia de tempo-mata de três combinações testadas contra K. pneumoniae isolado BIDMC 32. Contagem de colônia é indicadas em uma escala logarítmica no y-axis e tempo, em horas, no x-eixo. A diferença entre a concentração de bactérias na combinação em 24h e o inóculo inicial no tubo é ilustrada pela barra vermelha e número. Se o declínio de iniciar o inóculo a concentração em 24h é ≥3 log10 UFC/mL, a combinação é considerada bactericida. A diferença entre a concentração de bactérias em 24 h entre o tubo que contém a combinação e o tubo contendo o agente único mais ativo sozinho é ilustrada pela barra azul e número; Se houver ≥2 log10 redução de UFC/mL, a combinação é considerada sinérgica. (A) colistina (CST) + minociclina (MIN), uma combinação que seja sinérgico e bactericida. Colistina (B) + Clindamicina (CLI), uma combinação que é sinérgica mas não bactericida. (C) colistina + eritromicina (ERY), uma combinação que não é nem sinérgica bactericida. Estes resultados foram inicialmente publicados como parte de um estudo da atividade sinérgica de colistina contendo combinações contra resistente a colistina Enterobacteriaceae, em que demonstrámos que colistina foi sinérgica com um número de antibióticos que estão ativos apenas individualmente (por exemplo, Clindamicina) ou principalmente (p. ex. Eritromicina) contra bactérias gram-positivas16. (Observe que a eritromicina foi sinérgica por matriz de xadrez contra a tensão mostrada, mas não pelo tempo de matar, então foi selecionada aqui como um exemplo de uma combinação não-sinérgica.) Formulamos a hipótese que colistina, que é conhecida por atuar por permeabilização da membrana exterior gram-negativa, exerce um efeito permeabilizing sub-inibitória em bactérias Gram-negativas resistentes a colistina, permitindo que a entrada de drogas como a clindamicina Normalmente não pode entrar na célula gram-negativa. Painel (A) desta figura foi modificado de Brennan-Krohn, Pironti e Kirby 201816, copyright © American Society for Microbiology, agentes antimicrobianos e quimioterapia, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

Antimicrobiana sinergia teste é usado para avaliar o efeito de dois ou mais antibióticos usados em combinação e é normalmente realizada por um dos dois métodos: a matriz do tabuleiro de damas ou o ensaio de matar tempo. Aqui, apresentamos um automatizado, jato de tinta impressora assistida quadriculado matriz sinergia técnica e um estudo clássico sinergia... matar tempo.

Antimicrobiana sinergia testes pela impressora jato de tinta-assistida matriz Checkerboard automatizado e o método Manual de tempo-kill

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

O teste de sinergia manual do array do checkerboard é um método intensivo em mão-de-obra e propenso a erros. Em contraste, nosso método automatizado de placa de verificação baseado em impressora a jato de tinta melhora drasticamente a velocidade, a precisão e o throughput. O método automatizado de checkerboard permite a triagem de um grande número de drogas para combinações sinérgicas, enquanto o método de morte por tempo pode confirmar e explorar ainda mais a atividade dessas combinações.A nova descoberta de antibióticos não está acompanhando a propagação da resistência, mas a investigação de combinações sinérgicas oferece uma possibilidade de salvar medicamentos existentes para tratar bactérias resistentes. Embora demonstremos essa técnica com antibacterianos, ela também poderia ser usada com outras classes de antimicrobianos ou mesmo para diferentes tipos de testes combinados de drogas ou compostos. Neste vídeo, demonstramos um método automatizado de matriz de tabuleiro de xadrez e um método manual de morte de tempo.Sugerimos a realização de estudos de matriz de checkerboard primeiro para identificar combinações promissoras, em seguida, investigar-los mais adiante com estudos de morte por tempo. Para começar, faça soluções de estoque antimicrobiano de colistina e minocíclina e, em seguida, realize o controle de qualidade sobre as soluções de estoque, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, adicione cerca de um mililitro de cloreto de sódio de 0,9%, salino, a tubos de cultura de vidro redondo de 12 milímetros por 75 milímetros.Selecione uma ou duas colônias de uma placa de bactérias durante a noite, e coloque-as nos tubos de cultura. Vórtice os tubos suavemente para suspender as bactérias na solução. Verifique a concentração de bactérias usando um leitor McFarland.Ajuste a concentração adicionando mais soro fisiológico ou mais bactérias para obter uma leitura de turbidez mcfarland de 0,5. Em seguida, diluir a bactéria de um a 300 adicionando 100 microliters da suspensão a 30 mililitros de caldo Mueller-Hinton ajustado em um tubo cônico de 50 mililitros para atingir uma densidade celular final de cinco vezes 10 para a quinta colônia-formadora de unidades por mililitro. Agora, prepare os antimicrobianos para impressão seguindo o protocolo de texto que acompanha.Salve o protocolo e clique no botão Executar no canto superior esquerdo, seguido pelo botão Iniciar. Coloque uma placa de 384 poços no suporte da placa e pressione carregado sob o prompt de Sinergia da Placa de Carga 1. Em seguida, coloque um T8+no slot do e pressione carregado sob o prompt De carregar um T8+Cassette.Quando solicitado, adicione a solução de estoque de antibióticos aos reservatórios indicados no. Depois de cada solução ser adicionada, pressione o botão Preenchido. Uma vez que o Distribuidor D300 tenha adicionado estoque de antibióticos em volumes apropriados a cada poço e a caixa Run Completed apareça, clique em Fechar, remova a placa e desligue o D300.Em seguida, despeje a suspensão bacteriana previamente preparada em um reservatório de reagente estéril. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters da suspensão a todos os poços da matriz de xadrez. Em seguida, adicione 50 microliters de caldo Mueller-Hinton ajustado sem bactérias a um poço vazio.Este será o controle negativo bem para confirmar a esterilidade da mídia. Incubar em uma incubadora de ar ambiente Celsius de 35 graus por 16 a 20 horas. Para analisar o teste, acompanhe o protocolo de texto que acompanha.Para o teste de sinergia de morte por tempo, prepare novamente as soluções de estoque antimicrobianos, conforme descrito no protocolo de texto. Então, faça uma suspensão de 0,5 McFarland do organismo de teste em solução salina estéril. Adicione 100 microliters da suspensão 0,5 McFarland a cinco mililitros de CAMHB em um tubo de cultura de fundo redondo de vidro de 25 por 150 milímetros com fechamento de aço inoxidável, e vórtice suavemente para misturar.Usando um laço inoculante estéril, o isolamento é uma gota da suspensão diluída em uma placa de ágar de sangue, e incuba a placa a 35 graus Celsius no ar ambiente para confirmar a pureza do inóculo. Substitua o fechamento no tubo e incuba-o em um rack de tubo de ensaio em um agitador a 35 graus Celsius no ar ambiente por pelo menos 3 horas, até que o crescimento da fase logarítmica seja atingido. Enquanto a cultura inicial está incubando, adicione 10 mililitros de caldo Mueller-Hinton ajustado à cation a cinco tubos de cultura de vidro autoclaved.Para um estudo de sinergia de morte por tempo, pelo menos uma droga deve estar em uma concentração que não afeta a curva de crescimento individualmente. Isso pode ser determinado avaliando os efeitos das concentrações individuais de medicamentos antes do estudo de sinergia. Ao primeiro tubo, adicione 10 microlitadores de um miligrama por mililitro de colistina para obter uma concentração final de colistina de um micrograma por mililitro, pois esta é uma concentração que é ineficaz contra a cepa usada neste exemplo.Para o segundo tubo, adicione 10 microlitadores de estoque de minocíclina de um miligrama por mililitro para obter uma concentração final de um micrograma por mililitro. Esta concentração também é ineficaz contra a tensão que está sendo utilizada neste exemplo. Ao terceiro tubo, adicione 10 microlitadores de estoque de minocycline de um miligrama por mililitro e 10 microliters de um miligrama por mililitro de colistina.Esta é a mesma quantidade de colistina e minocíciclina usada nos tubos um e dois. No quarto e quinto tubos, não adicione antibióticos. Este será o controle de crescimento e os tubos de controle negativos, respectivamente.Em seguida, prepare 96 placas de polipropileno de poço profundo com poços de dois mililitros para diluições seriais adicionando 900 microliters de soro fisiológico estéril às linhas B através de H de colunas de um a quatro com uma pipeta multicanal. Quando a cultura estiver em fase de crescimento logarítmico, remova o tubo de cultura do agitador, e o vórtice dele suavemente. Transfira um mililitro da suspensão para um tubo de cultura de vidro de 12 por 75 milímetros e verifique a densidade com um leitor McFarland.Se a densidade for inferior a 1,0 McFarland, devolva o tubo ao agitador e incubar por mais tempo. Se for maior que 1,0 McFarland, adicione caldo Mueller-Hinton ajustado ao tubo, vórtice suavemente e re-amostra até que a suspensão esteja em 1.0 McFarland. É importante que a cultura esteja em fase de crescimento logarítmico ao preparar o inóculo inicial.Você pode construir uma curva de crescimento para determinar quando um organismo atinge esta fase. Em seguida, adicione 100 microliters da suspensão 1.0 McFarland aos tubos de um a quatro, e vórtice-los suavemente. Imediatamente após a mistura e em uma, duas, quatro, seis e 24 horas, remova uma alíquota de 150 microliteres de cada tubo de cultura inclinando o tubo para que apenas a ponta de pipeta estéril entre no tubo e não no eixo do pipettor não estéril durante a retirada de alíquotas.Adicione alíquotas, respectivamente, a poços consecutivos na primeira linha da placa de 96 poços profundos previamente preparada. Retorne os tubos a um rack de tubo de ensaio em um agitador em uma incubadora de ar ambiente Celsius de 35 graus imediatamente após a remoção de alíquotas em cada ponto de tempo. Usando uma pipeta multicanal, remova 100 microliters da linha A da placa e adicione-a à linha B, contendo 900 microliters de soro fisiológico, criando uma diluição de um a 10.Pipeta a solução para cima e para baixo quatro a cinco vezes para misturar, e depois descartar as pontas. Primeiro, rotule as placas de ágar Mueller-Hinton com as condições de antibiótico e diluição a serem banhadas. Em seguida, as amostras diluídas para colônia conta usando o método de placa de gota, usando uma pipeta multicanal com pontas extra-longas.Remova 10 microliters de cada poço na primeira coluna e distribua cuidadosamente em uma fileira sobre a placa devidamente rotulada. Continue até que todas as linhas sejam distribuídas nas placas. Além disso, no ponto de tempo de 24 horas, coloque uma gota de 10 microliter tirada diretamente do tubo de controle negativo para o local dedicado a isso, a fim de testar a esterilidade.Em seguida, inverta todas as placas, e incuba-as durante a noite a 35 graus Celsius no ar ambiente. Então, conte o número de colônias em cada área, e calcule a densidade celular. Marque colônias com um marcador permanente de ponta fina no verso da placa para evitar contagem dupla ou colônias ausentes.Para cada série de diluição, identifique gotas com três a 30 colônias. Conte as colônias nestas gotas, e regisse a contagem junto com o fator de diluição. Mostrado aqui é uma grade de um experimento de sinergia de matriz de xadrez em que a minocícica em concentrações de zero a 32 microgramas por mililitro foi combinada com colistina em concentrações de zero a 16 microgramas por mililitro e testada contra uma cepa de E.coli.Poços com valores OD600 abaixo de 07 não representam crescimento e são sombreados de vermelho, enquanto poços com valores OD600 acima ou iguais a 07 representam crescimento e são sombreados verdes. Para cada droga, a concentração inibitória mínima é a menor concentração de droga que inibe o crescimento bacteriano. Para a minocíciclina, são 32 microgramas por mililitro, e para colistina, são oito microgramas por mililitro.O sombreamento é mantido aqui, mas os valores dentro dos poços em que o crescimento é inibido são substituídos por concentração inibitória fracional, ou FIC, valores de índice. Em cada poço, o índice FIC de cada droga é calculado dividindo a concentração de antibiótico naquele poço pela concentração inibitória mínima da droga. Poços com um índice FIC inferior ou igual a 0,5, que é considerado o limite para sinergia, são indicados com uma borda de linha quebrada, e o poço com o menor índice FIC é arrojado.Como o valor mínimo do FIC está na faixa sinérgica, a combinação é considerada sinérgica. Um exemplo de caso que não demonstra sinergia é mostrado aqui, pois o índice FIC mínimo no qual o crescimento é inibido é um, que é superior a 0,5. Finalmente, neste exemplo, ocorreram vários poços ignorados, o que representa o crescimento bacteriano inibido, apesar da presença de crescimento bacteriano em poços adjacentes com maiores concentrações de antibiótico.Se mais de um pulou bem ocorreu em uma matriz de tabuleiro de xadrez, os resultados devem ser descartados e o ensaio repetido. Um exemplo de um gráfico demonstrando resultados de um ensaio de sinergia de morte de tempo é apresentado aqui. Consulte o protocolo de texto que acompanha os detalhes sobre a interpretação do ensaio de sinergia de morte de tempo.Mais informações sobre a atividade de combinações sinérgicas podem ser obtidas através de avaliações de farmacocinética e farmacodinâmica e através de estudos in vivo com modelos animais. Siga sempre os procedimentos de segurança adequados, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual, ao trabalhar com bactérias. Se você gerar aerossóis ou usar patógenos de alto risco, realize todo o trabalho em um armário de biossegurança.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

Teste de susceptibilidade antimicrobiana do complexo Mycobacterium tuberculosis da Droga primeira e segunda linha de diluição em caldo em um formato de placa de microtitulação

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Imunologia e Infecção

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

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It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

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