Name: flow cytometric detection of newly-formed breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de innovatieve technologie Fonds voor innovatie technologie Commissie: financiering steun van de staat sleutel laboratorium voor Agrobiotechnology (CUHK), het Lo Kwee-Seong biomedisch onderzoeksfonds en de Lee Hysan Foundation. Y.X. werd gesteund door de postdoctorale studententijd van de CUHK.

1. voorbereiding van de borst niet-stam kankercellen
<ol><li>Cultuur MCF-7 en MDA-MB-231 cellen in 10 mL van fenol rood-vrije Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) in een schotel van 100 mm. Cultuur T47D in 10 mL van fenol rood-vrije RPMI 1640 medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% warmte-geïnactiveerd FBS, en 1% v/v penicilline-streptomycine (PS) in een schotel van 100 mm. De cellen van de cultuur bij 37 ° C in een 5%...

Dit protocol beschrijft een directe en duidelijke manier voor het opsporen van de overgang van niet-stam borstkankercellen in borst CSC-achtige cellen ten gevolge van apoptosis omkering. Bevestiging van de CSC-eigenschappen van deze omgekeerde cellen kan worden bijgestaan door ikn vitro mammosphere formatie assay en in vivo xenograft transplantatie in immunodeficiëntie muizen18,24,26 ,<sup class="x...

Kanker is een belangrijke doodsoorzaak, waardoor zware last aan landen wereldwijd1. Borstkanker rangen hoog zowel in termen van de incidentie en mortaliteit bij vrouwelijke patiënten onder alle soorten kanker1. Als gevolg van de heterogeniteit van de kanker, wordt een combinatie van drugs meestal gebruikt in chemotherapie om kanker cel dood2,3,4. Echter, aangezien gemeenschappelijke chemotherapeutische geneesmiddelen vaak richten op DNA5,6, eiwit synthese7,8 en/of microtubulus dynamiek,9, snelgroeiende cellen zijn het hardst getroffen terwijl zwakke cellen zoals kanker stamcel (CSC) s zijn meestal minder getroffen10. CSCs zijn, dus meer kans om te overleven na de behandeling, die later leidt tot resistentie tegen geneesmiddelen en kanker terugvalpreventie10,11. Vandaar, eliminatie van CSCs uitgegroeid tot een belangrijk onderwerp voor de behandeling van kanker en studie van de oorsprong van CSCs noodzakelijk is.
Meer studies over het fenomeen van apoptosis omkering zijn uitgevoerd in de afgelopen tien jaar12,13,14,15,16,17,18 , 19. vóór de opkomst van dit concept, het is algemeen aanvaard dat cellen apoptosis onherroepelijk zal ondergaan na activering van caspase. Caspases is een familie van eiwit-enzymen die spelen een sleutelrol in de inleiding en uitvoering stadia van apoptosis, met inbegrip van de vorming van de complexe apoptotic en de splitsing van downstream substraten20. Activering van de beul caspases zoals caspase-3 of caspase 7 heeft beschouwd als de "point of no return" voor apoptosis21. Onderzoekers onlangs merkte echter dat apoptosis terugboeking zowel in vitro plaatsvindt en in vivo, tijdens welke cellen van apoptosis zelfs na caspase activering12,13,14 herstellen kan , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Bovendien, agressieve eigenschappen zoals hogere weerstand tegen de oorspronkelijke apoptotic inductor en hogere invasiviteit worden gedetecteerd in de omgekeerde kanker cellen15. Derhalve werd voorgesteld dat het percentage van de CSC-achtige cellen hoger in de omgekeerde bevolking in vergelijking met de onbehandelde cellen, uiteindelijk bij te dragen tot de meer kwaadaardige functies na apoptosis omkering18zou zijn.
Eerder, vele inspanningen hebben gedaan om bij te houden van de apoptosis omkering in vitro en nog belangrijker, in vivo die enorm helpen bij de bevestiging van de universaliteit van dit proces16,17,19. Een systematische studie over de gevolgen van omgekeerde cellen ontbreekt echter als gevolg van de onbevredigende isolatie van cellen die werkelijk apoptosis omkering hebben ondergaan. Er is behoefte aan zuivere apoptotic cellen verwerven en herstellen hen voor verdere studie. Dus, we gebruiken de traditioneel goed aanvaarde markering van de beul caspase activering als de markering van de "point of no return"21 voor apoptosis en gebruik maken van de fluorescentie-activated cell sorting (FACS) om te discrimineren caspase-geactiveerde cellen gekleurd met Caspase-3/7 groen detectie kleurstof. De kleurstof is covalent gekoppeld aan een reeks van korte aminozuur, DEVD, die kan worden herkend en door actieve caspases 3/7 gekloofd. Het splijten helpt vrijlating van de kleurstof, die zal translocate van het cytosol aan de kern waar het zich bindt aan het DNA en stoot sterke fluorescentie. Deze procedure vermijdt met behulp van een bulk-celpopulatie waarin sommige cellen kunnen niet hebben ondergaan apoptosis.
CSCs of inleiding van de tumor cellen zijn geïdentificeerd in vele solide tumoren met een enkele of een combinatie van verschillende oppervlakte marker(s) en weinig nummers van deze cellen zijn voldoende om formulier tumoren in muizen immunodeficiëntie22,23,, 24,25,26,27. Een combinatie van CD44 en CD24 is vaak gebruikt in borst CSC studies en CD44+/CD24- cellen zijn gedefinieerd als de borst CSCs26,27,28,29 , 30. onlangs, wij hebben uitgevoerd een reeks experimenten om te bevestigen de voorgestelde relatie tussen apoptosis omkering en CSCs en aantonen dat omgekeerde borstkankercellen opgedaan meer tumor-vormende mogelijkheden in vitro en in vivo met een verhoogde percentage cellen met CSC markeringen18. Hoewel we niet uitsluiten kunnen dat borst CSCs beter overleven en dus na apoptosis omkering, vooral verrijkt krijgen wanneer we niet-stam kankercellen en onderwerp isoleren zal kunnen apoptosis omkering, CSC ontstaan in de oorspronkelijk niet-stam kanker-celpopulatie, suggereren dat niet-stam kanker cellen kunnen bijdragen tot de verhoging van het percentage van CSCs tijdens apoptosis omkering.
Dit artikel is bedoeld om aan te tonen van de overgang van niet-stam borstkankercellen naar borst CSC-achtige cellen na apoptosis omkering en deze overgang worden opgespoord door stroom cytometry. De borstkankercellen van niet-stam zijn aanvankelijk bereid door het isoleren van CD44-/CD24+ borstkanker kankercellen door FACS. Vervolgens is de apoptosis geïnduceerde en bevestigd door morfologische veranderingen onder de loep. Daarna zijn de apoptotic cellen positief gemerkt door Caspase-3/7 groen detectie kleurstof geïsoleerd door FACS en verder gekweekt in de afwezigheid van apoptotic inductoren voor apoptosis omkering. De omgekeerde cellen worden vervolgens gekleurd met CSC markeringen na 7 dagen van herstel voor flow cytometrische analyse. Cellen met CD44+/CD24- markeringen weer verschijnen in de omgekeerde bevolking, suggereren dat overgang van niet-stam kankercellen naar CSC-achtige cellen apoptosis omkering heeft geheerst.
Apoptosis omkering is waargenomen in meerdere kanker cellijnen evenals normale primaire cellen met verschillende apoptotic prikkels in vitro12,13behandeld. Dit proces is ook opgespoord in Drosophila model in vivo16,17,19. Veel informatie over het onderliggende mechanisme van kanker herval in verschillende kanker ziekte modellen en de oorsprong van CSCs kan worden verkregen door het gebruik van de techniek, zoals beschreven in dit manuscript.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T47D</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 annexin V conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A35109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>USB</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>USB</td>
			<td>16926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Red CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal antibodies against human CD24</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555428</td>
			<td>PE Clone:ML5 
			Lot:5049759 
			RRID:AB_395822</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal antibodies against human CD44</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 
			Lot:7230770 
			RRID:AB_1727485</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554648</td>
			<td>Clone:G155-178 (RUO) 
			RRID:AB_395491</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone:27-35 
			RRID:AB_647257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
			<td>phenol red-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>staurosporine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40-&#956;m nylon mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSuite software bundle v1.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView FV1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>60X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round-bottom polystyrene 12 &#215; 75 mm tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S3e sorter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1451006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric detection of newly-formed breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal

Kanker terugkeerpatroon is lang bestudeerd door oncologists terwijl de onderliggende mechanismen zijn nog steeds onduidelijk. Onlangs, wij en anderen vond dat een verschijnsel genaamd apoptosis omkering tot verhoogde tumorigeniciteit in verschillende cel modellen onder verschillende prikkels leidt. Eerdere studies hebben gericht geweest op het bijhouden van dit proces in vitro en in vivo; het isolement van echte omgekeerde cellen moet echter nog worden bereikt, die onze kennis over de gevolgen van apoptosis omkering beperkt. Hier, profiteren we van een kleurstof Caspase-3/7 groen detectie op etiket cellen met geactiveerde caspases na apoptotic inductie. Cellen met positieve signalen zijn verder geregeld door fluorescentie-activated cell sorting (FACS) voor herstel. Morfologische onderzoek onder confocale microscopie bevestigt de apoptotic status vóór FACS. Een toename van de tumorigeniciteit kan vaak worden toegeschreven aan de stijging in het percentage van de cel van de stam van kanker (CSC)-als cellen. Ook, gezien de heterogeniteit van borstkanker, identificatie van de oorsprong van deze CSC-achtige cellen zou essentieel zijn voor de behandeling van kanker. Zo bereiden we niet-stam borstkankercellen voordat triggering apoptosis, caspase-geactiveerde cellen isoleren en uitvoeren van de procedure van de omkering apoptosis. Stroom cytometry analyse blijkt dat borst CSC-achtige cellen opnieuw in de omgekeerde groep verschijnen, die aangeeft borst CSC-achtige cellen zijn doortocht van niet-stam borstkankercellen tijdens apoptosis omkering. Kortom omvat dit protocol de isolatie van apoptotic borstkankercellen en detectie van veranderingen in CSC percentage in omgekeerde cellen door stroom cytometry.

Om het observeren van de overgang van borst niet-stengel kankercellen te borst CSC-achtige cellen, een eerste sortering van CD44-/CD24+ borstkankercellen nodig waren. Voor de cellijn MCF-7, die ongeveer 0,15 procent cellen met CSC markeringen in de oorspronkelijke bevolking (Figuur 1), deze stap geholpen uitsluiten van de mogelijkheid van verrijking van de CSC tijdens apoptosis omkering. Integendeel, als er geen cellen met CSC markeringe...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal at JoVE.com

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal (Video) | JoVE

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van apoptotic borstkankercellen door fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren en de overgang van niet-stam borstkankercellen aan stamcel-achtige borstkankercellen na apoptosis omkering verder kan worden opgespoord door stroom cytometry.

Stroom cytometrische detectie van nieuwgevormde stamcel-achtige borstkankercellen na Apoptosis omkering

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

De isolaties van echte populaties van apoptotische omkeringscellen waren eerder een probleem, wat ons begrip over de gevolgen van een omkering van apoptose sterk beperkt. Dit protocol stelt ons in staat om een zuiverder populatie van apoptotische omkering cellen te genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gebruikte materialen en apparatuur op grote schaal beschikbaar zijn in verschillende instellingen.Deze techniek is gemakkelijk toepasbaar voor het isoleren van een zuiverder populaties van cellen die een omkering van apoptose hebben ondergaan. Zoals eerder gemeld, normale cellen kunnen ook gaan ondergaan apoptose omkering, dat afgezien van borstkanker cellen, verschillende chemocellen, evenals normale cellen, kan worden gestart en de verschillende apoptotische stimuli kunnen worden gebruikt. Omdat de omkeringscel door apoptose en snel sorteren is gegaan, is het herstelpercentage meestal laag.Een groter startcelnummer is opnieuw gecombineerd om de uiteindelijke opbrengst te verhogen. Om te beginnen, cultuur MCF-7, MDA-MB-231, Om te beginnen, cultuur MCF-7, MDA-MB-231, en T47D cellen, volgens het tekstprotocol. Daarna was je de cellen twee keer met PBS en voeg dan twee milliliter van 0,05 procent trypsine-EDTA van 0,05 procent trypsine-EDTA toe aan de MCF-7, en MDA-MB-231 cellen, naar de MCF-7, en MDA-MB-231 cellen, en twee milliliter van 0,25 procent trypsin-EDTA en twee milliliter van 0,25 procent trypsine-EDTA naar de T47D cellen.naar de T47D-cellen. Kweek de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius, in een vijf procent koolstofdioxide celkweek incubator. Terwijl de cellen uitbroeden, controleer het ontachement van de cellen met een microscoop om over-spijsvertering door trypsin-EDTA te voorkomen.Wanneer meer dan 90 procent van de cellen los, voeg vijf milliliter van voltooide RPMI medium aan de schotel, en pipette het over de cellaag oppervlak meerdere malen. Breng vervolgens de cellen over op 15 milliliter conische buizen en centrifuge. Gooi de supernatant weg en hang de pellets opnieuw op met FACS-buffer in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen.Verdeel vervolgens de cellen in verschillende buizen. Centrifuge de buizen nogmaals, en gooi de supernatant. Voeg vervolgens verdunde Fc-blok toe aan de monsters.Broed de monsters in het donker 20 minuten in het donker, voordat u de monsters opnieuw centrifugeert. Gooi hierna de supernatant weg. Voeg vervolgens fluorchrome-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen menselijke CD44, en CD24, tegen de menselijke CD44, en CD24, in een tot 40, en een tot 10 verdunningen, respectievelijk aan de dual-kleuring groepen.Voeg voor de positieve controles CD44-antilichamen voor de positieve controles toe aan de MDA-MB-231-cellen, aan de MDA-MB-231-cellen en CD24-antilichamen aan de MCF-7-cellen en CD24-antilichamen aan de MCF-7-cellen in respectievelijk één tot 40 en één tot 10 verdunningen. Voeg PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Add PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, verdund met een verhouding van één tot 40 tot cellen als isotopencontrole voor CD44-antilichamen. Voeg vervolgens PE Mouse IgG2a Kappa toe, voeg dan PE Mouse IgG2a Kappa toe, verdund met een verhouding van één tot 10 aan de cellen als isotopencontrole voor CD24-antilichamen.Broed de monsters in het donker gedurende 30 minuten in het donker. Dan, centrifuge de monsters op 300 g's Dan, centrifuge de monsters op 300 g's en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en was de pellet twee keer in 500 microliter PBS.Herhaal vervolgens de centrifugatie zoals eerder beschreven. Hang de pellet opnieuw op 0,5 milliliter PBS en filter de ophanging door een nylon gaas van 40 micrometer. Voer vervolgens de suspensie door een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder.Verzamel de cellen met CD44 negatief, en CD24 positieve markers in ronde bodem buizen met een milliliter van de collectie medium. Dan, centrifuge de buizen, en gooi de supernatant. Vervolgens, plaat de gesorteerde borst niet-stamkankercellen in een cultuur schotel met verse collectie medium voor verdere cultuur.Gebruik eerst een millimolar staurosporine in DMSO, Om 2,5 microkienaren staurosporine in medium te bereiden, volgens het tekstprotocol. Verwijder vervolgens het kweekmedium uit de cellen. Was de cellen met twee milliliter PBS eenmaal, na deze, voeg 10 milliliter van de staurosporine medium aan de MsF-7 cellen voor zes uur, om apoptose te induceren, wanneer de cellen zijn 70 procent confluent.Bereid vervolgens een millimolar paclitaxel in DMSO. Voeg vervolgens 12,5 microliter toe voeg vervolgens 12,5 microliter van de 1 millimolar paclitaxel toe aan het voltooide medium van de T47D-cellen om een eindvolume van 10 milliliter in een conische buis van 15 milliliter te vormen. Verwijder het kweekmedium uit de cellen en was de cellen met 2 milliliter PBS.Voeg vervolgens het paclitaxelmedium gedurende 10 uur toe aan de cellen om apoptose gedurende 10 uur te induceren om apoptose te induceren wanneer de cellen 70 procent samenvloeiing bereiken. Verwijder hierna het medium uit de met oplosmiddelen behandelde MCF-7-groep en was ze met twee milliliter PBS. Voeg vervolgens 10 milliliter van 0,25 procent DMSO-medium toe voeg vervolgens 10 milliliter van 0,25 procent DMSO-medium toe gedurende zes uur als oplosmiddelcontrole voor staurosporine.Verwijder het kweekmedium uit de met oplosmiddelen behandelde T47D-groep en was de cellen met twee milliliter PBS. Voeg vervolgens 10 milliliter van 0,05 procent DMSO-medium toe voeg vervolgens 10 milliliter van 0,05 procent DMSO-medium toe voor 10 uur als oplosmiddelcontrole voor paclitaxel. Vervolgens vlek de cel en broeden ze gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius in een vijf procent koolstofdioxide incubator.Gebruik een 60 keer confocale laserscanmicroscoop om de morfologische veranderingen van de behandelde cellen te observeren. Vlek zowel de apoptotische inductor en oplosmiddel behandelde MCF-7 en T47D cellen en oplosmiddel behandelde MCF-7 en T47D cellen in het donker gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een vijf procent koolstofdioxide incubator. Met behulp van de fluorescentie-geactiveerde celsorteerder, het verzamelen van de positieve cellen van de inducer behandelde groepen in ronde bodembuizen met een milliliter van de collectie medium.Dan, centrifuge de buizen zoals eerder beschreven, en gooi de supernatant. Verzamel de negatieve cellen uit de oplosmiddel behandelde groepen in ronde bodembuizen met een milliliter verzamelmedium. Centrifuge de buizen, en gooi de supernatant.Daarna worden de gesorteerde cellen opnieuw opgehangen in vers verzamelmedium. Zaad de cellen in 12-well weefsel cultuur platen, en cultuur ze voor zeven dagen voor apoptose omkering. Oogst de omgekeerde MCF-7 in zowel inducer als oplosmiddel behandelde groepen met 0,05 procent trypsin-EDTA.met 0,05 procent trypsin-EDTA. Oogst vervolgens de T47D-cellen in beide inductor Dan, oogst de T47D-cellen in zowel inducer- als oplosmiddelbehandelde groepen met 0,25 procent trypsine-EDTA. Bevlek de cellen met fluorchrome-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen menselijke CD44 en CD24.Terwijl de cellen vlek, bereid de isotype controles zoals eerder aangetoond. Ten slotte voert u de cellen uit op een stroomcytometer en detecteert u het percentage cellen met CD44-positieve en CD24-negatieve markeringen. In dit protocol werd de overgang van borstvrije kankercellen naar borst-CSC-achtige cellen waargenomen.Isolatie van niet-stamkankercellen werd voor het eerst gedaan in MCF-7 cellen. Typische morfologische veranderingen werden waargenomen na het toevoegen van apoptotische inducers, en de cellen hersteld van apoptose met vergelijkbare morfologie na drug terugtrekking. De caspace-geactiveerde cellen werden gelabeld en gesorteerd op basis van hun hogere fluorescense intensiteit dan cellen zonder caspace activering.Tijdens het apoptotische inductieproces werd oplosmiddel gebruikt om de mogelijkheid uit te sluiten dat de feitenprocedure, of het oplosmiddel zelf, de oorzaak was van de overgang. Caspace-geactiveerde cellen in de apoptotische-inducer behandeling groepen bleken te zijn een nexin vijf positieve en PI negatief, wat suggereert dat ze apoptotische cellen. De apoptotische cellen werden verzameld en gekweekt voor herstel, in vergelijking met de oplosmiddel behandelde groepen, flow cytometrische analyse toonde aan dat er cellen in de CD44 positieve en CD24 negatieve kwadrant in de omgekeerde oorspronkelijk borst niet-stamkanker cel populatie.Gaging is belangrijk in flow analyse en cel sorteren, dat voldoende controle moet worden voorbereid in de laboratoria. Aangezien deze in vitro apoptose omkeringsprocedure zuivere apoptotische kankercellen isoleert, kunnen experimenten zoals in vivo tumorigenese activa worden uitgevoerd om de gevolgen van echte omgekeerde cellen te begrijpen. Deze techniek werpt licht op de oorzaak van kanker terugval, daarom kan worden onderzocht om mogelijk te voorkomen dat de herhaling bij kankerpatiënten.Vergeet niet om jezelf goed te beschermen bij het uitvoeren van celkweek experimenten volgens de biosafe-tier regelgeving bij uw instelling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NFÃŽÂºB Activity and Breast Cancer Stem Cells (Video) | JoVE

Synthese en karakterisering van een Aspirine-fumaraat Prodrug dat NFKB Activity and Breast Kanker stamcellen Remt

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema (Video) | JoVE

Echografisch Evaluatie van borstkanker gerelateerd lymfoedeem

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish (Video) | JoVE

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60 (Video) | JoVE

Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro (Video) | JoVE

Detectie van Mitochondria membraanpotentiaal CLIC4 Knockdown-geïnduceerde HN4 cel Apoptosis om te studeren In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells (Video) | JoVE

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia (Video) | JoVE

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of ÃŽÂ³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry (Video) | JoVE

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors (Video) | JoVE

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model (Video) | JoVE

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...