Name: enrich and expand rare antigen-specific t cells with magnetic nanoparticles
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles at JoVE.com

J.W.H. NIH kanser nanoteknoloji Eğitim Merkezi Johns Hopkins Enstitüsü'nde NanoBioTechnology, Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu (DGE-1232825) ve kemerler Vakfı bursu destek için teşekkürler. Bu eser destek Ulusal Sağlık Enstitüleri (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland İnovasyon Girişimi ve Coulter Vakfı (JPS) tarafından finanse edildi.

Bütün fareler Johns Hopkins Üniversitesi'nin kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan yönergeleri başına muhafaza.
1. istenen antijen peptit dizisi ile dimerik Binbaşı MHC kompleksi immünglobulin füzyon Protein (MHC-Ig) yükleyin.
Not: H - 2 Kb kullanıyorsanız: IG, daha sonra takip adım 1. 1 '; ayrıntılı iletişim kuralı H kullanıyorsanız-2Db:Ig, daha sonra takip adım 1.2 ile ayrıntılı iletişim kuralı.
<ol><li>Etkin peptid sırası ...

<ol>
	<li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=immunotherapy:+Tisagenlecleucel-the+first+approved+Car-t-cell+therapy:+implications+for+payers+and+policy+makers.">immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).</li><li>Jenkins, M. K., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+naive+T+cell+precursor+frequency+and+recruitment+in+dictating+immune+response+magnitude.">The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude.</a> The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).</li><li>Rizzuto, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-antigen-specific+CD8++T+cell+precursor+frequency+determines+the+quality+of+the+antitumor+immune+response.">Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).</li><li>Newell, E. W., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+model+antigens:+high-dimensional+methods+for+the+analysis+of+antigen-specific+T+cells.">Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells.</a> Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+and+expansion+with+nanoscale+artificial+antigen+presenting+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy.</a> ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).</li><li>Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+T+Cell+Targeting+Components+onto+Magnetically+Clustered+Nanoparticles+Boosts+Activation.">Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation.</a> Nano Letters. , (2018).</li><li>Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologically+Inspired+Design+of+Nanoparticle+Artificial+Antigen-Presenting+Cells+for+Immunomodulation.">Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation.</a> Nano Letters. 17 (11), (2017).</li><li>, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+magnetic+enrichment+of+antigen-specific+T+cells+by+engineering+particle+properties.">Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties.</a> Biomaterials. , (2018).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+purification+of+CD8++melan-A-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+adoptive+transfer+in+tumor+immunotherapy.">Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).</li><li>Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+CAR+T+cells+for+adoptive+therapy+in+the+context+of+glioblastoma+standard+of+care.">Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).</li><li>Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+generating+CD8++T-cell+clones+for+immunotherapy+from+the+naive+repertoire.">In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire.</a> Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+complementary+methods+for+predicting+peptides+binding+major+histocompatibility+complex+molecules1.">Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1.</a> Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).</li><li>Castle, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+mutanome+for+tumor+vaccination.">Exploiting the mutanome for tumor vaccination.</a> Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).</li><li>Duan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+bioinformatic+profiling+of+mutational+neoepitopes+reveals+new+rules+to+predict+anticancer+immunogenicity.">Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).</li><li>Srivastava, P. K., Duan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+antigenic+fingerprint+of+each+individual+cancer+for+immunotherapy+of+human+cancer:+genomics+shows+a+new+way+and+its+challenges.">Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).</li><li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+immunogenic+tumour+mutations+by+combining+mass+spectrometry+and+exome+sequencing.">Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing.</a> Nature. 515 (7528), 572 (2014).</li><li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+neoantigen-specific+lymphocytes+in+the+peripheral+blood+of+melanoma+patients.">Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.</a> Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).</li></ol>

Nanopartikül yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) üzerinde esaslı bir roman antijen spesifik T hücre izolasyon teknoloji oluşturduk. Nanopartikül aAPCs peptid-MHC bırakmak antijen spesifik T hücre bağlama ve harekete geçirmek co-stimulatory harekete geçirmek yanında yüzey üzerinde yüklenmiş. aAPCs da paramagnetic ve böylece bir manyetik alanını kullanarak nadir antijen spesifik T hücreleri zenginleştirmek için kullanılabilir. Biz en iyi duruma getirilmiş ve anahtar nanopartikül özellikleri boyu...

Birçok immunotherapies yükselişi ile karakterize ve bağışıklık yanıtı kontrol edebilmek için bir ihtiyaç vardır. Özellikle, adaptif bağışıklık yanıtı özgüllük ve dayanıklılık hücrelerin nedeniyle ilgi biridir. Son zamanlarda, antijen reseptör chimeric T hücre tedavileri kanser tedavisi için onaylanmış olan; Ancak, antijen-reseptörleri kanser1olarak belirli antijenleri yerine ortak hücre yüzey antijeni CD19, kapalı dayanır. Özgüllüğü immunotherapies ayrıca denetim ve sınırlı dinamik bağışıklık yanıtı kanser veya otoimmünite içinde anlama eksikliği muzdarip.
Antijen spesifik yanıt eğitim sorunları biridir onların son derece düşük frekanslı, Örn., antijen spesifik T hücrelerdir 1 her 10 /4 106 T hücreleri2,3. Böylece, hangi T araştırmak için hücreler varsa veya Yanıt, hücreleri ya zenginleştirilmiş genişletilmiş ve olması gereken veya onların sinyal kuvvetlendirilmesine gerekir. Pahalı ve zor antijen spesifik hücreleri genişlemesi üzerine odaklanmış güncel teknikler kullanarak besleyici hücreleri korumak. Antijen spesifik T sinyalinin yükseltecek üzerinde odaklanmak güncel teknikler hücreleri, enzim bağlı immunospot (ELISPOT) tahlil gibi bu T hücreleri4yeniden kullanımı sınırla. Son olarak, düşük duyarlılık nedeniyle sık sık bu iki teknik antijen spesifik numaralandırma için Birleşik olarak gerekir.
Bu sorunlara yönelik olarak manyetik nanoparçacık tabanlı yapay antijen sunan hücre (aAPC)5,6,7,8geliştirdik. AAPC bir antijen spesifik sinyal peptid yüklü MHC kompleksi (pMHC) - ve co-stimulatory moleküller - functionalizedÖrneğin., bir anti-CD28 antikor-antijen spesifik T hücreleri hem de zenginleştirmek ve sonra daha sonra kendi genişleme (Şekil 1) teşvik. Parçacıklar böylece olmak hem antijen spesifik elektrodlar karşılamak için özelleştirilmiş henüz deneyler ve hastalar arasında standart maliyet-etkin bir piyasada ürün olabilir. Performans zenginleştirme ve genişleme süreci yüzlerce binlerce kat genişleme antijen spesifik CD8 + T hücreleri için sonuçlarında ve frekansları neden olabilir kadar sadece bir hafta sonra 60 yüzde karakterizasyonu veya büyük terapötik kullanım etkinleştirme hücre sayısı. Burada, biz nanopartikül aAPCs, nanopartikül özellikleri seçiminde bazı kritik tasarımları yapmak tarif nasıl ve yalıtma ve nadir antijen spesifik CD8 + T hücreleri genişleyen bu parçacıklar kullanan bazı tipik sonuçlar gösterilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1136px;" width="1136">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">551263</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">551323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">550750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Vivaspin 20 MWCO 50 000</td>
			<td style="width:207px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:168px;">28932362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Vivaspin 2 MWCO 50 000</td>
			<td style="width:207px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:168px;">28932257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Purified Human Beta 2 Microglobulin</td>
			<td style="width:207px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:168px;">PHP135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles</td>
			<td style="width:207px;">Micromod</td>
			<td style="width:168px;">79-01-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:207px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:168px;">SN0200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-105-637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td style="width:207px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:168px;">20217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Sulfo-SMCC Crosslinker&#160;</td>
			<td style="width:207px;">ProteoChem</td>
			<td style="width:168px;">c1109-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">2-Iminothiolane hydrochloride</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:168px;">I6256 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:168px;">3875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">FITC Rat Anti-Mouse Ig, &#955;1, &#955;2, &#38; &#955;3 Light Chain&#160; Clone &#160;R26-46&#160;&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">553434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG&#160; Clone &#160;G192-1</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:168px;">554026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice</td>
			<td style="width:207px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:168px;">005023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">C57BL/6J (B6 wildtype) mice</td>
			<td style="width:207px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:168px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">MS Columns</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">LS Columns</td>
			<td style="width:207px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:168px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE</td>
			<td style="width:207px;">Biolegend</td>
			<td style="width:168px;">405203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">N52 disk magnets of 0.75 inches&#160;</td>
			<td style="width:207px;">K&#38;J Magnetics</td>
			<td style="width:168px;">DX8C-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7</td>
			<td style="width:207px;">Biolegend</td>
			<td style="width:168px;">100711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:517px;">LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation&#160;</td>
			<td style="width:207px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:168px;">L-34969</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrich and expand rare antigen-specific t cells with magnetic nanoparticles

Hem zenginleştirmek ve antijen spesifik T hücreleri genişletmek için bir araç geliştirdik. Bu gibi durumlarda yararlı olabilir A) antijen spesifik T hücrelerinin varlığını tespit, B) antijen spesifik yanıt dinamikleri sonda, C) anlamak için nasıl antijen spesifik yanıt-e doğru hastalık durumu otoimmünite gibi etkiler, D) etrafındaki sisi ortadan türdeş olmayan Yanıt için antijen spesifik ya da E T hücreleri) antijen spesifik hücreleri tedavi için kullanmaktadır. Araç üzerinde bir manyetik parçacık antijen spesifik ve T hücre co-stimulatory sinyalleri eşlenik ve yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) vadeli temel alır. Teknoloji üretmek basit olduğundan, sonuç olarak, bu kolayca diğer laboratuvarlar tarafından kabul edilebilir; Böylece, Buradaki amacımız imalat ve aAPCs sonraki kullanımını ayrıntılı olarak tarif etmektir. Biz aAPCs için antijen spesifik ve co-stimulatory sinyalleri eklemek, onları antijen spesifik T hücreleri için zenginleştirmek için kullanmak ve antijen spesifik T hücreleri genişletin açıklar. Ayrıca, mühendislik tasarım konuları antijen spesifik T hücreleri karakterize ile deneyimimizin deneysel ve biyolojik bilgileri temel alarak vurgular.

Başarılı zenginleştirme ve genişleme antijen spesifik T hücrelerinin tamamlamak için peptid yüklü MHC-IG ve co-stimulatory molekülleri başarıyla aAPC parçacık iliştirilmesi gerekir. Parçacık Eki 3 yöntemleri üzerinde bağlı olarak, biz başarılı konjugasyon yordam sonucu (Şekil 5a) temsilcisi bazı veriler sağlar. Nitekim, ligand yoğunluğu çok düşük ise, o zaman olacak bu 100 yukarıdaki ligandlar arasındaki doğrusal Aralık et...

Watch this Scientific Journal Video about Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles at JoVE.com

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Yeni tekniğimizin en büyük avantajı, ona E artı E olarak adlandırdık, ki bu zenginleştirme artı genişleme anlamına gelir, bu hücreleri zenginleşebilir ve genişletebiliriz, nadir antijene özgü hücreler, aynı anda. Bu bize farklı ortamlarda ve farklı klinik ortamlarda rollerini araştırmak için kullanmak mümkün olacak hücrelerin yeterli sayıda geliştirmek için izin verir hatta bize daha önce yapamadık bir şekilde immünoterapi için kullanabileceğiniz hücrelerin çok sayıda şimdi geliştirmek için izin verir. Geliştirdiğimiz yöntem, bu E artı E, neoepitopların varlığı hakkında temel immünolojide anahtar soruların cevaplatEdilmesine yardımcı olabilir.Neoepitoponlar nelerdir? Bunlar bildiğimiz kişiselleştirilmiş epitoplar artık kanser immünoterapisi ve aynı zamanda antijene özgü dinamikler ve bu faktörlerin hastalık durumlarını nasıl etkilediği ve etkili hücresel tedavi açısından çok önemlidir. Nanopartikül yapay antijen sunan hücre kolayca bireysel hasta bağışıklık yanıtları için uyarlanmış bir off-the-raf ürün olabilir gibi bu tekniğin etkileri, immünoterapi doğru uzanır.Nanopartikül yapay antijen sunan hücreler oluşturmak için, resuspension tampon bir mililitre liyophilized parçacıklar resuspend ve kuvvetle hiçbir agrega görünür kadar en az 15 dakika boyunca süspansiyon girdap. Proteinle reaksiyondan önce yeterince girdaplanmamış ve yeniden askıya alınmamış parçacıklar, ayrıştırılamayan daha büyük birleştirilmiş parçacıklara neden olur. Manyetik parçacıkları manyetik bir standa yerleştirin ve süpernatantı çıkarın ve 0,5 mililitre taze süspansiyon tamponu yla yeniden askıya alın.Parçacık süspansiyonunu, agrega lar görünmeyene kadar girdap için bir cam ışıltılı şişeye aktarın ve bir miligram yeniden askıda parçacık başına 0,1 miligram toplam uyarıcı sinyal ekleyin. Girdap sonra, süspansiyon bir rotator karıştırma ile oda sıcaklığında 2,5 saat boyunca tepki sağlar, karıştırma ile oda sıcaklığında ek bir 30 dakikalık kuluçka için söndürme tampon 0,1 mililitre eklenmesi izledi. İkinci reaksiyonun sonunda, scintillation şişesini manyetik standın üzerine yerleştirin ve parçacıkları bir mililitre resuspension tamponunda dört kez yıkayın, her yıkamadan sonra netolduğunda tamponu temizleyin ve mıknatısın üzerindeki sonraki yıkama için taze süspansiyon tamponuyla değiştirin.Son yıkamadan sonra, çözeltiyi aspire edin ve parçacıkları manyetik standdan çıkarın, sonra parçacıkları bir mililitre taze resuspension tamponunda dört derece ye kadar altı aya kadar saklayın. Antijene özgü CD8+T hücrelerini izole etmek için, yabani tip C57 siyah 6J farelerden dalak ve lenf düğümlerini sık PBS durulamaları olan steril, 70 mikrometrelik hücresüzve üreticinin talimatlarına göre CD8+T olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için bir no-touch CD8+T hücre izolasyon kiti kullanın. Saydıktan sonra, izole CD8+T hücrelerini santrifüj ile toplayın ve peleti %0.5 Bovine Serum Albumin ve iki milimolar EDTA ile desteklenen 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın, sonra nanopartikül yapay antijen sunan hücreler ile hücreleri kuluçkaya yatırın ki, 11.peptid yüklü MHC-ig'den 11'e kadar bir kere10'dan steril olarak altıncı izole CD8+T hücrelerine kadar , beş mililitre polistiren yuvarlak dipli tüp sürekli karıştırma ile dört derece santigrat bir saat için.Kuluçka sonunda, nanopartikül hücre süspansiyonunu gösterildiği gibi manyetik standda üç kez yıkayın, yapay antijen sunan hücreleri ve zenginleştirilmiş CD8+T hücrelerini 500 mikrolitre taze, son yıkamadan sonra %1 T hücre büyüme faktörüile takviye edilmiş orta hücrelerde yeniden sulandırın. Maksimum hücre kurtarma için, en az iki dakika boyunca manyetik kolon üzerinde parçacıklar ve hücreler bırakmak ve manyetik alana tabi parçacıklar ve hücreler bozmadan dikkatli bir şekilde tampon aspire etmek önemlidir. Sayma sonra, tohum 2.5 kez 10 beşinci zenginleştirilmiş CD8 + T hücreleri ve manyetik parçacık karışımı başına 160 mikrolitre takviye orta artı 1% TCGF 96-iyi U-dipli plaka.Üçüncü Gün'de, iyi başına% 2 T hücre büyüme faktörü ile takviye orta 80 mikrolitre ile hücreleri beslemek ve dört gün daha hücre kültürü kuluçka için plaka dönmek. Yedinci Gün' te, uyarılmış hücreleri saymak için beş mililitrelik yuvarlak dipli bir tüpe alın ve santrifüj le hücreleri toplayın. PBS 0.5 mililitre pelet resuspend 0.05% sodyum azit ve 2% fetal sığır serum sayma için takviye ve aliquot beş kez 10 dördüncü beş kez 10 beşinci hücrelere yeni beş mililitre yuvarlak dipli tüpler içine antijen özgü boyama için.Uygun tüpleri biyotinylated MHC-ig ve anti-mouse CD8a ile dört santigrat derecede bir saat etiketleyin, herhangi bir aşırı biyotinylated immünglobulin kaldırmak için taze PBS bir santrifüj yıkama takip, sonra uygun bir streptavidin konjuge ikincil antikor ve uygun bir canlı ölü fikse edilebilir ölü hücre suş ile örnekleri leke 15 dakika dört santigrat derece ve standart protokollere göre antijen özgül CD8 + T hücrelerinin özgüllüğünü ve sayısını belirlemek için bir akış sitometre hücreleri okuyun. Burada parçacıklara protein bağlanmasının üç farklı yöntemi kullanılarak başarılı bir protein çekimi sağlanmıştır. AAPC ligand yoğunluğu çok düşükse, antijene özgü CD8+T hücrelerinin etkili bir uyarılması olmayacaktır.Biyotinylated dimer kalite kontrolü boyama doğrulamak için transgenik CD8 + T hücrelerinde tamamlanabilir. Örneğin, bu temsili sonuçlar, arka plan kontrolü olarak antijene özgü olmayan b6 CD8+T hücreleri ile gp100 spesifik CD8+T hücreleri ile pozitif boyama göstermektedir. Ayrıca, biyotinylated dimer arka plan boyama bilgisi önemlidir, biliş lekeli tüplerde bu boyama daha düşük herhangi bir yüzdesi olarak olumsuz bir sonuç olarak kabul edilmelidir.Yedi günlük zenginleştirme ve genişlemeden sonra, 10-4 ve iki katı arasında 10 ila beşinci antijene özgü ve %5-50 CD8+T hücreleri orijinal beş ten 10'a kadar altıncı endojen CD8+T hücresi başlangıç popülasyonundan beklenebilir. Aynı metodoloji, zenginleştirmeden sonra sadece bir haftalık genişlemeden sonra gözlenen antijene özgü CD8+T hücrelerinin yüzdeve sayısında benzer artışlar ile insan antijene özgü CD8+T hücrelerini izole etmek ve uyarmak için kullanılabilir. Bu yordamı denerken, açıklandığı gibi uygun reaktif kalite denetimleri gerçekleştirmek için hatırlamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, hücre içi sitokin boyama veya yüzey protein ekspresyonu için akış sitometrisi gibi diğer yöntemler hücrelerin işlevselliği veya fenotip hakkında ek soruları cevaplamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, temel immünoloji alanında araştırmacıların kanser, bulaşıcı hastalık veya otoimmünite araştırmaları gibi diğer biyomedikal alanlarda antijene özgü yanıtların genişliğini, derinliğini ve dinamiklerini keşfetmelerinin önünü açar.

Research

JoVE Journal

Engineering

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

Akustik Damlacık buharlaşması ve Bubble-gelişmiş Ultrason aracılı Ablasyon için dar Boyut Dağılımları ile Faz-shift Nanoemulsions sentezi

High-intensity  focused ultrasound (HIFU) is used clinically to thermally ablate tumors. To  enhance localized heating and improve thermal ablation in ...

Optical Trapping of Nanoparticles

Nanopartiküllerin Optik Yakalama

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Probing and Mapping Electrode Surfaces in Solid Oxide Fuel Cells

Katı Oksit Yakıt Hücreleri Elektrot Yüzeyler Sondalama ve Haritalama

Solid oxide fuel cells (SOFCs) are potentially the most efficient and cost-effective solution to utilization of a wide variety of fuels beyond hydrogen ...

Synthesis and Functionalization of Nitrogen-doped Carbon Nanotube Cups with Gold Nanoparticles as Cork Stoppers

Mantar Tıpa olarak Altın Nanopartiküller ile Azot-katkılı Karbon Nanotube Bardaklar sentezi ve fonksiyonlandırmalar

Nitrogen-doped carbon  nanotubes consist of many cup-shaped graphitic compartments termed as  nitrogen-doped carbon nanotube cups (NCNCs).  These ...

Electroactive Polymer Nanoparticles Exhibiting Photothermal Properties

Elektroaktif Polimer nanopartiküller Sergileme Fototermal Özellikleri

A method for the synthesis of electroactive polymers is demonstrated, starting with the synthesis of extended conjugation monomers using a three-step ...

Plasmonic Trapping and Release of Nanoparticles in a Monitoring Environment

Bir İzleme Ortamında plasmonik Yakalama ve Nanopartiküller Yayın

Plasmonic tweezers use surface plasmon polaritons to confine polarizable nanoscale objects. Among the various designs of plasmonic tweezers, only a few ...

Enhanced Electron Injection and Exciton Confinement for Pure Blue Quantum-Dot Light-Emitting Diodes by Introducing Partially Oxidized Aluminum Cathode

Gelişmiş elektron enjeksiyon ve Exciton hapsi için kısmen oksitlenmiş alüminyum katot tanıtımı tarafından saf mavi kuantum nokta ışık - yayan diyotlar

Stable and efficient red (R), green (G), and blue (B) light sources based on solution-processed quantum dots (QDs) play important roles in next-generation ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

Tek basamaklı nanometre elektron ışını litografi bir sapma düzeltilmiş tarama transmisyon elektron mikroskobu ile

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

Large Area Substrate-Based Nanofabrication of Controllable and Customizable Gold Nanoparticles Via Capped Dewetting

Geniş bir alan Nanofabrication çok Millî olan Dewetting üzerinden kontrol edilebilir ve özelleştirilebilir altın nano tanecikleri ve substrat tabanlı

Recent scientific advances in the utilization of metallic nanoparticle for enhanced energy conversion efficiency, improved optical device performance, and ...

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

Functionalization, malzemelerin ve Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri'Oligonükleotid dır

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...