Name: flow cytometric detection of newly-formed breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal at JoVE.com

Detta arbete stöds av innovativa teknologi fond av Innovation Technology kommissionen: finansiering stöd från de statliga nyckel laboratorium av Agrobiotechnology (CUHK), Lo Kwee-Seong biomedicinsk forskningsfonden och stiftelsen Lee Hysan. Y.X. stöddes av doktorandtjänst från CUHK.

1. beredning av bröst icke-stammen cancerceller
<ol><li>Kultur MCF-7 och MDA-MB-231 celler i 10 mL fenol red-gratis Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS) i en 100 mm maträtt. Kultur T47D i 10 mL av phenol red-gratis RPMI 1640 medium kompletteras med 2 mM L-glutamin, 10% Värmeinaktiverade FBS, och 1% v/v Penicillin-Streptomycin (PS) i en 100 mm maträtt. Kultur celler vid 37 ° C i en 5% CO2/95% luft cell kultur...

Det här protokollet beskriver ett direkt och tydligt sätt för att upptäcka icke-stammen bröstcancerceller övergång till bröst CSC-liknande celler till följd av apoptos återföring. Bekräftelse av CSC egenskaperna hos dessa omvända celler kan biträdas av använder jagn vitro mammosphere bildandet analys och i vivo xenograft transplantation i nedsatt immunförsvar möss18,24,26 ,<sup clas...

Cancer har varit en ledande dödsorsak, orsakar tung börda till länder i hela världen1. Bröstcancer rankas högt både när det gäller incidens och dödlighet hos kvinnliga patienter bland alla typer av cancer1. På grund av cancer heterogenitet används vanligtvis en kombination av läkemedel för kemoterapi för att uppnå cancer cell death2,3,4. Eftersom vanliga cellgifter rikta ofta DNA5,6, påverkade proteinsyntes7,8 eller mikrotubulära dynamics9, snabbt växande celler är dock mest medan quiescent celler såsom cancer stamceller (CSC) s är oftast mindre drabbade10. CSCs är därför mer benägna att överleva efter behandlingen, som senare leder till läkemedelsresistens och cancer återfall10,11. Därför, eliminering av CSCs har blivit ett viktigt ämne för cancerbehandling och studie av CSCs ursprung är nödvändigt.
Fler studier på fenomenet apoptos återföring har utförts i det senaste decenniet12,13,14,15,16,17,18 , 19. före uppkomsten av detta begrepp, det har varit allmänt accepterat att celler oåterkalleligt kommer att genomgå apoptos efter kaspas aktivering. Kaspaserna är en familj av protein enzymer som spelar viktiga roller i de inledande och utförande stadierna av apoptos, inklusive bildandet av den komplexa apoptotiska och klyvning av nedströms substrat20. Aktivering av bödeln kaspaserna såsom kaspas 3 eller kaspas 7 har betraktats som den ”point of no return” för apoptos21. Dock konstaterats forskare nyligen att apoptos återföring sker både in vitro- och in vivo, under vilka celler kan återhämta sig från apoptos även efter kaspas aktiveringen12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Dessutom aggressiva funktioner såsom högre motstånd mot ursprungliga apoptotiska inducerare och högre invasivitet upptäcks i omvänd cancer cells15. Det föreslogs därför att procentandelen av CSC-liknande celler skulle vara högre i den omvända befolkningen jämfört med obehandlade cellerna, så småningom bidrar till mer maligna funktioner efter apoptos återföring18.
Tidigare, många ansträngningar har gjorts att spåra apoptos återföring och viktigare, in vivo som kraftigt bidra till bekräftar denna process16,17,19universalitet. Dock saknas en systemisk studie om konsekvenserna av omvänd celler på grund av den otillfredsställande isoleringen av celler som har verkligen genomgått apoptos återföring. Det finns ett behov av att förvärva pure apoptotiska celler och återställa dem för vidare studier. Således använder vi den traditionellt väl accepterade markören för bödeln kaspas aktivering som markeringen av ”point of no return”21 för apoptos och utnyttja fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) att diskriminera kaspas-aktiverade celler målat med kaspas-3/7 grön Detection färgämne. Färgen är kovalent kopplad till en kort aminosyrasekvens, DEVD, som kan identifieras och klyvs av aktiva kaspaserna 3/7. Klyvning hjälper släppa färgämnet, som kommer translocate från cytosolen till kärnan där det binder till DNA och avger stark fluorescens. Detta förfarande undviks med hjälp av en bulk cell befolkningen i vilken vissa celler inte kan ha genomgått apoptos.
CSCs eller tumör-inleda celler har identifierats i många solida tumörer med hjälp av en enda eller en kombination av flera ytan marker(s) och mycket få siffror av dessa celler är tillräckliga för att bilda tumörer i nedsatt immunförsvar möss22,23, 24,25,26,27. En kombination av CD44 och CD24 har vanligen använts i bröstet CSC studier och CD44+/CD24– celler har definierats som bröstet CSCs26,27,28,29 , 30. nyligen, vi har utfört en serie experiment för att bekräfta det föreslagna förhållandet mellan apoptos återföring och CSCs och demonstrera att omvända bröstcancerceller fick ökad tumör-bilda förmåga in vitro- och in vivo med en förhöjd procentandelen celler med CSC markörer18. Även om vi inte kunde utesluta möjligheten att bröst CSCs överleva bättre och därmed få berikad efter apoptos återföring, ännu viktigare, när vi isolerar icke-stammen cancerceller och ämne dem till apoptos omsvängning, CSC kommer att dyka upp i ursprungligen icke-stammen cancer cell befolkningen, tyder på att icke-stammen cancer celler kan bidra till ökningen av procentandelen av CSCs under apoptos återföring.
Denna artikel syftar till att demonstrera övergången från icke-stammen bröstcancerceller till bröst CSC-liknande celler efter apoptos återföring och upptäcka denna övergång av flödescytometri. De bröstcancer cellerna icke-stammen är initialt beredda genom att isolera CD44–/CD24+ breast cancerceller av FACS. Sedan är apoptos induceras och bekräftas av morfologiska förändringar under mikroskopet. Efteråt, apoptotiska celler positivt-märkt av kaspas 3/7 grön upptäckt dye har isolerats av FACS och ytterligare odlade i avsaknad av apoptotiska inducerare för apoptos återföring. Återförda cellerna färgas sedan med CSC markörer efter 7 dagars återhämtning för flöde flödescytometrisk analys. Celler med CD44+/CD24– markörer visas igen i den omvända befolkningen, vilket tyder på att övergången från icke-stammen cancerceller till CSC-liknande celler har inträffat under apoptos återföring.
Apoptos återföring har observerats i flera cancer cell linjer samt normal primära celler behandlas med olika apoptotiska stimuli i vitro12,13. Denna process har också spårats i Drosophila modell i vivo16,17,19. Mycket information om den underliggande mekanismen av cancer återfall i olika cancer sjukdomsmodeller och ursprunget till CSCs kan erhållas genom användning av tekniken som beskrivs i detta manuskript.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MCF-7</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T47D</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>HTB-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 annexin V conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A35109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>USB</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>USB</td>
			<td>16926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Red CMXRos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal antibodies against human CD24</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555428</td>
			<td>PE Clone:ML5 
			Lot:5049759 
			RRID:AB_395822</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal antibodies against human CD44</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 
			Lot:7230770 
			RRID:AB_1727485</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554648</td>
			<td>Clone:G155-178 (RUO) 
			RRID:AB_395491</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone:27-35 
			RRID:AB_647257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>propidium iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
			<td>phenol red-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>staurosporine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40-&#956;m nylon mesh</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSuite software bundle v1.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>651155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView FV1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>60X objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round-bottom polystyrene 12 &#215; 75 mm tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S3e sorter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1451006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric detection of newly-formed breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal

Återfall har länge studerats av onkologer medan de bakomliggande mekanismerna är oklara. Nyligen hittade vi och andra som ett fenomen som heter apoptos återföring leder till ökad tumorigenicitetsprov i olika cellmodeller under olika stimuli. Tidigare studier har fokuserat på spåra denna process in vitro- och in vivo; isolering av verkligt omvända celler har dock ännu ska uppnås, vilket begränsar vår förståelse om konsekvenserna av apoptos återföring. Här, utnyttja vi kaspas-3/7 grön Detection färgämne till etikett celler med aktiverade kaspaserna efter apoptotiska induktion. Celler med positiva signaler sorteras ytterligare av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för återställning. Morfologisk undersökning under konfokalmikroskopi hjälper till att bekräfta apoptotiska status innan FACS. En ökning av tumorigenicitetsprov kan ofta härledas till höjden procentandel av cancer stamceller (CSC)-som celler. Dessutom skulle ges heterogenitet av bröstcancer, att identifiera ursprunget av dessa CSC-liknande celler vara kritiska cancerbehandling. Således förbereda vi bröstcancerceller för icke-stammen innan utlöser apoptos, isolera kaspas-aktiverade celler och utföra apoptos återföring procedur. Flödescytometri Flödesanalys avslöjar att bröst CSC-liknande celler visas igen i gruppen omvända indikerar bröst CSC-liknande celler är transiterat från icke-stammen bröstcancerceller under apoptos återföring. Sammanfattningsvis innehåller detta protokoll isolering av apoptotiska bröstcancerceller och upptäckt av förändringar i CSC procentsats i omvänd celler av flödescytometri.

För att observera övergången från bröst icke-stammen cancerceller till bröst CSC-liknande celler, en första sortering av CD44–/CD24+ bröstcancerceller behövdes. För MCF-7 cell raden, som har cirka 0,15% celler med CSC markörer i den original-befolkningen (figur 1), detta steg hjälpte utesluta möjligheten av CSC anrikning under apoptos återföring. Tvärtom, om det fanns inga celler med CSC markörer i den original-befolkn...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal at JoVE.com

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera apoptotiska bröstcancerceller genom fluorescens-aktiverad cell sortering och ytterligare upptäcka övergången av bröstcancerceller att stamceller-liknande bröstcancerceller icke-stammen efter apoptos återföring av flödescytometri.

Flöde flödescytometrisk påvisa nybildade Stem Cell-liknande bröstcancerceller efter apoptos återföring

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Isoleringar av äkta populationer av apoptotiska återföring celler har varit ett problem tidigare, vilket kraftigt begränsar vår förståelse om konsekvenserna av apoptos återföring. Detta protokoll tillåter oss att generera en renare populationer av apoptotiska återföring celler. Den största fördelen med denna teknik är att de material och den utrustning som används är allmänt tillgängliga i olika institution.Denna teknik är lätt tillämplig för att isolera en renare populationer av celler som har genomgått återföring av apoptos. Som tidigare rapporterats, kan normala celler också gå genomgå apoptos återföring, att bortsett från bröstcancerceller, olika cellgifter celler, liksom normala celler, kan startas och de olika apoptotiska stimuli kan användas. Eftersom återföringscellen har gått igenom apoptos och snabb sortering är återställningshastigheten vanligtvis låg.Ett större startcellsnummer är rekombinant för att öka den slutliga avkastningen. Till att börja med kultur MCF-7, MDA-MB-231, För att börja, kultur MCF-7, MDA-MB-231 och T47D celler, enligt textprotokollet. Efter detta, tvätta cellerna med PBS två gånger, sedan lägga till två milliliter på 0,05 procent trypsin-EDTA av 0,05 procent trypsin-EDTA till MCF-7, och MDA-MB-231 celler, till MCF-7, och MDA-MB-231 celler, och två milliliter på 0,25 procent trypsin-EDTA och två milliliter på 0,25 procent trypsin-EDTA till T47D cellerna.till T47D-cellerna. Odla cellerna i fem minuter vid 37 grader Celsius, i en fem procent koldioxidcellkultur inkubator. Medan cellerna inkuberar, kontrollera lossnar av cellerna med mikroskop för att förhindra över-matsmältningen genom trypsin-EDTA.När mer än 90 procent av cellerna lossnar, tillsätt fem milliliter av färdigt RPMI medium till skålen, och pipettera den över cellskiktet ytan flera gånger. Sedan överför cellerna till 15 milliliter koniska rör, och centrifug. Kasta supernatanten och dra tillbaka pelletsen med FACS-buffert i mikrocentrifugrör på 1,5 milliliter.Sedan, dela cellerna i flera rör. Centrifugera rören en gång till, och kasta supernatanten. Lägg sedan till utspädd Fc-block i proverna.Inkubera proverna på is i mörker i 20 minuter, innan man centrifugerar proverna igen. Efter detta, kasta supernatanten. Därefter lägger du till fluorokrom-konjugerade monoklonala antikroppar mot mänskliga CD44, och CD24, mot mänskliga CD44, och CD24, i en till 40, och en till 10 utspädningar, respektive, till de dubbla-färgning grupper.För de positiva kontrollerna lägger du till CD44-antikroppar För de positiva kontrollerna, lägg till CD44-antikroppar mot MDA-MB-231-cellerna, till MDA-MB-231-cellerna och CD24-antikropparna mot MCF-7-cellerna och CD24-antikropparna mot CELLERNA MCF-7 i en till 40 respektive en till 10 utspädningar. Lägg till PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Lägg till PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, utspädd vid ett ett till 40 förhållande till celler som en isotopkontroll för CD44-antikroppar. Sedan, lägga TILL PE Mouse IgG2a Kappa, Lägg sedan till PE Mouse IgG2a Kappa, utspädd vid ett ett till 10-förhållande till cellerna som en isotopkontroll för CD24-antikroppar.Inkubera proverna i fyra grader Celsius i mörker i 30 minuter. Sedan centrifugerna proverna vid 300 g's Then, centrifugera proverna vid 300 g och fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatanten och tvätta pelleten två gånger i 500 mikroliter PBS.Upprepa sedan centrifugeringen som tidigare beskrivits. Åter upphäva pelleten på 0,5 milliliter PBS, och filtrera suspensionen genom en 40 mikrometer nylon mesh. Kör sedan suspensionen genom en fluorescensaktiverad cellsorterare.Samla in cellerna med CD44-negativ, och CD24-positiva markörer i rundbottensrör som innehåller ett milliliter samlingsmedium. Sedan centrifug rören, och kasta supernatanten. Därefter plattan sorterade bröst icke-stamceller cancerceller i en kultur maträtt som innehåller färska samling medium för ytterligare kultur.Först, använd en millimolar staurosporine i DMSO, För att förbereda 2,5 mikro-molars staurosporine i medium, enligt textprotokollet. Ta sedan bort odlingsmediet från cellerna. Tvätta cellerna med två milliliter PBS en gång, efter detta, tillsätt 10 milliliter av staurosporin mediet till MSF-7 celler i sex timmar, för att inducera apoptos, när cellerna är 70 procent sammanflöde.Därefter förbereder en millimolar paklitaxel i DMSO. Lägg sedan till 12,5 mikrolitter Sedan, tillsätt 12,5 mikro-liter av 1 millimolar paklitaxel till det färdiga mediet för T47D-cellerna för att göra upp en slutlig volym på 10 milliliter i ett 15 milliliter koniskt rör. Ta bort odlingsmediet från cellerna, och tvätta cellerna med 2 milliliter PBS.Lägg sedan till paklitaxelmedium till cellerna i 10 timmar för att inducera apoptos i 10 timmar för att inducera apoptos när cellerna når 70 procent konfluency. Efter detta, ta bort mediet från lösningsmedelsbehandlade MCF-7 grupp, och tvätta dem med två milliliter PBS. Sedan, tillsätt 10 milliliter av 0,25 procent DMSO medium Lägg sedan 10 milliliter 0,25 procent DMSO medium i sex timmar som lösningsmedel kontroll för staurosporine.Ta bort odlingsmediet från den lösningsmedelsbehandlade T47D-gruppen, och tvätta cellerna med två milliliter PBS. Sedan, tillsätt 10 milliliter av 0,05 procent DMSO medium Lägg sedan till 10 milliliter 0,05 procent DMSO medium i 10 timmar som lösningsmedelskontroll för paklitaxel. Därefter färga cellen och inkubera dem i 20 minuter vid 37 grader Celsius i en fem procent koldioxidinkubator.Använd ett 60 gånger konfokalt laserskanningsmikroskop för att observera de morfologiska förändringarna av de behandlade cellerna. Stain både apoptotiska inducerare och lösningsmedel-behandlade MCF-7 och T47D celler och lösningsmedel-behandlade MCF-7 och T47D celler i mörker i 30 minuter vid 37 grader Celsius i en fem procent koldioxid inkubator. Med hjälp av den fluorescensaktiverade cellsorteraren samlar du de positiva cellerna från de inducerbehandlade grupperna i runda bottenrör som innehåller en milliliter samlingsmedium.Sedan centrifugera rören som tidigare beskrivits, och kassera supernatanten. Samla de negativa cellerna från de lösningsmedelsbehandlade grupperna i rundbottna rör med en milliliter uppsamlingsmedium. Centrifugera rören, och kasta supernatanten.Efter detta, åter upphäva sorterade celler i färskt samlingsmedium. Utsäde cellerna i 12-väl vävnad kultur plattor, och odla dem i sju dagar för apoptos återföring. Skörda den omvända MCF-7 i både inducerare och lösningsmedelsbehandlade grupper med 0,05 procent trypsin-EDTA.med 0,05 procent trypsin-EDTA. Sedan, skörda T47D cellerna i båda inducerare Sedan, skörda T47D-cellerna i både inducerare och lösningsmedelsbehandlade grupper med 0,25 procent trypsin-EDTA. Fläck cellerna med fluorokrom-konjugerade monoklonala antikroppar mot mänskliga CD44 och CD24.Medan cellerna fläckar, förbereda isotype kontrollerna som tidigare visat. Slutligen kör cellerna på en flödescytometer, och upptäcka andelen celler med CD44 positiva, och CD24 negativa markörer. I detta protokoll, övergången från bröst icke-stamceller cancerceller till bröst CSC-liknande celler observerades.Isolering av icke-stamceller gjordes först i MCF-7 celler. Typiska morfologiska förändringar observerades efter att lägga apoptotiska inducerare, och cellerna återhämtat sig från apoptos med liknande morfologi efter drog tillbakadragande. De caspace-aktiverade cellerna var märkta och sorterade ut baserat på deras högre-fluorescens intensitet än celler utan caspace aktivering.Under apoptotiska induktionsprocessen användes lösningsmedel för att utesluta möjligheten att faktaförfarandet, eller själva lösningsmedlet, var orsaken till övergången. Caspace-aktiverade celler i apoptotiska-inducerare behandling grupperna konstaterades vara en nexin fem positiva och PI negativa, vilket tyder på att de var apoptotiska celler. De apoptotiska cellerna samlades in och odlade för återvinning, jämfört med de lösningsmedel-behandlade grupperna, flöde cytometrisk analys visade att det fanns celler som förekommer i CD44 positiva och CD24 negativa kvadrant i den omvända ursprungligen bröst icke-stamceller cellpopulationen.Munkavle är viktigt i flödesanalys och cellsortering, att tillräcklig kontroll bör förberedas i labben. Eftersom detta in vitro apoptos återföring förfarande isolerar ren apoptotiska cancerceller, experiment såsom in vivo tumorigenesis tillgångar kan genomföras för att förstå konsekvenserna av verkliga omvänd cellerna. Denna teknik belyser orsaken till cancer återfall, därför kan det undersökas för att potentiellt förhindra återförekomst hos cancerpatienter.Kom ihåg att skydda dig ordentligt när du utför cellodlingsexperiment enligt biosäkra-tier-bestämmelserna på din institution.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NFÎºB Activity and Breast Cancer Stem Cells Video (Video) | JoVE

Syntes och karakterisering av en Aspirin-fumarat Prodrug som hämmar NFkB aktivitet och bröstcancerstamceller

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish Video (Video) | JoVE

Invasiv Beteende av humana bröstcancerceller i embryonal zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60 Video (Video) | JoVE

Live-imaging av bröstcancer epitelial cellmigration efter övergående utarmning av TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Påvisande av mitokondrier membranet Potential att studera CLIC4 Knockdown-inducerad HN4 Cell apoptos In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell Cycle-specific Measurement of Î³H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Cell cykelns specifika mätningar av γH2AX och apoptos efter genotoxisk stress genom flödescytometri

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Erhålla Cancer Stem Cell Spheres från gynekologiska och bröstcancertumörer

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studera Triple negativ bröstcancer med ortopotopic bröstcancer modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...