Name: antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method
Uploaded: 2019-04-18T12:30:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Thea Brennan-Krohn stöddes av en Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och mänsklig utveckling pediatric infektionssjukdomar forskning utbildning grant (T32HD055148), en nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar utbildning grant ( T32AI007061), en Boston Children's Hospital Office av fakulteten utveckling fakulteten karriärutveckling gemenskap och en nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar karriär utveckling award (1K08AI132716). J.E.K. stöddes av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar av det nationella Institutes of Health award nummer R33 AI119114. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Temkin, E., Adler, A., Lerner, A., Carmeli, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae:+Biology,+epidemiology,+and+management.">Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: Biology, epidemiology, and management.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1323 (1), 22-42 (2014).</li><li>Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+antibiotics.">The future of antibiotics.</a> Critical Care. 18 (3), (2014).</li><li>Spellberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemic+of+antibiotic-resistant+infections:+a+call+to+action+for+the+medical+community+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America.">The epidemic of antibiotic-resistant infections: a call to action for the medical community from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical infectious diseases an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 46 (2), 155-164 (2008).</li><li>Elemam, A., Rahimian, J., Doymaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+antibiotic+synergy+for+polymyxin+B-resistant+carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (10), 3558-3562 (2010).</li><li>Poirel, L., Kieffer, N., Nordmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+dual+carbapenem+combinations+against+carbapenemase-producing+Enterobacteriaceae.">In vitro evaluation of dual carbapenem combinations against carbapenemase-producing Enterobacteriaceae.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (1), 156-161 (2016).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52, (2003).</li><li>Zusman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+of+in+vitro+synergy+of+polymyxins+and+carbapenems.">Systematic review and meta-analysis of in vitro synergy of polymyxins and carbapenems.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (10), 5104-5111 (2013).</li><li>Clock, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+doripenem+alone+and+in+multi-agent+combinations+against+extensively+drug-resistant+Acinetobacter+baumannii+and+Klebsiella+pneumoniae.">In vitro activity of doripenem alone and in multi-agent combinations against extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 76 (3), 343-346 (2013).</li><li>Hirsch, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+antimicrobial+combinations+for+Klebsiella+pneumoniae+carbapenemase-producing+K.+pneumoniae.">Assessment of antimicrobial combinations for Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (5), 786-793 (2013).</li><li>T&#228;ngd&#233;n, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+double-+and+triple-antibiotic+combinations+for+VIM-+and+NDM-producing+klebsiella+pneumoniae+by+in+vitro+time-kill+experiments.">Evaluation of double- and triple-antibiotic combinations for VIM- and NDM-producing klebsiella pneumoniae by in vitro time-kill experiments.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (3), 1757-1762 (2014).</li><li>Tascini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+activity+of+colistin+plus+rifampin+against+colistin-resistant+kpc-producing+klebsiella+pneumoniae.">Synergistic activity of colistin plus rifampin against colistin-resistant kpc-producing klebsiella pneumoniae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3990-3993 (2013).</li><li>Paul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+carbapenem-resistant+Gram-negative+bacteria.">Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (9), 2305-2309 (2014).</li><li>Rafailidis, P. I., Falagas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+for+treating+carbapenem-resistant+Enterobacteriaceae.">Options for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (6), 479-483 (2014).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verification+of+an+automated,+digital+dispensing+platform+for+at-will+broth+microdilution-based+antimicrobial+susceptibility+testing.">Verification of an automated, digital dispensing platform for at-will broth microdilution-based antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2288-2293 (2016).</li><li>Brennan-Krohn, T., Truelson, K., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+Synergistic+Activity+of+Antimicrobial+Combinations+Against+Carbapenem-Resistant+Enterobacteriaceae+Using+Inkjet+Printer-Based+Technology.">Screening for Synergistic Activity of Antimicrobial Combinations Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Using Inkjet Printer-Based Technology.</a> J Antimicrob Chemother. 72 (10), 2775-2781 (2017).</li><li>Brennan-Krohn, T., Pironti, A., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Activity+of+Colistin-Containing+Combinations+against+Colistin-Resistant+Enterobacteriaceae.">Synergistic Activity of Colistin-Containing Combinations against Colistin-Resistant Enterobacteriaceae.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K., Saravolatz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin:+The+Revival+of+Polymyxins+for+the+Management+of+Multidrug-Resistant+Gram-Negative+Bacterial+Infections.">Colistin: The Revival of Polymyxins for the Management of Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacterial Infections.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (9), 1333-1341 (2005).</li><li>Nation, R. L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+in+the+21st+century.">Colistin in the 21st century.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 22 (6), 535-543 (2009).</li><li>Ah, Y. -. M., Kim, A. -. J., Lee, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+resistance+in+Klebsiella+pneumoniae.">Colistin resistance in Klebsiella pneumoniae.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 44 (1), 8-15 (2014).</li><li>Bratu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenemase-producing+Klebsiella+pneumoniae+in+Brooklyn,+NY:+Molecular+epidemiology+and+in+vitro+activity+of+polymyxin+B+and+other+agents.">Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY: Molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (1), 128-132 (2005).</li><li>Barth, N., Ribeiro, V. B., Zavasckid, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+plus+imipenem,+meropenem,+or+tigecycline+against+KPC-2-producing+Enterobacteriaceae+with+high+MICs+for+these+antimicrobials.">In vitro activity of polymyxin B plus imipenem, meropenem, or tigecycline against KPC-2-producing Enterobacteriaceae with high MICs for these antimicrobials.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (6), 3596-3597 (2015).</li><li>MacLowry, J., Jaqua, M., Selepak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+methodology+and+implementation+of+a+semiautomated+serial+dilution+microtechnique+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Detailed methodology and implementation of a semiautomated serial dilution microtechnique for antimicrobial susceptibility testing.</a> Appl Microbiol. 20 (1), 46-53 (1970).</li><li>Brennan-Krohn, T., Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poisoned+well:+Enhancing+the+predictive+value+of+antimicrobial+susceptibility+testing+in+the+era+of+multidrug+resistance.">The poisoned well: Enhancing the predictive value of antimicrobial susceptibility testing in the era of multidrug resistance.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (8), 2304-2308 (2017).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th ed. CLSI supplement M100. , (2018).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Tenth Edition. CLSI document M07-A10. , (2015).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, 11th Edition. , (2018).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents; approved guideline M26-A. 19 (18), 7 (1999).</li><li>Naghili, H., Tajik, H., Mardani, K., Razavi Rouhani, S. M., Ehsani, A., Zare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+drop+plate+technique+for+bacterial+enumeration+by+parametric+and+nonparametric+tests.">Validation of drop plate technique for bacterial enumeration by parametric and nonparametric tests.</a> Veterinary research forum. 4 (3), 179-183 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+6x6+drop+plate+method+for+simultaneous+colony+counting+and+MPN+enumeration+of+Campylobacter+jejuni,+Listeria+monocytogenes,+and+Escherichia+coli.">A 6x6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli.</a> Journal of Microbiological Methods. 55 (2), 475-479 (2003).</li><li>Queenan, A. M., Foleno, B., Gownley, C., Wira, E., Bush, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Inoculum+and+Activity+in+AmpC-+and+Extended-Spectrum+(ESBL)-Producing+Escherichia+coli+and+Klebsiella+pneumoniae+Clinical+Isolates+Tested+by+Using+NCCLS+ESBL+Methodology.">Effects of Inoculum and Activity in AmpC- and Extended-Spectrum (ESBL)-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates Tested by Using NCCLS ESBL Methodology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (1), 269-275 (2004).</li><li>Smith, K. P., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inoculum+Effect+in+the+Era+of+Multidrug+Resistance:+Minor+Differences+in+Inoculum+Have+Dramatic+Effect+on+Minimal+Inhibitory+Concentration+Determination.">The Inoculum Effect in the Era of Multidrug Resistance: Minor Differences in Inoculum Have Dramatic Effect on Minimal Inhibitory Concentration Determination.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , (2018).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+Testing:+Broth+Microdilution+Checkerboard+and+Broth+Macrodilution+Methods.">Synergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Kill+Assay+for+Determining+Synergy.">Time-Kill Assay for Determining Synergy.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. , (2016).</li><li>Hindler, J. A., Humphries, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colistin+MIC+variability+by+method+for+contemporary+clinical+isolates+of+multidrug-resistant+gram-negative+bacilli.">Colistin MIC variability by method for contemporary clinical isolates of multidrug-resistant gram-negative bacilli.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (6), 1678-1684 (2013).</li><li>Sutherland, C. A., Nicolau, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+add+or+not+to+add+Polysorbate+80:+Impact+on+colistin+MICs+for+clinical+strains+of+Enterobacteriaceae+and+Pseudomonas+aeruginosa+and+quality+controls.">To add or not to add Polysorbate 80: Impact on colistin MICs for clinical strains of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa and quality controls.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (10), 3810 (2014).</li><li>Fuchs, P. C., Barry, a. L., Brown, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+testing+quality+control+studies+with+fosfomycin+tromethamine.">Susceptibility testing quality control studies with fosfomycin tromethamine.</a> European journal of clinical microbiology &amp; infectious diseases official publication of the European Society of Clinical Microbiology. 16 (7), 538-540 (1997).</li><li>Leber, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+Bactericidal+Concentration+Testing.">Minimum Bactericidal Concentration Testing.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, Fourth Edition. 5.14.1.11. , (2016).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activity+of+polymyxin+B+in+combination+with+various+antibiotics+against+extensively+drug-resistant+Enterobacter+cloacae+with+decreased+susceptibility+to+polymyxin+B.">In vitro activity of polymyxin B in combination with various antibiotics against extensively drug-resistant Enterobacter cloacae with decreased susceptibility to polymyxin B.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (9), 5238-5246 (2016).</li><li>Bulman, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymyxin+combinations+combat+Escherichia+coli+harboring+mcr-1+and+blaNDM-5:+Preparation+for+a+postantibiotic+Era.">Polymyxin combinations combat Escherichia coli harboring mcr-1 and blaNDM-5: Preparation for a postantibiotic Era.</a> mBio. 8 (4), (2017).</li></ol>

De D300 Digital Dispenser och tillhörande förbrukningsvaror tillhandahölls av Tecan (Morrisville, NC). Tecan hade ingen roll i studiedesign, data insamling och tolkning, manuskript förberedelse eller beslut om att offentliggöra.

De två metoder som beskrivs här ger båda information om aktiviteten av antimikrobiella medel i kombination jämfört med deras individuella aktivitet. Den automatiserade, bläckstråle skrivare-assisted digitalt dispensering metod är en anpassning av den metod som beskrivs i den klinisk mikrobiologi förfaranden handbok33, medan metoden tid-kill följer närmare motsvarande protokollet från samma referera till34.
I metoden schackrutiga array beräkningar för att bestämma volymen som behövs av antimikrobiell lager att lägga till varje brunn samt munstycket av dessa volymer är automatiserad, vilket eliminerar några av de stora potentiella källorna till fel i en handbok schackrutiga matris. Men är det fortfarande viktigt, att utredaren bestämmer att ursprungliga bestånd görs vid den planerade koncentrationen och att målet slutliga koncentrationer är korrekt angivna i programvaran D300. Lägga till antimikrobiell suspensionen till brunnar i en plattan med 384 brunnar kan vara svårt i början och kräver vård för att säkerställa att pipett tips ange lämpliga brunnar och att vätska splash upp inte kanterna av brunnarna. En automatiserad flytande hanterare kan användas istället för en handhållen flerkanalspipett för att öka hastighet och precision med vilken bakteriesuspensionen tillsätts brunnar. Som beskrivs i protokollet, kräver D300 tillägg av tensiden, polysorbat 20 (P-20), för rätt vätskehantering. En annan tensid, polysorbat 80, med en koncentration på 0,002%, har noterats för att sänka kolistin mikrofoner för organismer med kolistin mikrofoner av < 2 µg/mL i standard buljong microdilution analyser. 35 , 36 vårt laboratorium tidigare visat att P-20 vid koncentrationer upp till 0,0015% hade ingen effekt på D300-assisted MIC resultat i jämförelse med referera BMD14. I assay exempel presenteras här, är den maximala P-20 koncentration är 0,0014%.
Ett problem vi stött på med några Schackrutor array-analyser var ett stort antal överhoppade brunnar. Detta skedde i en oproportionerlig takt med vissa antibiotika. Specifikt, i en skärm av kombinationer mot en samling av karbapenemresistenta Enterobacteriaceaekonstaterade vi att medan 49 521 prövningar (9,4%) var obrukbar på grund av flera överhoppade brunnar, 2 12 antibiotika testats (fosfomycin och cefepime) svarade för 46 i dessa prövningar (94%). Sådana ökade priser kan vara vanligare i läkemedel som är särskilt mottagliga för de inokulum effekt31,32,37. Notera rekommenderar inte CLSI testning fosfomycin i buljong utspädning25 på grund av farhågor om resultatens tillförlitlighet med denna metod, vilket kan förklara de otillförlitliga resultat ses med detta läkemedel. Vissa ändringar kan göras till automatiserade schackrutiga metod enligt utredaren preferens. Antimikrobiella medel kan doseras i plattor som redan innehåller bakteriesuspensionen, snarare än i tomma brunnar, om detta är att föredra på grund av arbetsflöde inom laboratoriet. Medan 384 brunnar användes här, kan metoden också utföras i plattan med 96 brunnar analyser med lämplig modifiering av väl volym. Användning av ett plattan med 96 brunnar format kan hjälpa att minska överhoppade brunnar för antibiotika som är särskilt känslig för små förändringar i inokulum. Vid beräkning av FICjag, kan det finnas situationer där MIC off-skalan (dvs, högre än testas), inbegripet situationer där medlet prövas har ingen aktivitet individuellt mot typ av organismen som testas. I dessa fall kan FIC beräknas baserat på förutsatt att MIC är en spädning högre än den högsta koncentration som testats. Detta är den mest konservativa strategin, eftersom den förutsätter maximal möjlig FIC värdet för utspädning där hämning observeras under synergy testning. Till exempel om den faktiska MIC var istället två fördubbling utspädningar ovan den högsta koncentrationen testade, då de motsvarande FICs skulle vara två gånger lägre än den konservativa uppdrag, och så vidare.
För att korrekt bedöma baktericida aktiviteten av läkemedel i en tid-döda-analys, är det väsentligt att kulturer är logaritmisk-fas tillväxt, särskilt när cellväggen aktiv antibiotika testade28. För de snabbt växande bakterier används i detta exempel (K. pneumoniae), 3 timmars inkubation med skakningar var lämpligt att nå denna tillväxtfas, men olika lång tid kan behövas för olika organismer. I allmänhet bör kulturen visas synligt men inte kraftigt grumlig. Lämplig mängd tid kan bestämmas genom att konstruera en tillväxtkurva med kolonin räknas vid seriell tid punkter (t.ex. varje 30 min för 4-6 h)38. Det avsedda start inokulatet i tid-kill studien är också viktigt. Målet koncentrationen av de startande inokulatet är ca 5 x 105 till 1 x 106 CFU/mL. Den utspädning som beskrivs här (100 μL av en 1.0 McFarland suspension i 10 mL av media) genererar detta inokulum för Klebsiella pneumoniae och andra Enterobacteriaceae arter som vi har testat den. Om densiteten av de startande inokulat i ett experiment med olika organismer är betydligt högre eller lägre än detta, kan sedan en annan utspädning behövas. (Lämplig spädning krävs för en given art kan bestämmas genom att utföra ett antal av en 0,5 eller 1,0 McFarland suspension att avgöra hur många organismer denna grumlighet representerar, sedan beräkna det belopp som den ursprungliga suspensionen måste vara (utspädd för att nå lämpliga slutliga koncentration.) Om, på granskning av plattan räknas från synergy studien, det start inokulatet av någon av antibiotikum innehållande rören har varit betydligt lägre än det start inokulatet tillväxt kontroll, detta kan tyda på antingen antibiotika överföring eller mycket snabb avlivning av bakterier under den korta tid mellan tillägg av bakterier till antibiotikum innehållande röret och borttagning av alikvoten för plätering. Om det faktiska antalet kolonier i den outspädd droppe i en serie är lägre än antalet kolonier i efterföljande spädningar, föreslår detta antibiotikum kvarstående effekter. Olika alternativ har beskrivits för att förhindra denna effekt, inklusive sprida ett enda delprov över en hela plattan38 eller spinning ner provet, ta bort supernatanten och nytt uppehåll i steril koksaltlösning före plätering39. Vid varje tidpunkt i metoden tid-döda är det också avgörande för utredaren att effektivt men noggrant bort en alikvot från varje kultur rör och utföra seriespädningar. Förseningar under denna process, särskilt under tidig tidpunkter som förekommer i nära följd, kan leda till längre perioder under vilka kulturer inte är varit inkuberas och skakas, medan slarvig dispensering och seriespädningar kan leda till felaktig plattan räknar. Jämfört med plattan spridningsmetoden plattan räknar, där 100 μL av varje utspädning är spridda över en hela agarplatta, släppa plattan metoden som beskrivs är långt mer snabb, kräver ett mycket mindre antal agarplattor, och möjliggör snabbare räkna, som maximalt räknebart antal kolonier för varje droppe är 30, medan upp till 300 kolonier kan normalt räknas från en spridning tallrik. Men är plattan spridningsmetoden också ett alternativ om utredarna är mer bekväm med denna teknik. Om droppar sprids in i varandra efter dispensering med en flerkanalspipett, kan mottagarspecifik tillämpning av mer brett placerade droppar med en enkanalig pipett utföras istället. I vår erfarenhet verkade kylning plåtar vid 4 ° C före dispensering droppar minska överdriven spridning.
En begränsning av de tekniker som beskrivs här är att resultaten av de två typerna av synergy assay (schackrutiga array och tid-döda) är inte alltid samstämmiga, och eftersom mest publicerade synergy artiklar använder en metod eller andra snarare än båda tillsammans, det kan vara svårt att veta hur man kan integrera data från två typer av analyser. Eftersom den automatisera schackrutiga array metod vi utvecklat är enkel och hög genomströmning, vi har använt det i praktiken som en slags skärm att testa kombinationer mot ett större antal isolat och avgöra vilka koncentrationen kombinationer var synergistisk. Vi genomförde då ett mindre antal tid-kill studier, välja kombinationer och koncentrationer som hade varit effektiva i matrisen Schackrutor. Att notera, eftersom schackrutiga analysen utförs normalt i microbroth utspädning skala, medan tid-kill analysen använder större volymer (liknar en macrobroth utspädning), Vi hittade att FICs ibland var olika mellan de två metoderna, med högre koncentrationer som allmänt krävs i tid-döda-analysen att påvisa aktivitet. Detta fenomen har noterats tidigare när macrobroth och microbroth utspädning MIC analysens resultat jämförs för gramnegativa baciller26 och när större inokulat (som används i tid-kill studier) jämförs med den standard inokulum som används i microbroth utspädning och schackrutiga array-analyser32. En viss begränsning av schackrutiga matrisen är det inneboende variabilitet i microbroth utspädning MIC testning22. Samtidigt FICjag avbrytandear för synergy-konto för denna variation matematiskt6 sådana variabilitet oundvikligen väcker oro över tillförlitlighet och konsekvens av schackrutiga array resultat.
På grund av begränsningarna inneboende till alla in vitro-synergy testmetoder (inklusive odling av bakterier i ett artificiellt odlingsmedium, statisk antibiotiska koncentrationerna och en begränsad tid kurs), resultaten av dessa metoder måste bekräftas och vidare utvärderas med hjälp av kompletterande tekniker. Sådana metoder inkluderar in vitro-farmakokinetiska/farmakodynamiska (PK/PD) studier (t.ex. den ihålig fiber infektion modell40), djurmodeller, och, slutligen, PK/PD och effekt humanstudier. Den automatisera schackrutiga array metod som beskrivs här, genom att förse skärmen kombinationer för potentiella synergistisk aktivitet, en snabb metod som möjliggör mer riktad användning av dessa tekniker. Ytterligare automatisering av alla dessa metoder, som väl som mer systematisk undersökning av förhållandet mellan in vitro-parametrar och kliniska resultat, blir viktigt för skalning upp användningen av synergy testning och öka dess kliniska tillämpligheten.

Spridningen av multiresistenta (MDR) bakteriella patogener, särskilt MDR Gramnegativa bakterier såsom karbapenemresistenta Enterobacteriaceae (CRE), har lämnat kliniker med alltmer begränsade alternativ för framgångsrik anti-infektiösa terapi 1, ett problem som förvärras av trög takten i romanen antibakteriella drug discovery2,3. Antimikrobiella synergi, där två läkemedel som används i kombination utöva en större-än-additiva effekt, erbjuder möjligheten att rädda befintliga antibiotika för användning i behandling av MDR bakterier, även när dessa bakterier är resistenta mot en eller båda av de antibiotika individuellt. De tekniker som beskrivs i detta dokument ger två kompletterande metoder för in vitro-synergy testning som, när de används tillsammans, tillåta utredarna att effektivt skärmen antimikrobiella kombinationer av intresse för belägg för synergistisk aktivitet (den automatiserade schackrutiga array metoden) och sedan att ytterligare utvärdera kineticsen av hämning och dödande visat lovande kombinationer identifieras i screening scenen (manuell tid-kill metoden).
En av de vanligaste metoderna för in vitro-synergy testning är den schackrutiga array analysen, en ändring av minsta hämmande koncentration (MIC) testning där isolera den hämmande effekten av två olika antibiotika mot en bakterie testas över en rad koncentration kombinationer4,5. Om de två läkemedlen utöva större än additiv aktivitet när de används tillsammans, anses kombinationen synergistisk6. Dock innebär att inrätta en Schackrutor matrisen manuellt en rad beräkningar och att späda och pipettering steg som är mödosam och sårbara för mänskliga fel. Dessa begränsningar har haft begränsar användningen av synergy testning främst till retroaktiva utvärderingen av litet numrerar av antibiotika kombinationer och bakteriell isolat, och resultaten har inte alltid varit konsekvent mellan studier7, 8,9,10,11. Dessutom har komplexiteten i synergy testning bidragit till dess otillgänglighet i klinisk mikrobiologi laboratoriet och den faktiska frånvaron av in vitro-synergy testdata från kliniska studier av kombination terapi12, 13.
För att öka effektiviteten och genomströmning av metoden schackrutiga array, gjord vi använda av en automatiserad testning MIC-teknik som tidigare utvecklats i vårt laboratorium som använder inkjet trycktekniken till just och konsekvent avstå små volymer av antibiotika stamlösning i brunnar i en mikrotiter plattan14. Plattformen undanröjer behovet av komplexa beräkningar och flera pipettering steg. Den tillhörande programvaran beräknar och doserar lämpliga volymer av antibiotika för att skapa en tvådimensionell schackrutiga matris om användaren helt enkelt ingångar intervallet önskad koncentration och stamlösningens koncentration av antibiotika. Vi testat inledningsvis denna metod mot en samling CRE isolat15 och därefter har fokuserat på tester kolistin-innehållande kombinationer för aktivitet mot kolistin-resistenta isolat16. Kolistin är ett läkemedel som sista utväg vanligen reserverad för användning i behandling av MDR gramnegativa patogener17,18, och kolistin motstånd gör redan MDR bakterier nästan pan-resistenta19, vilket gör dem idealiska kandidater för utvecklingen av nya terapeutiska strategier använder droger som de är okänsliga individuellt. Vi fann att kombinationen av kolistin och den proteinsyntes hämmare antibiotika minocyklin hade en mycket hög frekvens av synergi, även mot stammar som var resistenta mot var och en av dessa droger individuellt, förmodligen eftersom kolistin utövar en subinhibitory permeabilizing effekt på ens kolistin-resistenta bakterier. Vi har valt denna kombination att använda som exempel i detta dokument. Notera, kan synergy testning också användas att utvärdera för förstärkt effekt av två mediciner som är både effektiva individuellt.
Automatiserad schackrutiga array metoden underlättar snabb, hög genomströmning synergy testning. Den schackrutiga array metoden har dock begränsningar. Det ger data bara på hämning av bakterietillväxt och inte på avlivning som en modifierad MIC analys, och det ger inte data på antibiotika effekter över tid. Däremot manuell prestanda av tid-kill synergy analyser är mer arbetskrävande men ger information om både hämning och dödande över en 24 h tid kursen20,21. Vi använde tid-kill analys på ett mindre antal isolat bekräfta vår schackrutiga array resultat och för att avgöra huruvida de synergistiska kombinationer som vi identifierade var också bakteriedödande.
Både schackrutiga array och tid-kill synergy metoder ger värdefull information om aktiviteten av läkemedelskombinationer och är särskilt användbart för att värdera potentiella nya behandlingsalternativ för högresistent bakteriella patogener. Metoderna har också inneboende begränsningar. Metoden standard microbroth utspädning MIC har en känd beräknade fel rad 1 dubbel utspädning22, som ökas när två läkemedel testas tillsammans i en schackrutiga matris. Standarddefinitionen av synergi, som anser en synergistisk kombination endast om droger är aktiva tillsammans på en fjärde deras respektive MICs6, tar hänsyn till detta förväntade variationer, men sådana variabilitet (som är tänkt att leda från en kombination av biologiska och tekniska växlingar23) oundvikligen genererar osäkert om synergy Resultatens tillförlitlighet. Avsaknaden av etablerade kvalitetskontroll standarder för provning av synergy är också en strömbegränsning. Kanske är den mest betydande begränsningen av alla synergy testmetoder avsaknaden av etablerade korrelationer mellan in vitro-resultat och kliniska resultat när kombinationer används för att behandla patienter24. Enklare och snabbare synergieffekter som testar metoder, såsom den automatisera schackrutiga array metod som beskrivs här, kan underlätta integrationen av in vitro-synergy provning inom kliniska prövningar eller andra utvärderingar av behandlingsresultaten för att bättre prägla förhållandet mellan in vitro- och in vivo effekter i framtiden.
Den automatisera schackrutiga array metod som vi presenterar här erbjuder ett alternativ för high-throughput screening av olika kombinationer och möjliggör snabb utvärdering av ovanliga, ”hög risk-hög belöning” kombinationer utan en större investering av tid och resurser. Metoden tid-kill, som vi därefter demonstrera, kan ge ytterligare stödjande information på kombinationen synergistisk aktivitet och kan hjälpa för att karakterisera dess baktericida och antibakteriella kinetik.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Escherichia coli strain ATCC 25922</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>25922</td>
			<td>QC strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L 0.22 &#181;m bottle-top filter</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>597-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-961-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R01620 or R04050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>2011-25150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>SS-PH50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile reagent reservoirs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-566-612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>222-8032-01R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation adjusted Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>212322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colistin sulfate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J60915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D300e Control Software</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DensiCHEK Plus McFarland reader</td>
			<td>bioM&#233;rieux</td>
			<td>21250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra long SHARP 10 &#181;L Precision Barrier Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 digital dispenser</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP D300 T8+ cassettes</td>
			<td>HP/Tecan</td>
			<td>30097370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minocycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>14302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picus 12-channel 10-300 &#181;L pipette</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>735461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP-337</td>
			<td>Brand name: Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M1000 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xplorer 12-channel 50-1200 &#181;L pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000328</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antimicrobial synergy testing by the inkjet printer-assisted automated checkerboard array and the manual time-kill method

Priser av multiresistenta (MDR) patogener fortsätter att stiga snabbare än utvecklingen av nya antimikrobiella medel, blir nya metoder för behandling av MDR bakterier alltmer en nödvändighet. Ett sådant tillvägagångssätt är kombinationsbehandling, i vilka två eller flera antibiotika används tillsammans att behandla en infektion mot vilka ett eller båda av droger kan vara ineffektiva ensam. När två läkemedel, i kombination, utöva en större än additiv effekt, de anses synergistisk. In vitro-undersökning av synergistisk aktivitet är ett viktigt första steg i att utvärdera möjliga effekten av läkemedelskombinationer. Två huvudsakliga in vitro-synergy testmetoder har utvecklats: Schackrutor matrisen och tid-kill studien. I detta papper, vi presentera en automatiserad schackrutiga array metod som använder sig av teknik för inkjet utskrifter för att öka effektiviteten och precisionen av denna teknik, liksom en standard manuell tid-kill synergy metod. Automatiserad schackrutiga matrisen kan fungera som en high-throughput screening test, medan manuell tid-kill studien ger ytterligare, kompletterande uppgifter om synergistisk aktivitet och dödande.
Schackrutiga matrisen är en modifiering av standard minsta hämmande koncentration (MIC) testning, där bakterier inkuberas med antibiotika vid olika koncentration kombinationer och utvärderas för tillväxthämning efter natten inkubation. Manuell prestanda i schackrutiga matrisen kräver en mödosam och tidskrävande serie beräkningar och spädningar. I den automatiserade metoden presenteras här, beräkning och dispensering av krävs antibiotika stamlösning volymer är automatiserade genom användning av bläckstråle skrivare teknik. I tid-kill synergy-analysen, bakterier inkuberas med antibiotika av intresse, både tillsammans och individuellt, och provtas mellanrum under loppet av 24 h för kvantitativa kultur. Resultaten kan avgöra huruvida en kombination är synergistiska och om det är bakteriedödande, och lämna uppgifter om hämning och dödandet av bakterier över tid.

Figur 1A visar ett rutnät från en schackrutiga array synergy experiment i vilka minocyklin i koncentrationer av 0-32 μg/mL var kombinerat med kolistin vid koncentrationer på 0-16 μg/mL och testats mot E. coli stam FDA-CDC 0494. Värdena representerar spektrofotometrisk avläsning vid optisk densitet 600 nm (OD600). Brunnar med OD600 värden under 0,07 (vilket motsvarar ingen tillväxt genom okulärbesiktning) är skuggade röda, medan brunnar med OD600 värden 0,07 (vilket motsvarar tillväxt genom okulärbesiktning) är skuggade green. För varje läkemedel är den minsta hämmande koncentrationen (MIC; fetstil) den lägsta koncentrationen av läkemedlet som hämmar bakterietillväxt. Detta är 32 μg/mL för minocyklin, och kolistin, är det 8 μg/mL. Skuggningen sparas i figur 1B, men värden inom brunnarna där tillväxten hämmas ersätts av fraktionerad hämmande koncentration (FICjag) indexvärden. Dessa bestäms enligt följande: i varje brunn, fraktionerad hämmande koncentration index (FIC) för varje läkemedel beräknas genom att dividera koncentrationen av antibiotika i det brunnen med drogens MIC och den FICjag beräknas genom att summera de två FICs. Brunnar med en FICjag värdet 0,5, som anses cutoff för synergi, indikeras med en bruten kantlinje, och brunnen med lägsta FICjag värdet (0.094) är i fetstil. Eftersom FICjag minimivärdet är i intervallet synergistisk, betraktas kombinationen synergistisk.
Figur 2A och figur 2B Visa stödraster motsvarande dem i figur 1A och figur 1B, men i detta fall kombinationen visar inte samverkan mot isolatet testade (K. pneumoniae isolatet BIDMC 4), eftersom den minsta FICjag där tillväxten hämmas är 1, vilket är > 0,5.
Figur 3 illustrerar Absorbansavläsningar från ett schackbräde synergy rutnät där inträffat flera överhoppade wells (Enterobacter cloacae komplex isolat BIDMC 27). Överhoppade brunnar är brunnar där bakterietillväxt hämmas trots närvaron av bakterietillväxt i intilliggande brunnar med högre koncentrationer av antibiotika. Detta fenomen, som kallas uppstå i MIC Standardtester samt, beror sannolikt på biologisk variabilitet i bakterietillväxt egenskaper från bra till väl och att känsligheten för vissa antibiotika till små skillnader i bakteriell inokulum23 , 31 , 32. om mer än en hoppade väl inträffade i en schackrutiga matris, vi resultaten och upprepade analysen.
Figur 4 presenterar exempel på tid-kill synergy resultaten av tre kombinationer prövats mot K. pneumoniae isolera BIDMC 32. Kolonin räknas anges i en logaritmisk skala på y-axeln och tid, i timmar, på x-axeln. Skillnaden mellan det start inokulatet i röret som innehåller kombinationen läkemedel och koncentrationen av bakterier i att röret vid 24 h illustreras av den röda stapeln och antal, medan skillnaden mellan koncentrationen av bakterier på 24 h mellan röret innehållande kombinationen och röret som innehåller mest aktiva enda agenten ensam illustreras av den blå stapeln och antal. Figur 4A visar resultat från kombinationen av kolistin och minocyklin; Denna kombination var synergistisk (skillnaden mellan koncentrationerna av bakterier som utsätts för kombination och mest aktiva agent ensam ≥2 log10 CFU/mL vid 24 h) och bakteriedödande (nedgång från start inokulum koncentrationen på 24 h ≥3 log10 CFU/mL). Figur 4B visar resultat från kombinationen av kolistin och klindamycin, en kombination som var synergistisk men var inte bakteriedödande. Denna kombination hämmade tillväxten av bakterier, som varken drogen gjorde ensam, men inte döda dem. Figur 4 c visar resultat från kombinationen av kolistin och erytromycin, som var varken bakteriedödande eller synergistisk.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig1.jpg"> Figur 1: Schackrutor array resulterar demonstrerande synergy (minocyklin + kolistin testats mot E. coli stam FDA-CDC 0494). (A) spektrofotometrisk avläsning och tillväxt tolkning av en schackrutiga array. Värden i cellerna är Absorbansavläsningar på 600 nm (OD600). Celler med OD600 värden under 0,07 (motsvarande ingen tillväxt genom okulärbesiktning) är skuggade röda, medan celler med OD600 värden 0,07 (motsvarande tillväxt genom okulärbesiktning) är skuggade green. (B) fraktionerad hämmande koncentration (FICjag) indexberäkning. Skuggning anger tillväxt eller ingen tillväxt har behållits. Värden för kolistin och minocyklin längs x- och y-axlarna, respektive nu representera fraktionerad inhibitoriska koncentrationen (FIC) eller förhållandet mellan koncentrationen av drogen i kolumnen eller raden till den minsta hämmande koncentration ( MIC) av detta läkemedel ensamt. Värdet i varje cell är den FICjag, eller summan av FICs av två droger i den brunnen. Den stora brutna linje-gränsas rutan omsluter brunnar med en FICjag 0,5. Tjock-gränsas cellen anger brunnen med den lägsta FICjag där tillväxten hämmas eller den minsta FICjag. Eftersom den minsta FICjag är 0,5, betraktas kombinationen synergistisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig2.jpg"> Figur 2: Schackrutor array resultat av en kombination som inte visar synergy (minocyklin + kolistin testats mot K. pneumoniae isolera BIDMC 4). (A) optiska densitet värden på 600 nm och tillväxt tolkning av schackrutiga array resultat enligt figur 1A. (B) fraktionerad hämmande koncentration (FICjag) indexberäkning enligt figur 1A. Eftersom den minsta FICjag är > 0,5, kombinationen anses inte synergistisk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig3.jpg"> Figur 3: Schackrutor array resultat som är tack vare hoppade brunnar som är (minocyklin + kolistin testats mot Enterobacter cloacae komplexa isolera BIDMC 27). Optisk densitet värden på 600 nm och tillväxt tolkning av schackrutiga array resultat enligt figur 1A. Flera överhoppade brunnar, där bakterietillväxt hämmas trots närvaron av tillväxt i intilliggande brunnar med högre koncentrationer av antibiotika, demonstreras. Resultaten är inte tolkningsbara och experimentera behöver upprepas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58636/58636fig4.jpg"> Figur 4: Tid-kill synergy resultaten av tre kombinationer prövats mot K. pneumoniae isolera BIDMC 32. Kolonin räknas anges i en logaritmisk skala på y-axeln och tid, i timmar, på x-axeln. Skillnaden mellan koncentrationen av bakterier i kombinationen på 24 h och det börjar inokulatet i röret illustreras av den röda stapeln och antal. Om nedgången från start inokulum koncentrationen på 24 h är ≥3 log10 CFU/mL, anses kombinationen bakteriedödande. Skillnaden mellan koncentrationen av bakterier på 24 h mellan röret som innehåller kombination och röret som innehåller mest aktiva enda agenten ensam illustreras av den blå stapeln och antal; om det finns ≥2 log10 CFU/mL minskning, anses kombinationen synergistisk. (A) kolistin (CST) + minocyklin (MIN), en kombination som är både synergistisk och bakteriedödande. (B) kolistin + klindamycin (CLI), en kombination som är synergistiska men inte bakteriedödande. (C) kolistin + erytromycin (ERY), en kombination som är varken synergistisk eller bakteriedödande. Dessa resultat publicerades ursprungligen som en del av en studie av synergistisk aktivitet kolistin-innehållande kombinationer mot kolistin-resistenta Enterobacteriaceae, där vi visat att kolistin var synergistiskt med ett antal antibiotika som är aktiva individuellt endast (e.g. klindamycin) eller primärt (t.ex. erytromycin) mot grampositiva bakterier16. (Observera att erytromycin var synergistisk av schackrutiga array mot den stam som visas, men inte av tid-döda, så det har valts här som ett exempel på en icke-synergistisk kombination.) Vi hade en hypotes som kolistin, som är kända för att agera av permeabilisering av gramnegativa yttre membranet, utövar en sub-hämmande permeabilizing effekt på kolistin-resistenta Gramnegativa bakterier, att tillåta införsel av läkemedel såsom klindamycin som normalt kan inte ange gramnegativa cellen. Panel (A) av denna siffra har ändrats från Brennan-Krohn, Pironti och Kirby 201816, copyright © American Society for mikrobiologi, antimikrobiella medel och kemoterapi, 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58636/58636fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method at JoVE.com

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

Antimikrobiella synergy tester används för att utvärdera effekten av två eller flera antibiotika som används i kombination och utförs vanligtvis av en av två metoder: Schackrutor matrisen eller tid-kill analysen. Här presenterar vi ett automatiserat, bläckstråle skrivare-assisted schackrutiga array synergy teknik och en klassisk tid-kill synergy studie.

Antimikrobiella Synergy tester av bläckstråleskrivare-assisted automatiserade schackrutiga Array och den manuella tid-döda-metoden

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Manuell schackbräde array synergitestning är en arbetsintensiv och felbenägna metod. Däremot förbättrar vår automatiserade metod för bläckstråleskrivare baserat schackbräde dramatiskt hastighet, noggrannhet och dataflöde. Den automatiserade schackbrädemetoden gör det möjligt att screena ett stort antal läkemedel för synergistiska kombinationer, medan metoden time-kill kan bekräfta och ytterligare utforska aktiviteten hos dessa kombinationer.Nya antibiotika upptäckt inte hålla jämna steg med spridningen av resistens, men undersökningen av synergistiska kombinationer erbjuder en möjlighet för att rädda befintliga läkemedel för att behandla resistenta bakterier. Även om vi visar denna teknik med antibakteriella medel, det skulle också kunna användas med andra klasser av antimikrobiella medel eller ens för olika typer av kombination drog eller sammansatta testning. I den här videon demonstrerar vi en automatiserad schackbräde-arraymetod och en manuell time-kill-metod.Vi föreslår att utföra schackbräde array studier först för att identifiera lovande kombinationer, sedan undersöka dessa ytterligare med time-kill studier. Till att börja med gör antimikrobiella lagerlösningar av kolistin och minocyklin, och utför sedan kvalitetskontroll på stamlösningarna enligt beskrivningen i det medföljande textprotokollet. Tillsätt därefter ungefär en milliliter av 0,9%natriumklorid, saltlösning, till 12-millimeter-by-75-millimeters runda bottenglaskulturrör.Välj en eller två kolonier från en övernattning tallrik med bakterier, och placera dem i odlingsrören. Vortexa rören försiktigt för att suspendera bakterierna i lösningen. Kontrollera koncentrationen av bakterier med hjälp av en McFarland läsare.Justera koncentrationen genom att tillsätta mer saltlösning eller fler bakterier för att uppnå en 0,5 McFarland grumlighet läsning. Späd sedan bakterierna en till 300 genom att lägga till 100 mikroliter av suspensionen till 30 milliliter katjonjusterad Mueller-Hinton buljong i en 50-milliliter koniska rör för att nå en slutlig celltäthet på fem gånger 10 till den femte kolonibildande enheter per milliliter. Nu, förbereda antimikrobiella ämnen för utskrift genom att följa med i den medföljande text protokoll.Spara protokollet och klicka sedan på knappen Kör längst upp till vänster, följt av Start-knappen. Ladda in en 384-brunnsplatta i plåthållaren, och tryck på Belastad under Load Plate 1 Synergy prompten. Placera sedan en T8+-kassett i kassettskåran och tryck på Laddas under prompten Ladda en T8+Kassett.När du uppmanas till det, tillsätt antibiotikum stamlösning till de indikerade reservoarerna på kassetten. Efter varje lösning har lagts till, tryck på knappen Fylld. När D300 Dispenser har lagt till antibiotikum lager i lämpliga volymer till varje brunn och kör slutförda rutan visas, klicka på Stäng, ta bort plattan, och stänga av D300.Därefter häller du den tidigare beredda bakterieupphängningen i en steril reagensbehållare. Använd en flerkanalig pipett för att lägga till 50 mikroliter av fjädringen till alla brunnar i schackbrädet array. Tillsätt sedan 50 mikroliter av katjonjusterad Mueller-Hinton buljong utan bakterier till en tom brunn.Detta kommer att vara den negativa kontrollen väl att bekräfta sterilitet av media. Inkubera i en 35-graders Celsius omgivande luft inkubator i 16 till 20 timmar. För att analysera testet följer du med i det medföljande textprotokollet.För tid-kill synergy testet, igen förbereda de antimikrobiella lager lösningar som beskrivs i textprotokollet. Gör sedan en 0,5 McFarland suspension av testorganismen i steril saltlösning. Lägg till 100 mikroliter av 0,5 McFarland suspension till fem milliliter CAMHB i en 25-by-150-millimeters glas rund botten kultur rör med rostfritt stål stängning, och virvel försiktigt att blanda.Med hjälp av en steril inokulerande slinga, isolering strimma en droppe av den utspädda suspensionen på en blod agar platta, och inkubera plattan i 35 grader Celsius i omgivande luft för att bekräfta inokulat renhet. Byt ut stängningen på röret, och inkubera den i ett provrörsställe på en shaker vid 35 grader Celsius i omgivande luft i minst 3 timmar, tills logaritmisk-fastillväxt uppnås. Medan den ursprungliga kulturen inkuberar, tillsätt 10 milliliter katjonjusterade Mueller-Hinton buljong till fem autoklaverade glas kulturrör.För en tidsdödare synergi studie, minst ett läkemedel bör vara vid en koncentration som inte påverkar tillväxtkurvan individuellt. Detta kan fastställas genom att utvärdera effekterna av enskilda läkemedelskoncentrationer före synergistudien. Till det första röret, tillsätt 10 mikroliter av en milligram per milliliter colistin lager för att få en slutlig colistin koncentration av ett mikrogram per milliliter, eftersom detta är en koncentration som är ineffektiv mot den stam som används i detta exempel.För det andra röret, tillsätt 10 mikroliter av en milligram per milliliter minocycline lager för att få en slutlig koncentration av ett mikrogram per milliliter. Denna koncentration är också ineffektiv mot den stam som används i detta exempel. Till det tredje röret, tillsätt 10 mikroliter av en milligram per milliliter minocycline lager och 10 mikroliter av ett milligram per milliliter colistin lager.Detta är samma mängd colistin och minocyklin som används i rör ett och två. I fjärde och femte rören, tillsätt inga antibiotika. Detta kommer att vara tillväxtkontroll och de negativa styrrören, respektive.Därefter förbereda 96 djup-väl polypropylen plattor med två-milliliter brunnar för seriell utspädningar genom att lägga till 900 mikroliter av steril koksaltlösning till raderna B genom H av kolumnerna ett till fyra med en flerkanalig pipett. När kulturen är i logaritmisk tillväxtfas, ta bort odlingsröret från shaker, och virvel det försiktigt. Överför en milliliter av fjädringen till ett 12-by-75-millimeters glaskulturrör och kontrollera densiteten med en McFarland-läsare.Om densiteten är mindre än 1,0 McFarland, returnera röret till skakmaskinen och inkubera längre. Om det är större än 1,0 McFarland, tillsätt katjonjusterad Mueller-Hinton buljong till röret, virvel försiktigt, och åter prov tills suspensionen är på 1,0 McFarland. Det är viktigt att kulturen är i logaritmisk tillväxtfasen när man förbereder startinokulatet.Du kan konstruera en tillväxtkurva för att avgöra när en organism når den här fasen. Tillsätt sedan 100 mikroliter av 1,0 McFarland suspension till rör en till fyra, och virvel dem försiktigt. Omedelbart efter blandning och vid en, två, fyra, sex, och 24 timmar, ta bort en 150-microliter alikvot från varje odlingsrör genom att luta röret så att endast den sterila pipetten spets kommer in i röret och inte den osterila pipettor axeln under aliquot tillbakadragande.Lägg till alikvoter, respektive, till på varandra följande brunnar i den första raden av den tidigare beredda 96 djup-väl plattan. Returnera rör till ett provrörsställ på en skakmaskin i en 35-graders Celsius omgivande luft inkubator omedelbart efter att ha tagit bort alikvoter vid varje tidpunkt. Med hjälp av en flerkanalig pipett, ta bort 100 mikroliter från rad A av plattan, och lägg till den i rad B, som innehåller 900 mikroliter av saltlösning, vilket skapar en en-till-10 utspädning.Pipettera lösningen upp och ner fyra till fem gånger för att blanda, och sedan kasta tips. Först, etikett Mueller-Hinton agar plattor med antibiotika villkor och utspädning som skall pläterad. Sedan, platta de utspädda proverna för koloni räknas med hjälp av metoden drop plate, med hjälp av en flerkanalig pipett med extra långa tips.Ta bort 10 mikroliter från varje brunn i kolumn ett, och dispensera försiktigt i rad på lämpligt märkt platta. Fortsätt tills alla rader är dispenserade på plattor. Vid 24-timmars tidspunkten placerar du dessutom en 10-mikroliterdropp som tas direkt från det negativa kontrollröret på den plats som är avsedd för detta för att testa för sterilitet.Sedan, invertera alla plattor, och inkubera dem över natten vid 35 grader Celsius i omgivande luft. Räkna sedan antalet kolonier på varje område, och beräkna celltätheten. Markera kolonier med en finspets permanent markör på baksidan av plattan för att undvika dubbelräkning eller saknade kolonier.För varje utspädningsserie identifierar du droppar med tre till 30 kolonier. Räkna kolonierna i dessa droppar, och spela in räkningen tillsammans med utspädningsfaktorn. Här visas ett rutnät från ett schackbräde array synergi experiment där minocycline i koncentrationer av noll till 32 mikrogram per milliliter kombinerades med colistin vid koncentrationer av noll till 16 mikrogram per milliliter och testas mot en stam av E.coli.Brunnar med OD600-värden under 07 representerar ingen tillväxt och är skuggade röda, medan brunnar med OD600-värden ovan eller lika med 07 representerar tillväxt och är skuggade gröna. För varje läkemedel är den minsta hämmande koncentrationen den lägsta koncentrationen av läkemedel som hämmar bakterietillväxt. För minocyklin är detta 32 mikrogram per milliliter, och för kolistin är det åtta mikrogram per milliliter.Skuggningen behålls här, men värden inom de brunnar där tillväxten hämmas ersätts av fraktionerad hämmande koncentration, eller FIC, indexvärden. I varje brunn beräknas FIC-indexet för varje läkemedel genom att dividera koncentrationen av antibiotika i den brunnen med läkemedlets minsta hämmande koncentration. Brunnar med ett FIC-index på mindre än eller lika med 0,5, som anses vara cutoff för synergi, anges med en bruten linje gräns, och brunnen med den lägsta FIC index är feted.Eftersom det lägsta FIC-värdet finns i det synergistiska intervallet anses kombinationen vara synergistisk. Ett exempel på ett fall som inte visar synergi visas här, eftersom det lägsta FIC-index där tillväxten hämmas är ett, som är större än 0,5. Slutligen i detta exempel, flera överhoppade brunnar inträffade, vilket representerar bakterietillväxt som hämmas, trots förekomsten av bakterietillväxt i intilliggande brunnar med högre koncentrationer av antibiotika.Om mer än en hoppade väl inträffade i ett schackbräde array, bör resultaten kasseras och analysen upprepas. Ett exempel på ett diagram som visar resultat av en time-kill synergy analys presenteras här. Vänligen se den medföljande textprotokoll för detaljer om tolkning av time-kill synergy assay.Ytterligare information om aktiviteterna för synergistiska kombinationer kan erhållas genom utvärderingar av farmakokinetik och farmakodynamik samt genom in vivo-studier med djurmodeller. Följ alltid lämpliga säkerhetsrutiner, inklusive användning av personlig skyddsutrustning, när du arbetar med bakterier. Om du genererar aerosoler eller använder högriskpatogener, utför allt arbete i ett biosäkerhetsskåp.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

Antimikrobiell resistensbestämning av Mycobacterium tuberculosis komplex för första och andra linjens läkemedel med buljong utspädning i ett mikrotiterplattan format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

En dag Workflow Program för bakteriell patogen Detection och provning av antimikrobiell resistens från blododlingar

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

Bedömning av förändringar Nedsatt Metabola Under Progressiv koloniseringen av bakteriefri mus med 1 H NMR-spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR-analys f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analys av epitelskada Producerad av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Hög genomströmning, i realtid, med dubbla avläsning Provning av intracellulära antimikrobiell aktivitet och eukaryot cell cytotoxicitet

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

De<em&gt; Ex vivo</em&gt; Colon orgel kultur och dess användning i Antimicrobial värdförsvaret Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering, karakterisering och rening av makrofager från vävnader som påverkas av fetma-relaterade Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Tryckta Glycan Array: En känslig teknik för analys av repertoaren av cirkulerande anti kolhydrat antikroppar i små djur

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiserad beteendevetenskaplig analys av stor C. elegans populationer med ett brett fält-of-view spårning plattform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...