Name: enrich and expand rare antigen-specific t cells with magnetic nanoparticles
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles at JoVE.com

J.W.H. agradece el centro de entrenamiento de NIH cáncer nanotecnología en el Instituto de Johns Hopkins la nanobiotecnología, la nacional Science Fundación graduados beca de investigación (DGE-1232825) y la Fundación de arcos para apoyo de becas. Este trabajo fue financiado por el apoyo de los institutos nacionales de salud (R21 P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de innovación TEDCO/Maryland y la Fundación de Coulter (JPS).

Todos los ratones fueron mantenidos por directrices aprobadas por la Junta de revisión institucional de la Universidad Johns Hopkins.
1. Cargue la proteína de la fusión de inmunoglobulina dimérico complejo de histocompatibilidad mayor (MHC-Ig) con secuencia de péptido antígeno deseado.
Nota: Si utiliza H - 2Kb: Ig, a continuación, siga el protocolo detallado en el paso 1.1; Si se usa H-2Db:Ig, a continuación, siga el protocolo detallado en el paso 1.2.
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Hemos creado una tecnología de aislamiento de novela células de T específicas de antígeno basada en nanopartículas artificiales antígeno que presenta las células (aAPCs). Nanopartícula aAPCs péptido-carga del MHC en la superficie que permite la Unión de células de T específicas de antígeno y activación junto con activación coestimuladoras. aAPCs también son paramagnéticos y así se puede utilizar para enriquecer raros antígenos específicos de células T mediante un campo magnético. Hemos optimizado y ...

Con el surgimiento de muchos inmunoterapias, hay necesidad de ser capaz de caracterizar y controlar las respuestas inmunitarias. En particular, la respuesta inmune adaptativa es de interés debido a la especificidad y la durabilidad de las células. Recientemente, terapias de la célula de T del receptor de antígeno quimérico se han aprobado para la terapia del cáncer; sin embargo, los receptores de antígeno se basa en el antígeno de superficie celular común CD19, en lugar de los antígenos específicos para el cáncer1. Más allá de la especificidad, las inmunoterapias pueden sufrir de la falta de control y la limitada comprensión de la dinámica respuesta inmune en cáncer y autoinmunidad.
Uno de los desafíos de estudiar la respuesta antígeno específica es su extremadamente baja frecuencia, por ej., linfocitos T antígeno específicos son 1 de cada 104 106 T células2,3. Así, para investigar que T las células están presentes o en respuesta, las células necesitan que sea enriquecido y ampliado, o su señal a amplificar. Es caro y difícil de mantener las células de alimentador mediante las técnicas actuales que se centran en la expansión de las células antígeno específicas. Las técnicas actuales que se centran en amplificar la señal de T específicas de antígeno de las células, como ensayo de la enzima-ligado immunospot (ELISPOT), limitar la reutilización de esas células de T4. Por último, debido a la baja sensibilidad, con frecuencia estas dos técnicas deben combinarse para la enumeración específica de antígeno.
Para enfrentar estos problemas, hemos desarrollado el antígeno artificiales basados en nanopartículas magnéticas que presenta células (aAPC)5,6,7,8. La aAPC puede ser funcionalizado con un complejo de péptido señal específica de antígeno cargado de histocompatibilidad (pMHC) y moléculas coestimuladoras -e.g., un anticuerpo anti-CD28-tanto enriquecer las células T antígeno específica y posteriormente estimular su expansión (figura 1). Las partículas así pueden ser un producto estándar rentable que puede ser tanto modificado para requisitos particulares para cubrir estímulos específicos de antígeno estandarizado a través de experimentos y pacientes. Realizar el enriquecimiento y ampliación del proceso resultados en cientos de miles de doble expansión de antígenos específicos de células CD8 + T y puede resultar en frecuencias hasta un 60% después de sólo una semana, lo que permite la caracterización o uso terapéutico de la gran número de células. Adjunto, describimos cómo hacer nanopartículas aAPCs, algunas consideraciones de diseño críticas en la elección de las propiedades de las nanopartículas y demostrar algunos resultados típicos de utilización de estas partículas en aislamiento y expansión de células T CD8 + específica de antígeno.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1136px;" width="1136">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">551263</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">551323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">550750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Vivaspin 20 MWCO 50 000</td>
			<td style="width:207px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:168px;">28932362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Vivaspin 2 MWCO 50 000</td>
			<td style="width:207px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:168px;">28932257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Purified Human Beta 2 Microglobulin</td>
			<td style="width:207px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:168px;">PHP135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles</td>
			<td style="width:207px;">Micromod</td>
			<td style="width:168px;">79-01-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:207px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:168px;">SN0200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-105-637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td style="width:207px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:168px;">20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Sulfo-SMCC Crosslinker&#160;</td>
			<td style="width:207px;">ProteoChem</td>
			<td style="width:168px;">c1109-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">2-Iminothiolane hydrochloride</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">I6256 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:168px;">3875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">FITC Rat Anti-Mouse Ig, &#955;1, &#955;2, &#38; &#955;3 Light Chain&#160; Clone &#160;R26-46&#160;&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">553434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG&#160; Clone &#160;G192-1</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">554026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice</td>
			<td style="width:207px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:168px;">005023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">C57BL/6J (B6 wildtype) mice</td>
			<td style="width:207px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:168px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">MS Columns</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">LS Columns</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE</td>
			<td style="width:207px;">Biolegend</td>
			<td style="width:168px;">405203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">N52 disk magnets of 0.75 inches&#160;</td>
			<td style="width:207px;">K&#38;J Magnetics</td>
			<td style="width:168px;">DX8C-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7</td>
			<td style="width:207px;">Biolegend</td>
			<td style="width:168px;">100711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation&#160;</td>
			<td style="width:207px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:168px;">L-34969</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrich and expand rare antigen-specific t cells with magnetic nanoparticles

Hemos desarrollado una herramienta para enriquecer y expandir las células T específicas de antígeno. Esto puede ser útil en casos tales como A) detectar la existencia de antígenos específicos de células T, B) sondear la dinámica de las respuestas específicas de antígeno, C) entender cómo respuestas antígeno específicas afectan al estado de enfermedad como autoinmunidad, D) desmitificar heterogéneos las respuestas de células T específicas de antígeno, o E) utilizan células de antígeno-específica para la terapia. La herramienta se basa en una partícula magnética que hemos conjugado antígeno específicas y células T señales coestimuladoras y que llamamos como artificial antígeno que presenta las células (aAPCs). En consecuencia, puesto que la tecnología es fácil de producir, se puede fácilmente ser adoptado por otros laboratorios; por lo tanto, nuestro propósito aquí es describir en detalle la fabricación y el uso posterior de la aAPCs. Se explica cómo asociar señales coestimuladoras y antígeno específicas a la aAPCs, cómo utilizarlas para enriquecer para linfocitos T antígeno específicos y cómo ampliar linfocitos T antígeno específicos. Además, se destacan ingeniería diseño consideraciones basan en información experimental y biológica de nuestra experiencia con caracterización de linfocitos T antígeno específicos.

Para completar una exitosa enriquecimiento y expansión de linfocitos T antígeno específicos, la carga de péptido MHC-Ig y moléculas coestimuladoras deben con éxito acoplarse a la partícula de la aAPC. Basado en los 3 métodos de fijación de la partícula, proporcionamos algunos datos representativos para un resultado de procedimiento verbal exitosa (figura 5a). De hecho, si la densidad del ligando es demasiado baja, entonces no habrá efectiva estimul...

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Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Linfocitos T antígeno específicos son difíciles de caracterizar o utilizar en terapias debido a su extremadamente baja frecuencia. Aquí proporcionamos un protocolo para desarrollar una partícula magnética que puede atar a las células T antígeno específicas para enriquecer estas células y luego ampliarlas varias centenas para caracterización y tratamiento.

Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Así que la principal ventaja de nuestra novedosa técnica, la denominamos E plus E, que significa enriquecimiento más expansión, es que podemos enriquecer y expandir estas células, células raras específicas de antígenos, simultáneamente. Esto nos permite desarrollar un número suficiente de células que vamos a poder utilizar para investigar su papel en diferentes entornos y en diferentes entornos clínicos o incluso nos permite desarrollar ahora un gran número de células que podemos utilizar para la inmunoterapia de una manera que antes no podíamos. El método que hemos desarrollado, este E plus E, puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología básica sobre la presencia de neoepitopes.¿Qué son los neoepitopes? Esos son los epítopos personalizados que sabemos que ahora son muy importantes en términos de inmunoterapia contra el cáncer y también dinámicas específicas de antígenos y cómo estos factores afectan a los estados de la enfermedad y para la terapia celular eficaz. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia, ya que la célula que presenta antígenos artificiales de nanopartículas podría ser un producto listo para usar que se adapta fácilmente a las respuestas inmunitarias individuales del paciente.Para generar células que presentan antígenos artificiales de nanopartículas, resuspendir las partículas liofilizadas en un mililitro de tampón de resuspensión y vórtice vigorosamente la suspensión durante al menos 15 minutos hasta que no se alcancen agregados visibles. Las partículas no con suficiente vórtice y resuspendidas antes de la reacción con proteína darán como resultado partículas agregadas más grandes que no pueden ser disociadas. Coloque las partículas magnéticas en un soporte magnético para quitar el sobrenadante y resuspendélas con 0,5 mililitros de tampón de resuspensión fresca.Transfiera la suspensión de partículas a un vial de centelleo de vidrio para el vórtice hasta que no haya agregados visibles, y agregue 0,1 miligramos de señales estimulantes totales por un miligramo de partículas resuspendidas. Después del vórtice, permita que la suspensión reaccione durante 2,5 horas a temperatura ambiente con la mezcla en un rotador, seguido de la adición de 0,1 mililitros de tampón de enfriamiento para una incubación adicional de 30 minutos a temperatura ambiente con mezcla. Al final de la segunda reacción, coloque el vial de centelleo en el soporte magnético y lave las partículas en un mililitro de tampón de resuspensión cuatro veces, eliminando el tampón cuando se vuelva claro después de cada lavado y sustituyéndolo por un tampón de resuspensión fresco para el lavado posterior en el imán.Después del último lavado, aspirar la solución y eliminar las partículas del soporte magnético, luego almacenar las partículas en un mililitro de tampón de resuspensión fresca a cuatro grados Celsius durante un máximo de seis meses. Para aislar células CD8+T específicas de antígenos, macera los bazos y ganglios linfáticos de ratones negros 6J de tipo salvaje C57 a través de un colador celular estéril de 70 micrómetros con enjuagues frecuentes de PBS y utilice un kit de aislamiento de células CD8+T sin contacto de acuerdo con las instrucciones del fabricante para eliminar las células no CD8+T. Después de contar, recoger las células aisladas CD8+T por centrifugación y resuspend el pellet en 100 microlitros de PBS complementados con 0.5%búrica sérica bovina y EDTA de dos milímetros, luego incubar las células con las células que presentan antígenos artificiales de nanopartículas de tal manera que hay una vez 10 a la 11a MHC-ig cargada con péptidos por una vez 10 a la sexta células AISLADAs CD8+T en un estéril , tubo de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros durante una hora a cuatro grados centígrados con mezcla continua.Al final de la incubación, lave la suspensión de la célula de nanopartículas tres veces en el soporte magnético como se ha demostrado, resusppendiendo las células que presentan antígenos artificiales y las células CD8+T enriquecidas en 500 microlitros de medio fresco, suplementado con factor de crecimiento de células 1%T después del último lavado. Para la máxima recuperación celular, es fundamental dejar las partículas y células en la columna magnética durante al menos dos minutos y aspirar el búfer cuidadosamente sin interrumpir las partículas y células sujetas al campo magnético. Después de contar, siembra 2,5 veces 10 a la quinta células CD8+T enriquecidas y mezcla de partículas magnéticas por 160 microlitros de medio suplementado más 1%TCGF en una placa con fondo en U de 96 pozos.En el tercer día, alimentar las células con 80 microlitros de medio suplementado con factor de crecimiento de células 2%T por pozo y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular durante cuatro días más. En el séptimo día, cosecha las células estimuladas en un tubo de cinco mililitros de fondo redondo para contar y recoger las células por centrifugación. Resuspender el pellet en 0,5 mililitros de PBS complementados con 0,05%azida sódica y 2%suero bovino fetal para conteo y alícuota cinco veces 10 a la cuarta a cinco veces 10 a las quintas células en nuevos tubos de fondo redondo de cinco mililitros para la tinción específica de antígenos.Etiquetar los tubos apropiados con MHC-ig biotinilado y CD8a antiratón durante una hora a cuatro grados centígrados, seguido de un lavado de centrífugas en PBS fresco para eliminar cualquier exceso de inmunoglobulina biotinilada, luego manchar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado con estreptavidina adecuada y una cepa de célula muerta fijable adecuada durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y leer las células en un citómetro de flujo para determinar la especificidad y el número de las células CD8+T específicas del antígeno de acuerdo con los protocolos estándar. Aquí se logró una conjugación proteica exitosa utilizando tres métodos diferentes de unión de proteínas a las partículas. Si la densidad del ligando aAPC es demasiado baja, no habrá una estimulación efectiva de las células CD8+T específicas del antígeno.El control de calidad del dimer biotinilado se puede completar en células transgénicas CD8+T para verificar la tinción. Por ejemplo, estos resultados representativos muestran una tinción positiva con células CD8+T específicas de gp100 con celdas b6 CD8+T no específicas de antígenos como control de fondo. Además, el conocimiento de la tinción de fondo del dimer biotinilado es crítico, ya que cualquier porcentaje inferior a esta tinción en los tubos manchados de cognado debe considerarse un resultado negativo.Después de siete días de enriquecimiento y expansión, entre dos veces 10 a la cuarta y dos veces 10 a la quinta antígeno específica y cinco a 50%CD8+T células se pueden esperar de una original cinco veces 10 a la sexta población inicial de células ENDógenas CD8 +T. La misma metodología se puede utilizar para aislar y estimular células CD8+T específicas de antígenos humanos con aumentos similares en porcentajes y números de células CD8+T específicas del antígeno observadas después de sólo una semana de expansión después del enriquecimiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar las comprobaciones de calidad de reactivos adecuadas como se describe.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo para la tinción intracelular de citoquinas o la expresión de proteínas superficiales para responder preguntas adicionales sobre la funcionalidad o el fenotipo de las células. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología básica exploren la amplitud, profundidad y dinámica de las respuestas específicas del antígeno en otros campos biomédicos como el cáncer, las enfermedades infecciosas o la investigación autoinmunitaria.

Research

JoVE Journal

Engineering

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High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Investigación

Ingeniería

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