Name: enrich and expand rare antigen-specific t cells with magnetic nanoparticles
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles at JoVE.com

بفضل J.W.H. في مركز تدريب تقنية النانو السرطان المعاهد الوطنية للصحة في معهد جونز هوبكنز النانوية، والوطني العلم مؤسسة الدراسات العليا بحوث الزمالة (DGE-1232825)، ومؤسسة جمعية الهلال الأحمر الأفغاني لدعم الزمالة. تم تمويل هذا العمل بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (P01-AI072677، R01-CA108835، R21-CA185819)، ومبادرة الابتكار تيدكو/ولاية ماريلاند، ومؤسسة كولتر (JPS).

وأبقى على جميع الفئران كل المبادئ التوجيهية التي أقرها "مجلس المراجعة المؤسسية" جامعة جونز هوبكنز.
1. تحميل الكبرى Dimeric Histocompatibility مجمع الغلوبولين المناعي الانصهار البروتين (MHC-Ig) مع تسلسل الببتيد مستضد المرجوة.
ملاحظة: إذا كان استخدام ح 2 كيلو بايت: المفتش العام،...

<ol>
	<li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=immunotherapy:+Tisagenlecleucel-the+first+approved+Car-t-cell+therapy:+implications+for+payers+and+policy+makers.">immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).</li><li>Jenkins, M. K., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+naive+T+cell+precursor+frequency+and+recruitment+in+dictating+immune+response+magnitude.">The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude.</a> The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).</li><li>Rizzuto, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-antigen-specific+CD8++T+cell+precursor+frequency+determines+the+quality+of+the+antitumor+immune+response.">Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).</li><li>Newell, E. W., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+model+antigens:+high-dimensional+methods+for+the+analysis+of+antigen-specific+T+cells.">Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells.</a> Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+expansion+with+nanoscale+artificial+antigen+presenting+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy.</a> ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).</li><li>Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+T+Cell+Targeting+Components+onto+Magnetically+Clustered+Nanoparticles+Boosts+Activation.">Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation.</a> Nano Letters. , (2018).</li><li>Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologically+Inspired+Design+of+Nanoparticle+Artificial+Antigen-Presenting+Cells+for+Immunomodulation.">Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation.</a> Nano Letters. 17 (11), (2017).</li><li>, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+magnetic+enrichment+of+antigen-specific+T+cells+by+engineering+particle+properties.">Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties.</a> Biomaterials. , (2018).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+purification+of+CD8++melan-A-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+adoptive+transfer+in+tumor+immunotherapy.">Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).</li><li>Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+CAR+T+cells+for+adoptive+therapy+in+the+context+of+glioblastoma+standard+of+care.">Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).</li><li>Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+generating+CD8++T-cell+clones+for+immunotherapy+from+the+naive+repertoire.">In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire.</a> Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+complementary+methods+for+predicting+peptides+binding+major+histocompatibility+complex+molecules1.">Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1.</a> Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).</li><li>Castle, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+mutanome+for+tumor+vaccination.">Exploiting the mutanome for tumor vaccination.</a> Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).</li><li>Duan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+bioinformatic+profiling+of+mutational+neoepitopes+reveals+new+rules+to+predict+anticancer+immunogenicity.">Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).</li><li>Srivastava, P. K., Duan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+antigenic+fingerprint+of+each+individual+cancer+for+immunotherapy+of+human+cancer:+genomics+shows+a+new+way+and+its+challenges.">Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+immunogenic+tumour+mutations+by+combining+mass+spectrometry+and+exome+sequencing.">Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing.</a> Nature. 515 (7528), 572 (2014).</li><li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+neoantigen-specific+lymphocytes+in+the+peripheral+blood+of+melanoma+patients.">Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.</a> Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).</li></ol>

وقد أنشأنا تكنولوجيا عزلة رواية خلية T حدة مستضد استناداً إلى مستضد نانوحبيبات الاصطناعية عرض الخلايا (آبكس). آبكس نانوحبيبات الببتيد-بتحميله MHC على السطح يسمح ملزمة محددة مستضد T الخلية والتنشيط جنبا إلى جنب مع تنشيط كوستيمولاتوري. آبكس باراماجنيتيك، هي أيضا، وهكذا يمكن استخدامها لإثراء ...

مع ظهور العديد من إيمونوثيرابيس، هناك حاجة لتكون قادرة على توصيف والتحكم في الاستجابات المناعية. على وجه الخصوص، الاستجابة المناعية التكيفية للفائدة بسبب خصوصية ومتانة الخلايا. في الآونة الأخيرة، تمت الموافقة على العلاج خلايا تي مستقبلات مستضد تشيميريك لعلاج السرطان؛ ومع ذلك، تستند المستضد-المستقبلات قبالة المشتركة الخلية السطحي antigen CD19، بدلاً من مولدات المضادات الخاصة ب السرطان1. تتجاوز الخصوصية، يمكن إيمونوثيرابيس تعاني أيضا من عدم وجود مراقبة، وفهم الاستجابة المناعية الحيوية داخل السرطان أو المناعة الذاتية المحدودة.
يتمثل أحد التحديات دراسة استجابات محددة مستضد تلك الغاية منخفضة التردد، على سبيل المثال.، محددة مستضد خلايا تي هي 1 من كل 104 إلى6 ر 10 خلايا2،3. وهكذا، للتحقيق في أي تي الخلايا موجودة أو الاستجابة، الخلايا تحتاج إلى أما إثراء وتوسيع، أو الإشارة بحاجة إلى تفصيل. أنها مكلفة وصعبة للحفاظ على تغذية الخلايا باستخدام التقنيات الحالية التي تركز على توسيع نطاق خلايا محددة مستضد. التقنيات الحالية التي تركز على تضخيم إشارة محددة مستضد تي الخلايا، مثل الاعتداء إيمونوسبوت المرتبط بالانزيم (السبت)، والحد من إعادة استخدام تلك الخلايا تي4. أخيرا، بسبب حساسية منخفضة، غالباً ما هذه التقنيات اثنين تحتاج إلى تكون مجتمعة لتعداد محددة مستضد.
لمعالجة هذه القضايا، وقد وضعنا مستضد الاصطناعي المغناطيسي على أساس نانوحبيبات عرض الخلية (آبك)5،6،7،8. يمكن فونكتيوناليزيد آبك مع مجمع محددة مستضد إشارة هضميد تحميل histocompatibility رئيسية (الرهن العقاري)-وجزيئات كوستيمولاتوري-مثلاً.، جسم CD28 مكافحة-على حد سواء إثراء محددة مستضد خلايا تي ومن ثم في وقت لاحق حفز التوسع فيها (الشكل 1). وهكذا يمكن الجسيمات منتجات جاهزة فعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن يكون على حد سواء تخصيصها لتلبية محددة مستضد التحفيز بعد موحدة عبر التجارب والمرضى. القيام بتخصيب اليورانيوم وتوسيع عملية النتائج في مئات آلاف إضعاف توسيع نطاق خلايا CD8 + "تي" حدة مستضد ويمكن أن ينتج ترددات تصل إلى 60 في المائة بعد أسبوع واحد فقط، يمكن توصيف أو الاستخدام العلاجي الكبير عدد الخلايا. هنا، ونحن تصف كيفية جعل نانوحبيبات آبكس، بعض اعتبارات التصميم الحاسم في اختيار خصائص نانوحبيبات، وإظهار بعض النتائج النموذجية عن طريق الاستفادة من هذه الجسيمات في عزل وتوسيع نطاق خلايا CD8 + "تي" محددة مستضد نادرة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1136px;" width="1136">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">551263</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">551323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">550750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Vivaspin 20 MWCO 50 000</td>
			<td style="width:207px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:168px;">28932362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Vivaspin 2 MWCO 50 000</td>
			<td style="width:207px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:168px;">28932257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Purified Human Beta 2 Microglobulin</td>
			<td style="width:207px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:168px;">PHP135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles</td>
			<td style="width:207px;">Micromod</td>
			<td style="width:168px;">79-01-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:207px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:168px;">SN0200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-105-637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td style="width:207px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:168px;">20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Sulfo-SMCC Crosslinker&#160;</td>
			<td style="width:207px;">ProteoChem</td>
			<td style="width:168px;">c1109-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">2-Iminothiolane hydrochloride</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">I6256 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:168px;">3875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">FITC Rat Anti-Mouse Ig, &#955;1, &#955;2, &#38; &#955;3 Light Chain&#160; Clone &#160;R26-46&#160;&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">553434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG&#160; Clone &#160;G192-1</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">554026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice</td>
			<td style="width:207px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:168px;">005023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">C57BL/6J (B6 wildtype) mice</td>
			<td style="width:207px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:168px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">MS Columns</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">LS Columns</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE</td>
			<td style="width:207px;">Biolegend</td>
			<td style="width:168px;">405203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">N52 disk magnets of 0.75 inches&#160;</td>
			<td style="width:207px;">K&#38;J Magnetics</td>
			<td style="width:168px;">DX8C-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7</td>
			<td style="width:207px;">Biolegend</td>
			<td style="width:168px;">100711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation&#160;</td>
			<td style="width:207px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:168px;">L-34969</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrich and expand rare antigen-specific t cells with magnetic nanoparticles

قمنا بتطوير أداة لكل من إثراء وتوسيع نطاق خلايا تي حدة مستضد. وهذا يمكن أن يكون مفيداً في حالات مثل A) الكشف عن وجود خلايا تي مستضد على حدة، ب) التحقيق في ديناميات استجابات محددة مستضد، ج) فهم كيف تؤثر ردود محددة مستضد على حالة المرض مثل المناعة الذاتية، د) الغموض غير متجانسة استخدام استجابات محددة مستضد خلايا تي، أو ه) محددة مستضد الخلايا للعلاج. الأداة تستند جسيمات مغناطيسية نحن متزاوجة مستضد على حدة وإشارات الخلية تي كوستيمولاتوري، ونحن المدى مصطنعة مستضد تقديم الخلايا (آبكس). ونتيجة لذلك، ولما بسيطة لإنتاج التكنولوجيا، يمكن بسهولة يتم اعتماده بمختبرات أخرى؛ وهكذا، هدفنا هنا لوصف بالتفصيل بتصنيع واستخدام اللاحقة آبكس. نشرح كيفية إرفاق إشارات محددة مستضد وكوستيمولاتوري آبكس وكيفية الاستفادة منها لإثراء لخلايا تي حدة مستضد وكيفية توسيع نطاق خلايا محددة مستضد تي. وعلاوة على ذلك، سوف نسلط الضوء التصميم الهندسي الاعتبارات استناداً إلى المعلومات التجريبية والبيولوجية من تجربتنا مع تميز خلايا تي محددة مستضد.

لإكمال نجاح الإثراء والتوسع في خلايا تي حدة مستضد، محملة الببتيد MHC-Ig وجزيئات كوستيمولاتوري بنجاح ترفق بالجسيمات آبك. استناداً إلى أساليب 3 من مرفق الجسيمات، نقدم بعض بيانات تمثيلية لنتيجة إجراء اقتران ناجحة (الشكل 5a). وفي الواقع، إذا كانت كثافة يجند منخف?...

Watch this Scientific Journal Video about Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles at JoVE.com

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

محددة مستضد خلايا تي من الصعب أن تميز أو تستخدم في العلاج بسبب هذه الغاية منخفضة التردد. هنا، نحن نقدم بروتوكول لتطوير جسيمات مغناطيسية التي يمكن ربط محددة مستضد خلايا تي لإثراء هذه الخلايا ومن ثم توسيعها عدة عف لتوصيف والعلاج على حد سواء.

إثراء وتوسيع نطاق خلايا نادرة محددة مستضد تي مع جسيمات نانوية مغناطيسية

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

وبالتالي فإن الميزة الرئيسية لتقنيتنا الجديدة، يطلق عليها E plus E، التي ترمز إلى الإثراء بالإضافة إلى التوسع، هي أنه يمكننا إثراء وتوسيع هذه الخلايا، خلايا مستضدية نادرة محددة، في وقت واحد. وهذا يسمح لنا بتطوير عدد كاف من الخلايا التي نحن في طريقنا إلى أن تكون قادرة على استخدام للتحقيق دورها في بيئات مختلفة وفي بيئات سريرية مختلفة أو حتى يسمح لنا لتطوير الآن عدد كبير من الخلايا التي يمكننا الاستفادة من العلاج المناعي بطريقة أننا لم نتمكن من قبل. الطريقة التي قمنا بتطويرها، هذا E زائد E، يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم المناعة الأساسية حول وجود neoepitopes.ما هي النيوبيات؟ تلك هي epitopes الشخصية التي نعرفها هي الآن مهمة جدا من حيث العلاج المناعي للسرطان وأيضا ديناميات مستضد معين وكيف تؤثر هذه العوامل على حالات المرض والعلاج الخلوي الفعال. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج المناعي ، حيث يمكن أن تكون الخلية الاصطناعية لتقديم المستضدات النانوية منتجًا جاهزًا مصممًا بسهولة لاستجابات المناعة الفردية للمرضى.لتوليد الخلايا الاصطناعية التي تقدم مستضد نانو، resuspend الجسيمات الميوفيلي في ملليلتر واحد من عازلة resuspension ودوامة بقوة تعليق لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى لا تكون المجاميع مرئية. الجسيمات لا دوامة بما فيه الكفاية و resuspended قبل التفاعل مع البروتين سيؤدي إلى أكبر الجسيمات المجمعة التي لا يمكن فصلها. ضع الجسيمات المغناطيسية على حامل مغناطيسي لإزالة المسرع و resuspend لهم مع 0.5 ملليلتر من عازلة resuspension الطازجة.نقل تعليق الجسيمات إلى قارورة التكتل الزجاجي للدوامة حتى لا تكون المجاميع مرئية، وإضافة 0.1 ملليغرام من مجموع الإشارات المحفزة لكل ملليغرام واحد من الجسيمات resuspended. بعد دوامة، والسماح للتعليق للرد لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع خلط في دوار، تليها إضافة 0.1 ملليلتر من عازلة التبريد لاحتضان إضافية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الاختلاط. في نهاية التفاعل الثاني، ضع قارورة التلألؤ على الحامل المغناطيسي واغسل الجسيمات في ملليلتر واحد من عازلة إعادة الراسبوسين أربع مرات، وإزالة العازلة عندما يتحول واضح بعد كل غسل واستبداله مع عازلة إعادة التدهور الطازجة لغسل لاحقة على المغناطيس.بعد الغسيل الأخير ، استلهم المحلل وأزيل الجسيمات من الحامل المغناطيسي ، ثم قم بتخزين الجسيمات في ملليلتر واحد من عازلة إعادة التدهور الطازجة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. لعزل الخلايا CD8 + T الخاصة المستضد، اضمح الطحال والعقد الليمفاوية من النوع البري C57 الفئران السوداء 6J من خلال مصفاة خلية معقمة، 70 ميكرومتر مع شطف برنامج تلفزيوني متكررة واستخدام طقم عزل الخلايا CD8 + T بدون اتصال وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للقضاء على الخلايا غير CD8 +T. بعد العد، وجمع معزولة CD8 + T الخلايا عن طريق الطرد المركزي و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تكمل مع 0.5٪ بوفين مصل الألبومين واثنين من ملليمولار EDTA، ثم احتضان الخلايا مع الخلايا الاصطناعية مستضد تقديم النانو بحيث أن هناك مرة واحدة 10 إلى 11th الببتيد محملة MHC-IG في مرة واحدة 10 إلى الخلايا CD8 + T المعزولة السادسة في العقيمة ، خمسة ملليلتر البوليسترين أنبوب مستدير القاع لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية مع خلط مستمر.في نهاية الحضانة، وغسل تعليق خلية الجسيمات النانوية ثلاث مرات على موقف مغناطيسي كما هو موضح، resuspending الخلايا الاصطناعية عرض مستضد والخلايا CD8 + T المخصب في 500 ميكرولترات من الطازجة، تكمل المتوسطة مع 1٪ T عامل نمو الخلايا بعد الغسيل الماضي. للحصول على أقصى قدر من استعادة الخلايا، من المهم ترك الجسيمات والخلايا على العمود المغناطيسي لمدة دقيقتين على الأقل، والطامح المخزن بعناية دون تعطيل الجسيمات والخلايا الخاضعة للمجال المغناطيسي. بعد العد، بذور 2.5 مرات 10 إلى الخامس المخصب CD8 + T الخلايا والجسيمات المغناطيسية خليط لكل 160 ميكرولترات من المتوسط المكمل بالإضافة إلى 1٪ TCGF في 96-جيدا يو القاع لوحة.في اليوم الثالث، تغذية الخلايا مع 80 ميكرولترات من المتوسطة المكملة مع عامل نمو خلية T 2٪ في بئر وعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربعة أيام أخرى. في اليوم السابع، حصاد الخلايا المحفزة في أنبوب دائري القاع خمسة ملليلتر للعد وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تكملها 0.05٪ أزيديد الصوديوم و 2٪ مصل الأبقار الجنينية للعد و aliquot خمس مرات 10 إلى الرابعة إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في أنابيب جديدة مستديرة القاع خمسة ملليلتر لتلطيخ مستضد معين.تسمية الأنابيب المناسبة مع biotinylated MHC-IG ومكافحة الماوس CD8a لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية، تليها غسل الطرد المركزي في برنامج تلفزيوني جديد لإزالة أي الغلوبولين المناعي الحيوي الزائد، ثم وصمة عار العينات مع جسم مضاد ثانوي مناسب streptavidin-مترافق و سلالة الخلايا الميتة حية ميتة مناسبة قابلة للإصلاح لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية وقراءة الخلايا على مقياس تدفق لتحديد خصوصية وعدد من الخلايا CD8 + T المضادة الخاصة مستضد وفقا للبروتوكولات القياسية. هنا تم تحقيق اقتران البروتين الناجح باستخدام ثلاث طرق مختلفة من البروتين المرفق بالجسيمات. إذا كانت كثافة الرابطة AAPC منخفضة جدا, لن يكون هناك تحفيز فعال من الخلايا CD8 + T المضادة الخاصة.ويمكن استكمال مراقبة الجودة من خافض biotinylated على الخلايا CD8 + T المعدلة وراثيا للتحقق من تلطيخ. على سبيل المثال، تظهر هذه النتائج التمثيلية تلطيخ إيجابي مع خلايا CD8 + T محددة gp100 مع خلايا B6 CD8 +T غير خاصة مستضدية كتحكم في الخلفية. وعلاوة على ذلك، فإن معرفة الخلفية تلطيخ من ديمر biotinylated أمر بالغ الأهمية، كما ينبغي اعتبار أي نسبة مئوية أقل من هذا التلطخ في الأنابيب الملطخة cognate نتيجة سلبية.بعد سبعة أيام من التخصيب والتوسع، بين مرتين 10 إلى الرابعة واثنين من 10 إلى الخامس مستضد محددة وخمسة إلى 50٪ CD8 + الخلايا التائية يمكن أن يتوقع من الأصلي خمس مرات 10 إلى السادسة الذاتية CD8 + T خلية بدء. ويمكن استخدام نفس المنهجية لعزل وتحفيز خلايا CD8 +T الخاصة بمستضد بشري مع زيادات مماثلة في النسب المئوية وأعداد خلايا CD8 +T الخاصة بالمستضدات التي لوحظت بعد أسبوع واحد فقط من التوسع بعد التخصيب. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر إجراء فحوصات جودة الكاشف المناسبة كما هو موضح.بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عملية استئصال الخلايا المتدفقة لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا أو تعبير البروتين السطحي للإجابة على أسئلة إضافية حول وظيفة الخلايا أو النمط الظاهري للخلايا. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة الأساسي لاستكشاف اتساع وعمق وديناميات الاستجابات الخاصة بالمستضد في مجالات طبية حيوية أخرى مثل السرطان أو الأمراض المعدية أو أبحاث المناعة الذاتية.

Research

JoVE Journal

Engineering

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

توليف المرحلة تحول Nanoemulsions مع حجم التوزيعات الضيقة للتبخير القطرة الصوتية وفقاعة محسنة تذرية بوساطة الموجات فوق الصوتية

High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Optical Trapping of Nanoparticles

البصرية محاصرة من الجسيمات النانوية

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Probing and Mapping Electrode Surfaces in Solid Oxide Fuel Cells

التحقيق ورسم الخرائط أسطح الكهربائي في خلايا الوقود الصلبة أكسيد

Solid oxide fuel cells (SOFCs) are potentially the most efficient and cost-effective solution to utilization of a wide variety of fuels beyond hydrogen ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

التوليف وFunctionalization من النيتروجين مخدر الكؤوس الأنابيب الجزيئية الكربونية مع جزيئات الذهب كما سدادات الفلين

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Electroactive Polymer Nanoparticles Exhibiting Photothermal Properties

خصائص Electroactive البوليمر النانوية نستعرض ضوئي؛ ضوحراري

A method for the synthesis of electroactive polymers is demonstrated, starting with the synthesis of extended conjugation monomers using a three-step ...

Plasmonic Trapping and Release of Nanoparticles in a Monitoring Environment

Plasmonic اصطياد والإفراج عن النانوية في بيئة المراقبة

Plasmonic tweezers use surface plasmon polaritons to confine polarizable nanoscale objects. Among the various designs of plasmonic tweezers, only a few ...

Enhanced Electron Injection and Exciton Confinement for Pure Blue Quantum-Dot Light-Emitting Diodes by Introducing Partially Oxidized Aluminum Cathode

حقن الإلكترون المحسنة وحبس أكسيتون للصمامات الثنائية – ينبعث الضوء الكم-نقطة زرقاء نقية بإدخال الكاثود الألومنيوم المؤكسد جزئيا

Stable and efficient red (R), green (G), and blue (B) light sources based on solution-processed quantum dots (QDs) play important roles in next-generation ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

الطباعة الحجرية شعاع الإلكترون نانومتر ذات الأرقام المفردة مع مجهر إلكتروني انتقال المسح ضوئي لتصحيح الانحراف

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

Large Area Substrate-Based Nanofabrication of Controllable and Customizable Gold Nanoparticles Via Capped Dewetting

مساحة كبيرة على أساس الركيزة النانومترى من جسيمات نانوية الذهب يمكن السيطرة عليها وقابلة للتخصيص عبر توج ديويتينج

Recent scientific advances in the utilization of metallic nanoparticle for enhanced energy conversion efficiency, improved optical device performance, and ...

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

توليف، الروغان، وتوصيف جسيمات نانوية مسامية السليكون فوسوجينيك لإيصال اليغنوكليوتيد

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...