Name: flow cytometric detection of newly-formed breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par le fonds innovante technologie d’Innovation Technology Commission : aide financière de l’état clé de laboratoire d’agrobiotechnologie (CUHK), le fonds de recherche biomédicale Lo Kwee-Seong et la fondation de Hysan Lee. Y.X. était soutenue par la bourse postdoctorale de la CUHK.

1. préparation du cancer du sein Non-souches de cellules cancéreuses
<ol><li>La culture MCF-7 et les cellules MDA-MB-231 dans 10 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sans rouge de phénol additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) dans un plat de 100 mm. Culture T47D dans 10 mL d’un milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol additionné de 2 mM de L-glutamine, 10 % inactivés par la chaleur SVF et 1 % v/v pénicilline-streptomycine (PS) dans un plat ...

Ce protocole décrit une manière directe et claire pour la détection de la transition des cellules mammaires cancéreuses non souches en cellules semblables à des CSC du sein en raison de l’inversion de l’apoptose. Confirmation des propriétés de ces cellules inversés CSC pourrait assistée à l’aide j’ain vitro mammosphere formation test et in vivo xénogreffe transplantation dans des souris immunodéficientes18,24,<sup ...

Le cancer a été des principales causes de la mort, provoquant le lourd fardeau aux pays dans le monde1. Le cancer occupe un rang élevé, tant en termes d’incidence et de mortalité chez les femmes entre tous les types de cancer1. En raison de l’hétérogénéité du cancer, une combinaison de médicaments est habituellement utilisée en chimiothérapie pour atteindre cancer cell death2,3,4. Cependant, puisque la communes médicaments chimiothérapeutiques ciblent souvent ADN5,6, synthèse7,8 et/ou microtubule dynamique des protéines9, les cellules à croissance rapide sont touchés le plus tout en les cellules quiescentes comme cancer stem cell (CSC) s sont généralement moins touchées10. CSC n’est donc plus susceptibles de survivre après le traitement, qui conduit plus tard à la résistance aux médicaments et le cancer rechute10,11. Par conséquent, élimination des CSC est devenu un sujet important pour le traitement du cancer et étude de l’origine des CSC est nécessaire.
D’autres études sur le phénomène de l’inversion de l’apoptose ont été réalisées dans les dix dernières années12,13,14,15,16,17,18 , 19. avant l’émergence de ce concept, il a été largement acceptée que les cellules subiront irréversiblement l’apoptose après l’activation de la caspase. Caspases sont une famille d’enzymes de protéines qui jouent un rôle clé dans les stades initiation et l’exécution de l’apoptose, y compris la formation de complexes apoptotiques et le clivage des substrats en aval20. Activation des caspases bourreau comme caspase 3 ou caspase 7 a été considérée comme le « point de non retour » pour l’apoptose21. Toutefois, les chercheurs ont observé récemment que l’apoptose inversion produit deux études in vitro et in vivo, au cours de laquelle les cellules peut récupérer l’apoptose même après caspase activation12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. en outre, caractéristiques agressives comme une résistance plus élevée à l’original inducteur d’apoptose et techniques plus invasives sont détectés dans le cancer inversé cellules15. Par conséquent, il a été proposé que le pourcentage de cellules semblables à des CSC serait plus élevé dans la population inversée par rapport aux cellules non traitées, éventuellement contribuer aux fonctionnalités plus malignes après l’apoptose inversion18.
Auparavant, beaucoup s’est efforcé de suivre le renversement de l’apoptose in vitro et, plus important encore, in vivo, qui contribuent grandement à confirmer l’universalité de ce processus16,17,19. Cependant, une étude systémique sur les conséquences des cellules inversées manque en raison de l’isolement insatisfaisante des cellules qui ont véritablement fait l’objet d’inversion de l’apoptose. Il est nécessaire d’acquérir des cellules apoptotiques pure et les récupérer pour complément d’étude. Ainsi, nous utilisons le marqueur traditionnellement reconnu de l’activation des caspases bourreau comme marqueur du « point of no return »21 d’apoptose et utiliser la cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour discriminer les caspases activées cellules colorées avec de la teinture de la Caspase-3/7 vert détection. Le colorant est lié par covalence à une séquence d’acide aminés court, hanane, qui peut être reconnu et clivé par active caspases 3/7. Le clivage aide à libérer la teinture, qui va effectuer des transferts du cytosol vers le noyau où il se lie à l’ADN et émet une fluorescence forte. Cette procédure évite d’utiliser une population de cellules en vrac dans lequel certaines cellules ne peuvent pas avoir subi l’apoptose.
CCF ou déclenchant les tumeurs des cellules ont été identifiés dans nombreuses tumeurs solides à l’aide d’un seul ou une combinaison de plusieurs marqueurs de surface et très peu de nombre de ces cellules ne suffisent pas à former des tumeurs dans des souris immunodéficientes22,23, 24,25,26,27. Une combinaison de CD44 et CD24 a été couramment utilisée dans les études du sein CSC et CD44+/CD24– cellules ont été définis comme la poitrine CSC26,27,28,29 , 30. récemment, nous avons effectué une série d’expériences pour confirmer la relation proposée entre le renversement de l’apoptose et CCS et démontrer que les cellules cancéreuses mammaires inversé acquise capacité accrue de formation tumorale in vitro et in vivo avec un pourcentage élevé de cellules avec des marqueurs de CSC18. Bien que nous ne pourrions pas exclure la possibilité que du sein CSCs survivent mieux et ainsi obtenir enrichis après le renversement de l’apoptose, ce qui est important, lorsque nous isoler des cellules souches non cancéreuses et sujet à l’inversion de l’apoptose, CSC verront le jour dans l’origine non souches population de cellules de cancer, ce qui suggère que non-souches du cancer, les cellules peuvent contribuer à l’augmentation du pourcentage de CSC au cours de l’inversion de l’apoptose.
Cet article a pour but de démontrer le passage de cellules-souches non cancéreuses du sein à CSC-comme les cellules du sein après le renversement de l’apoptose et de détecter cette transition par cytométrie en flux. Les cellules souches non cancéreuses sont préparés au départ en isolant CD44–/CD24+ sein des cellules cancéreuses par FACS. Puis, l’apoptose est induite et confirmé par des changements morphologiques sous le microscope. Par la suite, les cellules apoptotiques positivement marqué par le colorant vert détection Caspase 3/7 sont isolées par FACS et ensuite mis en culture en l’absence d’apoptotic inducteurs d’inversion de l’apoptose. Les cellules inversés sont ensuite colorées avec des marqueurs de la CSC après 7 jours de récupération pour cytométrie. Cellules avec CD44+/CD24– marqueurs reparaissent dans la population inversée, ce qui laisse supposer que transition entre cellules souches non cancéreuses et des cellules semblables à CSC est apparue au cours de l’inversion de l’apoptose.
Inversion de l’apoptose a été observée dans le cancer de plusieurs lignées cellulaires comme les cellules primaires normales traitées avec des stimuli apoptotiques différents en vitro12,13. Ce processus a également été suivi chez la drosophile modèle in vivo16,17,19. Beaucoup d’informations concernant le mécanisme sous-jacent de rechute du cancer dans les modèles de la maladie de cancer différents et l’origine des CSC peut être obtenue par l’utilisation de la technique que décrit dans ce manuscrit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T47D</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 annexin V conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A35109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>USB</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>USB</td>
			<td>16926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Red CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal antibodies against human CD24</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555428</td>
			<td>PE Clone:ML5 
			Lot:5049759 
			RRID:AB_395822</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal antibodies against human CD44</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 
			Lot:7230770 
			RRID:AB_1727485</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554648</td>
			<td>Clone:G155-178 (RUO) 
			RRID:AB_395491</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone:27-35 
			RRID:AB_647257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
			<td>phenol red-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>staurosporine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40-&#956;m nylon mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSuite software bundle v1.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView FV1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>60X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round-bottom polystyrene 12 &#215; 75 mm tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S3e sorter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1451006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric detection of newly-formed breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal

Récidive du cancer a longtemps étudié par les oncologues tandis que les mécanismes sous-jacents demeurent obscures. Récemment, nous et autres découvrirent qu’un phénomène appelé apoptose inversion entraîne tumorigénicité accrue dans différents modèles de cellule sous différents stimuli. Des études antérieures ont surtout portés sur le suivi de ce processus in vitro et in vivo ; Toutefois, l’isolement de cellules réelle inversées doit encore à atteindre, qui limite notre compréhension sur les conséquences de l’inversion de l’apoptose. Ici, nous profitons d’un colorant de la Caspase-3/7 vert détection pour marquer les cellules avec des caspases activés après l’induction de l’apoptose. Cellules avec des signaux positifs sont plus triés par cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour la récupération. L’examen morphologique en microscopie confocale permet de confirmer le statut d’apoptotic avant FACS. Une augmentation de la tumorigénicité peut souvent être attribuée à l’élévation du pourcentage de cellules de souches du cancer (SCC)-comme des cellules. Aussi, compte tenu de l’hétérogénéité du cancer du sein, identifier l’origine de ces cellules CSC serait essentiel pour le traitement du cancer. Ainsi, nous préparons des cellules-souches non cancéreuses du sein avant le déclenchement de l’apoptose, isoler les cellules activées caspase et effectuez la procédure d’inversion de l’apoptose. Analyse en cytométrie en flux révèle que cellules mammaires CSC ré-apparaissent dans le groupe inversé, indiquant les cellules mammaires CSC sont transités de cellules-souches non cancéreuses du sein au cours de l’inversion de l’apoptose. En résumé, ce protocole inclut l’isolement des cellules de cancer du sein apoptotic et détection des variations en pourcentage de la CSC dans les cellules inversées par cytométrie en flux.

Afin d’observer la transition du sein non souches cellules cancéreuses à des cellules mammaires semblables à CSC, un premier tri de CD44–/CD24+ cellules cancéreuses du sein ont été nécessaires. Pour la lignée de cellules MCF-7, qui a environ 0,15 % cellules avec des marqueurs de CSC dans la population d’origine (Figure 1), cette étape a contribué à exclure la possibilité d’enrichissement de la CSC au cours de l’inve...

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Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules apoptotiques de cancer du sein par un tri de fluorescence-lancée de cellules et plus détecter le passage de cellules non souches du cancer du sein de cellules de cellules souches-comme pour le cancer du sein après le renversement de l’apoptose par cytométrie en flux.

Débit par cytométrie en flux détection de cellules de cellules souches-comme pour le Cancer du sein nouvellement formé après le renversement de l’apoptose

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Les isolements des populations réelles de cellules d’inversion apoptotique a été un problème précédemment, qui limite considérablement notre compréhension sur les conséquences de l’inversion de l’apoptose. Ce protocole nous permet de générer une population plus pure de cellules d’inversion apoptotique. Le principal avantage de cette technique est que les matériaux et l’équipement utilisés sont largement disponibles dans différentes institutions.Cette technique est facilement applicable pour isoler une population plus pure de cellules qui ont subi l’inversion de l’apoptose. Comme indiqué précédemment, les cellules normales peuvent également aller subir l’inversion d’apoptose, qu’en dehors des cellules cancéreuses du sein, différentes cellules de chimio, aussi bien que les cellules normales, peuvent être commencées et les divers stimulus apoptotiques peuvent être utilisés. Puisque la cellule d’inversion est passée par l’apoptose et le tri rapide, le taux de rétablissement est habituellement bas.Un plus grand nombre de cellules de départ est recombinant pour augmenter le rendement final. Pour commencer, la culture MCF-7, MDA-MB-231, Pour commencer, la culture MCF-7, MDA-MB-231, et les cellules T47D, selon le protocole de texte. Après cela, laver les cellules avec PBS deux fois, puis ajouter deux millilitres de 0,05 pour cent trypsine-EDTA de 0,05 pour cent trypsine-EDTA à la MCF-7, et les cellules MDA-MB-231, aux cellules MCF-7, et MDA-MB-231, et deux millilitres de trypsine-EDTA de 0,25 pour cent et de deux millilitres de trypsine-EDTA de 0,25 pour cent aux cellules T47D.aux cellules T47D. Culture des cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, dans un incubateur de culture de cellules de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Pendant que les cellules couvent, vérifiez le détachement des cellules à l’aide d’un microscope pour éviter la surdigestion par trypsine-EDTA.Lorsque plus de 90 pour cent des cellules se détachent, ajouter cinq millilitres de milieu RPMI complété au plat, et pipette sur la surface de la couche cellulaire à plusieurs reprises. Ensuite, transférez les cellules dans des tubes coniques de 15 millilitres et une centrifugeuse. Jetez le supernatant et suspendez les granulés avec tampon FACS dans des tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.Ensuite, divisez les cellules en plusieurs tubes. Centrifuger les tubes une fois de plus, et jeter le supernatant. Ensuite, ajouter le bloc Fc dilué aux échantillons.Incuber les échantillons sur la glace dans l’obscurité pendant 20 minutes, avant de les recouver à nouveau. Après cela, jeter le surnatant. Ensuite, ajoutez des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome contre les CD44 humains, et le CD24, contre le CD44 humain, et le CD24, dans un à 40, et un à dix dilutions, respectivement, aux groupes à double coloration.Pour les contrôles positifs, ajouter des anticorps CD44 Pour les contrôles positifs, ajouter des anticorps CD44 aux cellules MDA-MB-231, aux cellules MDA-MB-231, et des anticorps CD24 aux cellules MCF-7 et aux anticorps CD24 aux cellules MCF-7 dans un à 40, et un à 10 dilutions, respectivement. Ajouter PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Ajouter PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, dilué à un rapport d’un à 40 par rapport aux cellules comme un contrôle isotopique pour les anticorps CD44. Ensuite, ajouter PE Mouse IgG2a Kappa, Puis, ajouter PE Mouse IgG2a Kappa, dilué à un rapport d’un à 10 pour les cellules comme un contrôle isotopique pour les anticorps CD24.Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons à 300 g puis, centrifugez les échantillons à 300 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et lavez la pastille deux fois dans 500 micro-litres de PBS.Ensuite, répétez la centrifugation comme décrit précédemment. Suspendre à nouveau la pastille sur 0,5 millilitres de PBS et filtrer la suspension à l’aide d’un maillage en nylon de 40 micromètres. Ensuite, exécutez la suspension à travers un trieur de cellules activé par fluorescence.Recueillir les cellules avec des marqueurs négatifs CD44, et CD24 marqueurs positifs dans les tubes à fond rond contenant un millilitre de milieu de collecte. Puis, centrifuger les tubes, et jeter le supernatant. Ensuite, plaquez les cellules cancéreuses non souches triées du sein dans un plat de culture contenant un milieu de collecte frais pour une culture plus douce.Tout d’abord, utiliser une staurosporine millimolaire dans DMSO, Pour préparer 2,5 micro-molaires staurosporine en milieu, selon le protocole du texte. Ensuite, retirez le milieu de culture des cellules. Lavez les cellules avec deux millilitres de PBS une fois, après cela, ajouter 10 millilitres du milieu staurosporine aux cellules MSF-7 pendant six heures, pour induire l’apoptose, lorsque les cellules sont 70 pour cent confluent.Ensuite, préparez un paclitaxel millimolaire dans DMSO. Ensuite, ajoutez 12,5 micro-litres Puis, ajoutez 12,5 micro-litres du paclitaxel de 1 millimolaire au milieu complété des cellules T47D pour faire un volume final de 10 millilitres dans un tube conique de 15 millilitres. Retirez le milieu de culture des cellules et lavez les cellules avec 2 millilitres de PBS.Ensuite, ajouter le milieu paclitaxel aux cellules pendant 10 heures pour induire l’apoptose pendant 10 heures pour induire l’apoptose lorsque les cellules atteignent 70 pour cent de confluence. Après cela, retirez le milieu du groupe MCF-7 traité au solvant et lavez-le avec deux millilitres de PBS. Ensuite, ajouter 10 millilitres de 0,25 pour cent DMSO moyen Puis, ajouter 10 millilitres de 0,25 pour cent DMSO moyen pendant six heures que le contrôle des solvants pour la staurosporine.Retirez le milieu de culture du groupe T47D traité au solvant et lavez les cellules avec deux millilitres de PBS. Ensuite, ajouter 10 millilitres de 0,05 pour cent DMSO moyen Puis, ajouter 10 millilitres de 0,05 pour cent DMSO moyen pendant 10 heures que le contrôle des solvants pour le paclitaxel. Ensuite, tacher la cellule et les incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent.Utilisez un microscope à balayage laser 60 fois confocal pour observer les changements morphologiques des cellules traitées. Tacher à la fois l’inducteur apoptotique et les cellules MCF-7 et T47D traitées par solvant et les cellules MCF-7 et T47D traitées par solvant dans l’obscurité pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone de cinq pour cent. À l’aide du trieur cellulaire activé par fluorescence, recueillir les cellules positives des groupes traités par l’inducteur dans des tubes de fond ronds contenant un millilitre de milieu de collecte.Ensuite, centrifugez les tubes comme décrit précédemment, et jetez le supernatant. Recueillir les cellules négatives des groupes traités au solvant dans des tubes à fond rond avec un millilitre de milieu de collecte. Centrifuger les tubes, et jeter le supernatant.Après cela, suspendre à nouveau les cellules triées dans le milieu de collecte frais. Ensemencer les cellules dans des plaques de culture tissulaire de 12 puits, et les culture pendant sept jours pour l’inversion de l’apoptose. Récoltez le MCF-7 inversé dans les groupes induits et traités par solvant avec 0,05 pour cent trypsine-EDTA.avec 0,05 pour cent trypsin-EDTA. Puis, récolter les cellules T47D dans les deux inducteurs Puis, récolter les cellules T47D dans les deux groupes inducteurs et traités par solvant avec 0,25 pour cent trypsine-EDTA. Tacher les cellules avec des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome contre les CD44 et CD24 humains.Tandis que les cellules tachent, préparez les contrôles d’isotype comme précédemment démontré. Enfin, exécutez les cellules sur un cytomètre d’écoulement, et détectez le pourcentage de cellules avec des marqueurs négatifs CD44 positifs et CD24. Dans ce protocole, la transition des cellules cancéreuses non souches du sein aux cellules sein csc-like a été observée.L’isolement des cellules cancéreuses non souches a d’abord été fait dans les cellules MCF-7. Des changements morphologiques typiques ont été observés après ajout d’inducteurs apoptotiques, et les cellules se sont rétablies de l’apoptose avec la morphologie semblable après retrait de drogue. Les cellules activées par caspace ont été étiquetées et triées en fonction de leur intensité fluorescense plus élevée que les cellules sans activation de caspace.Au cours du processus d’induction apoptotique, le solvant a été utilisé pour exclure la possibilité que la procédure des faits, ou le solvant lui-même, était la cause de la transition. Les cellules caspace-activées dans les groupes de traitement apoptotic-inducteur se sont trouvées pour être un nexin cinq positif et négatif de PI, suggérant qu’ils étaient des cellules apoptotiques. Les cellules apoptotiques ont été rassemblées et cultivés pour le rétablissement, comparées aux groupes solvant-traités, l’analyse cytométrique de flux a prouvé qu’il y avait des cellules apparaissant dans le quadrant positif de CD44 et cd24 négatif dans la population inversée à l’origine de cellules cancéreuses non souches de sein.Le bâillonnement est important dans l’analyse du débit et le tri cellulaire, afin qu’un contrôle suffisant soit préparé dans les laboratoires. Puisque cette procédure in vitro d’inversion d’apoptose isole les cellules cancéreuses apoptotiques pures, des expériences telles que les actifs in vivo tumorigenesis peuvent être conduites pour comprendre les conséquences de l’inverse réel des cellules. Cette technique met en lumière la cause de la rechute du cancer, par conséquent, il peut être étudié pour potentiellement prévenir la ré-occurrence chez les patients atteints de cancer.N’oubliez pas de vous protéger correctement lorsque vous effectuez des expériences de culture cellulaire conformément aux règlements de niveau biosécurité de votre établissement.

Research

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Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

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We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of Î³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

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Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...