Name: enrich and expand rare antigen-specific t cells with magnetic nanoparticles
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles at JoVE.com

J.W.H. תודה מרכז ההדרכה ננוטכנולוגיה של סרטן NIH במכון ג'ונס הופקינס ביוננוטכנולוגיה הלאומית למדע קרן בוגר מחקר לאחווה (DGE-1232825), קרן קשתות לקבלת מלגת תמיכה. עבודה זו מומן על ידי תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (R21 P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), יוזמה וחדשנות TEDCO/מרילנד, את קולטר קרן והאמון.

כל העכברים היו נשמרים לפי הנחיות שאושרו על-ידי הועד המוסדי של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.
1. לטעון Dimeric מתחם Histocompatibility מייג'ור נוגדן חלבון כימרי (MHC-Ig) עם רצף פפטיד אנטיגן הרצוי.
הערה: אם משתמש H - 2Kb: Ig, ולאחר מכן פעל פרוטוקול מפורט ב 1.1 שלב; אם משתמש H-2Db:Ig, ולאחר מכן פעל ?...

<ol>
	<li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=immunotherapy:+Tisagenlecleucel-the+first+approved+Car-t-cell+therapy:+implications+for+payers+and+policy+makers.">immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).</li><li>Jenkins, M. K., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+naive+T+cell+precursor+frequency+and+recruitment+in+dictating+immune+response+magnitude.">The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude.</a> The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).</li><li>Rizzuto, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-antigen-specific+CD8++T+cell+precursor+frequency+determines+the+quality+of+the+antitumor+immune+response.">Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).</li><li>Newell, E. W., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+model+antigens:+high-dimensional+methods+for+the+analysis+of+antigen-specific+T+cells.">Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells.</a> Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+expansion+with+nanoscale+artificial+antigen+presenting+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy.</a> ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).</li><li>Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+T+Cell+Targeting+Components+onto+Magnetically+Clustered+Nanoparticles+Boosts+Activation.">Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation.</a> Nano Letters. , (2018).</li><li>Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologically+Inspired+Design+of+Nanoparticle+Artificial+Antigen-Presenting+Cells+for+Immunomodulation.">Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation.</a> Nano Letters. 17 (11), (2017).</li><li>, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+magnetic+enrichment+of+antigen-specific+T+cells+by+engineering+particle+properties.">Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties.</a> Biomaterials. , (2018).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+purification+of+CD8++melan-A-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+adoptive+transfer+in+tumor+immunotherapy.">Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).</li><li>Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+CAR+T+cells+for+adoptive+therapy+in+the+context+of+glioblastoma+standard+of+care.">Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).</li><li>Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+generating+CD8++T-cell+clones+for+immunotherapy+from+the+naive+repertoire.">In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire.</a> Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+complementary+methods+for+predicting+peptides+binding+major+histocompatibility+complex+molecules1.">Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1.</a> Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).</li><li>Castle, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+mutanome+for+tumor+vaccination.">Exploiting the mutanome for tumor vaccination.</a> Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).</li><li>Duan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+bioinformatic+profiling+of+mutational+neoepitopes+reveals+new+rules+to+predict+anticancer+immunogenicity.">Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).</li><li>Srivastava, P. K., Duan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+antigenic+fingerprint+of+each+individual+cancer+for+immunotherapy+of+human+cancer:+genomics+shows+a+new+way+and+its+challenges.">Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+immunogenic+tumour+mutations+by+combining+mass+spectrometry+and+exome+sequencing.">Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing.</a> Nature. 515 (7528), 572 (2014).</li><li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+neoantigen-specific+lymphocytes+in+the+peripheral+blood+of+melanoma+patients.">Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.</a> Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).</li></ol>

יצרנו טכנולוגיה בידוד תא T אנטיגן ספציפי רומן המבוסס על ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן הצגת תאים (aAPCs). ננו-חלקיק aAPCs יש פפטיד-טעון MHC על פני השטח המאפשר תא T אנטיגן ספציפי קשירה והפעלה לצד הפעלת co-stimulatory. aAPCs גם הם פאראמגנטיים ולאחר ולכן יכול לשמש כדי להעשיר את תאי T אנטיגן ספציפי נדיר, באמצעות שדה מג?...

עם עליית immunotherapies רבים, יש צורך להיות מסוגלים לאפיין ולשלוט תגובות מערכת החיסון. בפרט, התגובה החיסונית מסתגלת היא עניין בשל ירידה לפרטים העמידות של התאים. לאחרונה, טיפולים chimeric אנטיגן-קולטן תא T אושרו לטיפול בסרטן; עם זאת, אנטיגן-הקולטנים מבוססים הנחה נפוצה תא השטח אנטיגן CD19, במקום אנטיגנים ספציפיים סרטן1. מעבר יחודיות, immunotherapies יכול גם סובלים מחוסר שליטה, ומוגבל להבנת התגובה החיסונית דינאמיים בתוך סרטן או מחלת חיסון עצמי.
הוא אחד האתגרים של הלומדים אנטיגן ספציפי תגובות שלהם בתדר נמוך מאוד, למשל., תאי T אנטיגן ספציפי הם 1 מתוך כל 104 עד 106 T תאים2,3. לפיכך, כדי לחקור איזה T תאים קיימים או להגיב, התאים צריכים להיות מועשר או מורחבת, או האות שלהם צריך להיות מוגבר. זה יקר וקשה לשמור על התאים מזין תוך שימוש בטכניקות הנוכחי פוקוס על ההתרחבות של תאים אנטיגן ספציפי. טכניקות הנוכחי התמקד מגביר את האיתות של אנטיגן ספציפי T תאים, כמו assay מקושרים-אנזים immunospot (ELISPOT), להגביל להשתמש מחדש של התאים אלה T4. לבסוף, בגלל רגישות נמוכה, לעיתים קרובות אלה שתי טכניקות צריך להיות משולבת עבור ספירה אנטיגן ספציפי.
כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו את מגנטיים מבוססי ננו-חלקיק מלאכותי אנטיגן המציג תא (aAPC)5,6,7,8. יכול להיות functionalized את aAPC עם קומפלקס אנטיגן ספציפי אות-פפטיד טעון histocompatibility הגדולות (pMHC) - ומולקולות co-stimulatory -למשל., נוגדן anti-CD28-לשניהם להעשיר את תאי T אנטיגן ספציפי ולאחר מכן לאחר מכן לעורר התרחבותן (איור 1). החלקיקים ולכן יכול להיות מוצר מדף חסכונית יכול להיות הן אישית כדי שיענה אנטיגן ספציפי stimulations עדיין סטנדרטית על פני ניסויים ומטופלים. ביצוע של העשרה והרחבה לעיבוד תוצאות מאות אלפים קיפול להתרחבות תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי ולא יכול לגרום תדרים עד 60 אחוזים לאחר רק שבוע אחד, המאפשר את אפיון או טיפולית השימוש הגדול מספר התאים. במסמך זה, אנו מתארים כיצד ליצור ננו-חלקיק aAPCs, כמה קריטי בעיצוב שיקולים בבחירת המאפיינים ננו-חלקיק, להדגים כמה תוצאות טיפוסיות של ניצול החלקיקים בידוד והרחבת תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי נדיר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1136px;" width="1136">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">551263</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">551323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">550750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Vivaspin 20 MWCO 50 000</td>
			<td style="width:207px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:168px;">28932362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Vivaspin 2 MWCO 50 000</td>
			<td style="width:207px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:168px;">28932257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Purified Human Beta 2 Microglobulin</td>
			<td style="width:207px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:168px;">PHP135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles</td>
			<td style="width:207px;">Micromod</td>
			<td style="width:168px;">79-01-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:207px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:168px;">SN0200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-105-637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td style="width:207px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:168px;">20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Sulfo-SMCC Crosslinker&#160;</td>
			<td style="width:207px;">ProteoChem</td>
			<td style="width:168px;">c1109-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">2-Iminothiolane hydrochloride</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">I6256 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:168px;">3875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">FITC Rat Anti-Mouse Ig, &#955;1, &#955;2, &#38; &#955;3 Light Chain&#160; Clone &#160;R26-46&#160;&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">553434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG&#160; Clone &#160;G192-1</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">554026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice</td>
			<td style="width:207px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:168px;">005023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">C57BL/6J (B6 wildtype) mice</td>
			<td style="width:207px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:168px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">MS Columns</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">LS Columns</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE</td>
			<td style="width:207px;">Biolegend</td>
			<td style="width:168px;">405203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">N52 disk magnets of 0.75 inches&#160;</td>
			<td style="width:207px;">K&#38;J Magnetics</td>
			<td style="width:168px;">DX8C-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7</td>
			<td style="width:207px;">Biolegend</td>
			<td style="width:168px;">100711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation&#160;</td>
			<td style="width:207px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:168px;">L-34969</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrich and expand rare antigen-specific t cells with magnetic nanoparticles

פיתחנו כלי הן להעשיר ולהרחיב את תאי T אנטיגן ספציפי. הדבר יכול להיות שימושי במקרים כגון א) להבחין בקיומה של תאי T אנטיגן ספציפי, ב) לחקור את הדינמיקה של אנטיגן ספציפי תגובות, ג) להבין כמה תגובות אנטיגן ספציפי משפיעים על מצב מחלה כגון מחלת חיסון עצמי, ד) להזדהותו הטרוגניות תגובות עבור תאי T אנטיגן ספציפי או E) לנצל תאים אנטיגן ספציפי לטיפול. הכלי מבוסס על חלקיקים מגנטיים כי אנחנו נזווג אנטיגן ספציפי של אותות co-stimulatory תא T, כך שאנחנו טווח כמו מלאכותי אנטיגן הצגת תאים (aAPCs). כתוצאה מכך, מאז הטכנולוגיה היא פשוט לייצר, זה יכול בקלות להיות שאומצה על ידי מעבדות אחרות; לכן, המטרה שלנו כאן הוא לתאר בפירוט את ייצור ושימוש עוקבות aAPCs. נסביר כיצד לצרף אותות אנטיגן ספציפי, co-stimulatory aAPCs, כיצד לנצל אותם כדי להעשיר עבור תאי T אנטיגן ספציפי וכיצד להרחיב את תאי T אנטיגן ספציפי. יתר על כן, אנו ידגיש הנדסה עיצוב שיקולים בהתבסס על מידע ניסיוני והביולוגיה של הניסיון שלנו עם אפיון בתאי T אנטיגן ספציפי.

כדי להשלים מוצלחת העשרה והרחבה של תאי T אנטיגן ספציפי, טעון-פפטיד MHC-Ig ומולקולות co-stimulatory בהצלחה להצמיד את החלקיקים aAPC. המבוסס על שיטות 3 של חלקיקים המצורף, אנו מספקים חלק מהנתונים נציג תוצאה הליך ההטיה מוצלחת (איור 5a). אכן, אם ליגנד צפיפות נמוכה מדי, ואז לא יה?...

Watch this Scientific Journal Video about Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles at JoVE.com

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

תאי T אנטיגן ספציפי קשים לאפיין או לנצל טיפולים עקב שלהם בתדר נמוך מאוד. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול לפתח חלקיק מגנטי אשר ניתן לאגד בתאי T אנטיגן ספציפי כדי להעשיר תאים אלה ולאחר מכן להרחיב אותם כמה פי100 אפיון וטיפול.

להעשיר ולהרחיב בתאי T אנטיגן ספציפי נדיר עם חלקיקים מגנטיים

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

אז היתרון העיקרי של הטכניקה החדשה שלנו, אנחנו מכנו את זה E פלוס E, אשר מייצג העשרה בתוספת התרחבות, היא שאנחנו יכולים להעשיר ולהרחיב את התאים האלה, תאים אנטיגן ספציפיים נדירים, בו זמנית. זה מאפשר לנו לפתח מספר מספיק של תאים שאנחנו הולכים להיות מסוגלים להשתמש כדי לחקור את תפקידם בהגדרות שונות ובמסגרות קליניות שונות או אפילו מאפשר לנו לפתח עכשיו מספר גדול של תאים שאנחנו יכולים לנצל עבור אימונותרפיה באופן שאנחנו לא יכולים לפני. השיטה שפיתחנו, E פלוס E זה, יכול לעזור לענות על שאלות מפתח באימונולוגיה בסיסית על נוכחות של neoepitopes.מה הם ניאופיטופים? אלה הם epitopes אישית שאנחנו יודעים עכשיו חשובים מאוד במונחים של אימונותרפיה סרטן וגם דינמיקה ספציפית אנטיגן וכיצד גורמים אלה משפיעים על מצבי המחלה ועל טיפול תאי יעיל. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון אימונותרפיה, כיוון שתא אנטיגן מלאכותי ננו-חלקיקי יכול להיות מוצר מחוץ למדף המותאם בקלות לתגובות חיסוניות של מטופלים בודדים.כדי ליצור תאים אנטיגן מלאכותיים ננו-חלקיקים, יש לעכל מחדש את החלקיקים הליופילים במיליליטר אחד של חיץ ההתלות מחדש ולמערבולת נמרצת את ההשעיה למשך 15 דקות לפחות עד שלא יהיו אגרגטים גלויים. חלקיקים שאינם מערבולת מספקת ו resuspended לפני התגובה עם חלבון יגרום חלקיקים מצטברים גדולים יותר שאינם מסוגלים להיות ניתקו. מניחים את החלקיקים המגנטיים על מעמד מגנטי כדי להסיר את העל-טבעי ולתלות אותם מחדש עם 0.5 מיליליטר של חיץ רב-הייה טרי.מעבירים את מתלי החלקיקים לבקבוקון זכוכית למערבולת עד שלא נראים אגרגטים, ומוסיפים 0.1 מיליגרם של אותות ממריצים לכל מיליגרם אחד של חלקיקים תלויים מחדש. לאחר מערבולת, לאפשר את ההשעיה להגיב במשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מסובב, ואחריו תוספת של 0.1 מיליליטר של חיץ מרווה עבור דגירה נוספת של 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב. בסוף התגובה השנייה, מניחים את בקבוקון ההבלטה על הכן המגנטי ושוטפים את החלקיקים במיליליטר אחד של חיץ ההתפוגה ארבע פעמים, מסירים את החיץ כאשר הוא מתבהר לאחר כל שטיפה ומחליפים אותו במאגר ההתפוגה הטרי לכביסה הבאה על המגנט.לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את הפתרון והוציאו את החלקיקים מהעמוד המגנטי, ואז אחסנו את החלקיקים במיליליטר אחד של מאגר רב-התישה טרי בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. כדי לבודד תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן, יש לבודד את הטחולים ובלוטות הלימפה מעכברי C57 שחורים מסוג פראי 6J באמצעות מסננת תאים סטרילית של 70 מיקרומטר עם שטיפות PBS תכופות ולהשתמש בערכת בידוד תאים CD8+T ללא מגע בהתאם להוראות היצרן לחסל את התאים שאינם CD8+T. לאחר הספירה, לאסוף את תאי CD8 + T מבודדים על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה ב 100 microliters של PBS בתוספת 0.5%Bovine סרום אלבומין ושני מילימולרים EDTA, לאחר מכן הדגירה את התאים עם תאים אנטיגן מלאכותי חלקיקי מציג כך שיש פעם אחת 10 כדי 11 פפטיד טעון MHC-ig לכל אחד פעמים 10 כדי השישי מבודד CD8 + T תאים סטריליים צינור פוליסטירן באורך 5 מיליליטר עם תחתית עגולה למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמשך.בסוף הדגירה, לשטוף את ההשעיה תא ננו חלקיקי שלוש פעמים על הדוכן המגנטי כפי שהודגם, שימוש חוזר בתאים מלאכותיים מציג אנטיגן ותאי CD8 + T מועשרים ב 500 microliters של טרי, בתוספת בינוני עם 1%T גורם גדילה של התא לאחר הכביסה האחרונה. להתאוששות תאית מקסימלית, חיוני להשאיר את החלקיקים והתאים בעמודה המגנטית למשך שתי דקות לפחות ולשאף את המאגר בזהירות מבלי לשבש את החלקיקים והתאים הכפופים לשדה המגנטי. לאחר הספירה, זרעים 2.5 פעמים 10 כדי החמישי מועשר CD8 + T תאים תערובת חלקיקים מגנטיים לכל 160 microliters של מדיום בתוספת 1% TCGF בצלחת 96 היטב U-bottomed.ביום השלישי, להאכיל את התאים עם 80 microliters של מדיום בתוספת עם 2%T גורם גדילה של תאים ל הבאר ולהחזיר את הצלחת החממה תרבות התא במשך ארבעה ימים נוספים. ביום השביעי, לקצור את התאים מגורה לתוך צינור חמישה מיליליטר עגול התחתון לספירה ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תן את גלולה ב 0.5 מיליליטר של PBS בתוספת 0.05% נתרן אזיד ו 2% סרום בקר עוברי לספירה aliquot חמש פעמים 10 עד הרביעי עד חמש פעמים 10 לתאים החמישי לתוך צינורות חדשים חמישה מיליליטר עגול תחתית עבור כתמים ספציפיים אנטיגן.סמן את הצינורות המתאימים עם MHC-ig biotinylated ו- CD8a נגד עכבר במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס, ואחריו לשטוף צנטריפוגה ב PBS טרי כדי להסיר כל אימונוגלובולין biotinylated עודף, ואז להכתים את הדגימות עם נוגדן משני מתאים streptavidin-conjugated ו זן התא המתים המתים מתאים לחיות-מת במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולקרוא את התאים על ציטומטר זרימה כדי לקבוע את הספציפיות ואת מספר תאי CD8 + T ספציפיים אנטיגן על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כאן הושגה התייחדות מוצלחת של חלבונים באמצעות שלוש שיטות שונות של חיבור חלבון לחלקיקים. אם צפיפות הליגנד של AAPC נמוכה מדי, לא יהיה גירוי יעיל של תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן.בקרת איכות של dimer biotinylated ניתן להשלים על תאי CD8 + T מהונדסים כדי לאמת כתמים. לדוגמה, תוצאות מייצגות אלה ממחישות הכתמה חיובית בתאי CD8+T ספציפיים ל- GP100 עם תאי b6 CD8+T שאינם ספציפיים לאנטיגן כפקד רקע. כמו כן, הידע של כתם הרקע של dimer biotinylated הוא קריטי, כמו כל אחוז נמוך יותר מאשר כתמים זה צינורות מוכתמים קוגנט צריך להיחשב תוצאה שלילית.לאחר שבעה ימים של העשרה והתרחבות, בין שתי פעמים 10 לרביעית ושתיים פעמים 10 כדי אנטיגן החמישי ספציפי וחמישה עד 50% CD8 + T תאים ניתן לצפות מחמישה פעמים המקורי 10 כדי השישי אנדוגני CD8 + T התא מתחיל האוכלוסייה. ניתן להשתמש באותה מתודולוגיה כדי לבודד ולעורר תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן אנושי עם עלייה דומה באחוזים ובמספרים של תאי CD8+T ספציפיים לאנטיגן שנצפו לאחר שבוע אחד בלבד של התפשטות לאחר העשרה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את בדיקות האיכות המתאימות של הריג'נט כמתואר.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ציטומטריית זרימה להכתמת ציטוקינות תאית או ביטוי חלבון פני השטח כדי לענות על שאלות נוספות על הפונקציונליות או הפנוטיפ של התאים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה הבסיסי לחקור את רוחב, עומק ודינמיקה של תגובות ספציפיות לאנטיגן בתחומים ביו-רפואיים אחרים כגון סרטן, מחלות זיהומיות או מחקר אוטואימוניות.

Research

JoVE Journal

Engineering

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

סינתזה של Nanoemulsions שלב של משמרות עם הפצות גודל צרות לאידוי Droplet אקוסטית ואבלציה בועה משופרת אולטראסאונד בתיווך

High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Optical Trapping of Nanoparticles

לכידה אופטית של חלקיקים

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Probing and Mapping Electrode Surfaces in Solid Oxide Fuel Cells

חיטוט ומיפוי משטחי אלקטרודה דלק תאי תחמוצת מוצקות

Solid oxide fuel cells (SOFCs) are potentially the most efficient and cost-effective solution to utilization of a wide variety of fuels beyond hydrogen ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

סינתזה וFunctionalization גביעי Nanotube פחמן חנקן מסומם עם חלקיקי זהב כפקקים

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Electroactive Polymer Nanoparticles Exhibiting Photothermal Properties

מאפייני electroactive פולימר החלקיקים מציגים photothermal

A method for the synthesis of electroactive polymers is demonstrated, starting with the synthesis of extended conjugation monomers using a three-step ...

Plasmonic Trapping and Release of Nanoparticles in a Monitoring Environment

השמנת Plasmonic ושחרור של חלקיקים בסביבת ניטור

Plasmonic tweezers use surface plasmon polaritons to confine polarizable nanoscale objects. Among the various designs of plasmonic tweezers, only a few ...

Enhanced Electron Injection and Exciton Confinement for Pure Blue Quantum-Dot Light-Emitting Diodes by Introducing Partially Oxidized Aluminum Cathode

הזרקה משופרת אלקטרון וכליאתם אקסיטון עבור טהור קוונטית-נקודה כחולה דיודות פולטות אור על ידי החדרת חלקית תחמוצת אלומיניום קטודה

Stable and efficient red (R), green (G), and blue (B) light sources based on solution-processed quantum dots (QDs) play important roles in next-generation ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

חד-ספרתיות ננומטר ליתוגרפיה קרינה עם תיקון סטייה סריקה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרוני

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

Large Area Substrate-Based Nanofabrication of Controllable and Customizable Gold Nanoparticles Via Capped Dewetting

שטח גדול Nanofabrication מבוססת על המצע של חלקיקי זהב לשליטה, להתאמה אישית באמצעות Dewetting רצ'ט

Recent scientific advances in the utilization of metallic nanoparticle for enhanced energy conversion efficiency, improved optical device performance, and ...

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

סינתזה Functionalization, איפיון חלקיקים הסיליקון הנקבובי Fusogenic למסירה Oligonucleotide

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...