Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

وأيد هذا العمل المركز ل Misfolding الأمراض (CMD). ويدعم القوات المسلحة اﻷنغولية بمنح "زمالة للبحث أقدم" من المجتمع، المملكة المتحدة مرض الزهايمر (منحة رقم 317، AS-سادس-16-003). وتم الحصول على سلالات C. ايليجانس من ايليجانس كاينورهابديتيس مركز الوراثية (كجك).

الكتاب يعلن أن هناك لا تضارب في المصالح.

بسبب التوسع السريع في تقنيات داخل ميدان العلوم البصرية، من الممكن الآن لمعالجة الحاجة إلى أساليب مؤتمتة في دراسات C. ايليجانس بطرق جديدة إلى حد كبير. كنتيجة لذلك، تم تصميم عدد الرقمية تتبع منصات20،،من4142،43،44،،من4546 وإتاحتها عبر السنوات القليلة الماضية من أجل استبدال العد اليدوي للمعلمات مثل سرعة الحركة، الانحناء التردد، ومعدل الشلل، فضلا عن أشكال أكثر تعقيداً من السلوكيات مثل يتحول أوميغا، وقياسات عمر. أحدث المنصات المؤتمتة تحسنت إلى حد كبير في إمكانية تكرار نتائج ودراسات41 حساسية ايليجانس جيم- وقدمت بيانات عالية الجودة في مجموعات صغيرة أو حتى كل من الحيوانات. قررنا تمديد التشغيل الآلي لتحليل سلوك دودة تجعل من الممكن تقييم تعمل الأفواج الآلاف من الحيوانات في نفس الوقت أيضا. والميزة الرئيسية للنهج المتبع في دراسة الأفواج دودة هو أنه يتيح للمحاسبة لتباين جوهري عالية دودة السلوك24 ولكون دراسات علاج المخدرات غالباً ما تؤدي إلى الاختلافات المظهرية خفية، من الصعب الكشف عن مع دلالة إحصائية كافية عند استخدام مجموعة صغيرة من الحيوانات. قوة عالية للكشف عن (جراب) في الواقع ضرورية للكشف عن أي اختلاف كبير في السلوك مع الثقة والحد من النتائج الإيجابية الكاذبة25.
وهنا، لقد قمنا بوصف سلسلة من البروتوكولات القائمة على أسلوب فرز الآلي المبلغ عنها مؤخرا C. ايليجانس، ديدان أسطوانية واسعة المجال لعرض تتبع منهاج (WF-NTP)36. البروتوكول هو موضح هنا ينقسم إلى 5 أجزاء. تصف الأجزاء 1 و 2 إعداد السكان الكبيرة دودة. الخطوات الحاسمة هي عقم ظروف العمل وإعداد الكواشف والصفائح اللازمة لتشغيل هذه التجارب. ونلاحظ أنه بسبب زيادة الإنتاجية المقدمة بموجب هذا البروتوكول مقارنة بغيرها فحص المنهجيات36، كما يتطلب كميات متزايدة من المواد الكاشفة؛ وهذا العامل يحتاج إلى النظر بعناية في التصميم التجريبي. ونلاحظ أيضا أن الخطوة تبيض أمر بالغ الأهمية، ويحتاج إلى اختبار مقدما كعدد كبير من البيض واليرقات صحية ضرورية لتشغيل هذه التجارب. الجزء 3 من هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تسليم المخدرات في دودة وسائط الإعلام والشاشة الصلبة السكان. ونلاحظ أن هذا الجزء من البروتوكول تعتمد اعتماداً شديدا على العدد من العقاقير والمخدرات تركيزات يمكن اختباره بواسطة المستخدم في نفس الوقت. أتمتة كاملة لإجراء الفحص والحصول على البيانات بسرعة التحول خطوة تحد من المراقبة السلوكية لإعداد كاشف والنمو والمزامنة من السكان دودة كبيرة. الخطوات الرئيسية أثناء فحص السلوكية هي أوقات التسجيل وأي دودة التعامل مع الخطوات (مثلاً، نقل الديدان من لوحات NGM إلى منصة التعقب). البروتوكول الموصوفة هنا مثال مصممة للشاشة الديدان لمدة 9 أيام خلال عمر الكبار؛ ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة الشاشة العديد من النقاط الزمنية حسب رغبة المستخدم، مثلاً، 18 يوما على التوالي36. ويوضح الجزء 4 ثم تطبيق البروتوكول على تسليم الجزيئات البروتينية (مثل الأجسام المضادة ومرافقين الجزيئية) إلى C. ايليجانس، ويظهر كيف البروتوكول يتضح في الأجزاء 1-3 يمكن تخصيصها بسهولة، حسب المطلوب التطبيق. علينا أن نظهر كيف يمكن تمديد هذا الإجراء ليس فقط لإيصال جزيئات شبيهة بالمخدرات ولكن أيضا لإدارة مرافقين أو الأجسام المضادة الجزيئية37. تنفذ الخطوات الأربعة الأولى (أجزاء) تحت ظروف معقمة، إلا إذا ذكر خلاف ذلك. يجب أن تكون كافة المكونات السائلة يعقم قبل الاستخدام وحضانة الخطوات التي ينبغي أن تجري في الرطوبة النسبية 70%. في الجزء 5، ونحن تصف كيفية استخدام حزمة البرامج المقدمة في تركيبة مع المرحلة التي تعقب. وكان هذا البرنامج مخصصة مصممة لتحليل البيانات WF NTP تتصل بسلوك السكان دودة كبيرة. ونحن نقترح أن المستخدم يتبع المبادئ التوجيهية الواردة في الباب 5 لتحليل البيانات؛ ومع ذلك، هذه المعلمات التي تعتمد على السمات المحددة لأشرطة الفيديو المسجلة (أي في الثانية، ومجال الرؤية، دقة الفيديو، عدد الإطارات المكتسبة). قد تم تصميم الدالة الأمثلة المقدمة في واجهة المستخدم الرسومية تسهيل تقييم المعلمات الصحيحة قبل التحليل.
هذه السلسلة من البروتوكولات تجعل من الممكن لتحليل تعمل لإعداد كبيرة من السكان من C. ايليجانس (حاليا ما يصل إلى 5,000 الديدان الفردية بالتوازي) فعالية، الحد من المصنوعات اليدوية بسبب تباين جوهري في سلوك الحيوانات ، باﻻتفاق مع دراسات تمهيدية بشأن قوة الكشف ضروريا لتحقيق الدلالة الإحصائية للدراسات ايليجانس جيم-25. ويستخدم المنصة نظام الكاميرات ذات الدقة العالية، قادرة على تسجيل الصور لإعداد كبيرة من الحيوانات بسرعة عالية، أثناء تسجيل أفواج كبيرة متعددة في وقت واحد. عالية الأداء والإنتاجية العالية لبروتوكول WF NTP يجعل من الممكن تحديد تغييرات صغيرة جداً في سلوك دودة بطريقة دقيقة جداً. ولذلك، تمكن هذه المنهجية النهج الجديدة التي سينظر فيها لدراسة بيولوجيا C. ايليجانس، بل بالإضافة إلى ذلك للبحوث الطبية والدوائية، مثل الفرز الفائق من التعديلات الوراثية والمخدرات العلاجات. ويمتاز هذا الإجراء أيضا السماح للدراسات الشلل يجب القيام بها بالتوازي مع قياسات سلوكية أخرى، سمة رئيسية في دراسات الفحص الجزيئي.
النتائج التي تحققت حتى الآن في برامج اكتشاف المخدرات الإعلانية15،،من3435 و PD18 تبرهن على أهمية اكتساب واسعة المجال لعرض البيانات في زيادة كبيرة عدد الحيوانات التي يمكن رصدها في تجربة واحدة، إلى حد كبير وبالتالي تقليل الأخطاء التجريبية وإلى حد كبير تحسين صحة الدراسات الإحصائية. بينما ركز النهج الحالية المبينة في هذا البروتوكول على التصدي للتحديات في مجال اكتشاف الأدوية، ونأمل أن المنهجية التي ستعتمد على نطاق واسع في المجتمع، وأن تطبيقه سوف تمتد إلى المجمع الوراثي و الدراسات السلوكية وتوسيع عدد تعمل حاليا لإزالتها.

حوالي نصف قرن، قدم سيدني برينر ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كنظام نموذجي لدراسة التنمية وعلم الأعصاب، كهذا صغير (1 مم في الطول)، الدودة السلكية شفافة من السهل التلاعب وراثيا والاستمرار في مختبر1. اليوم، يتم استخدام C. ايليجانس لدراسة طائفة واسعة من العمليات البيولوجية بما في ذلك المبرمج، مما يشير إلى خلية، وطبيعة دورة الخلية، تنظيم الجينات، والايض، والشيخوخة2. وعلاوة على ذلك، تعقد الخلايا والأنسجة، أنماط التعبير البروتين والمحافظة على مسارات المرض بين C. ايليجانس والكائنات أعلى (80% جينات الفيروس المتنقل قد أورثولوجوي بشرية)، ترتبط بالبساطة و الفعالية من حيث التكلفة لزراعة وجعله كائن نموذج فعال في فيفو قابلة للفائق الوراثية3،،من45،، ،من67 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 والمخدرات عروض14،،من1516 . ولجميع هذه الأسباب، C. ايليجانس قد استخدمت لتوصيف المسارات الجزيئية العادية وذات الصلة بالمرض؛ في ميدان نيوروديجينيريشن، على سبيل المثال، قد مكن استكشاف آثار الشيخوخة على البروتين تجميع3،،من47،،من1517، 18، والتوصيف للمروجين ومثبطات البروتين تجميع3،،من45،،من67،14، 18.
اللياقة البدنية عموما من الديدان، ومعلمة سلوكية هامة لتعريف بهذا النوع من الدراسة، يمكن أن تقاس يدوياً في مجموعة متنوعة من الطرق، كما هو الحال بإحصاء عدد الانحناءات الهيئة الواحدة والدقيقة (BPM)4،6، 19، أو عن طريق قياس سرعة حركة20،،من21إلى22، وكذلك عن طريق قياس معدلات الشلل ومتوسط عمر. على الرغم من أن القياسات اليدوية من الانحناءات الجسم وسرعة الحركة وأدت إلى العديد من الأفكار الهامة في مجموعة متنوعة من المسارات الجزيئية والآليات3،4،،من1419، 20،23، الاختبارات اليدوي تظل منخفضة الإنتاجية حاليا وتتطلب عمالة مكثفة جداً وتستغرق وقتاً طويلاً حين يجري عرضه للأخطاء والتحيزات البشرية. هذه المسائل تحديات كبيرة في جمع البيانات مع قوة إحصائية كافية للتمييز بين التغيرات السلوكية خفية. هذا القيد ذات الصلة لا سيما للمخدرات الفحص كعلاجات مع المخدرات المحتملين الجزيئات التي غالباً ما تؤدي إلى التغيرات المظهرية الصغيرة24، ولذلك تتطلب دراسة عدد كبير من الحيوانات من أجل الحصول على النتائج استنساخه. ولتوضيح هذه النقطة، وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن قوة عالية للكشف عن (جراب) أمر ضروري لتحديد أية تغييرات هامة بالثقة في السلوك والحد من النتائج الإيجابية الكاذبة25. وقد أسفر هذا حافزا قويا في المجتمع C. ايليجانس ليحل محل العد اليدوي مع قياسات استنساخه، الآلي، وقت--وفعالة من حيث التكلفة. ولتلبية هذا الطلب، وضعت عدة مختبرات مؤخرا إلى أساليب لقياسات عالية الحساسية وتتبع دودة دقيقة لعدد أكبر من الديدان22،،من2627،28 ،،من2930،31،،من3233.
من أجل زيادة توسيع عملية التشغيل الآلي لافواج كبيرة من الحيوانات اللازمة لقياسات يعتد به إحصائيا، وقد وضعنا مؤخرا ديدان أسطوانية واسعة المجال لعرض تتبع منهاج (WF-NTP)15،34 ،،من3536، الذي يتيح التحقيق متزامنة متعددة قراءات المظهرية على السكان دودة كبيرة جداً، وعاملا رئيسيا في الكشف عن الشكلية إحصائيا ذات الصلة25. WF-NTP حاليا مراقبة الحيوانات تصل إلى 5,000 جنبا إلى جنب، بل قراءات المظهرية أيضا تضمين معلمات متعددة، بما في ذلك معدل والسعة الانحناءات الجسم، وسرعة الحركة، وجزء صغير من السكان التي هي بالشلل، حجم الحيوانات. ولذلك من الممكن سهولة الشاشة آلاف من الديدان بالتوازي، والجمع بين قراءات مختلفة في خارطة سلوكية لخلق بصمات الأصابع متعددة الأبعاد36. البرمجيات المفتوحة المصدر المرتبطة بها هو مكتوب في بيثون، مطلوب أيضا لتشغيله، وهو تماما للتخصيص. كما تتوفر واجهة مستخدم رسومية (GUI) لتمكين المستخدمين من اعتماد هذه التكنولوجيا.
وهنا، نقدم سلسلة من البروتوكولات التي توضح بعض التطبيقات المحتملة ل WF-معاهدة عدم الانتشار. على وجه الخصوص، نحن مناقشة إدارة المركبات، بدءاً من الجزيئات الصغيرة للمداواة البروتين، وتصف كيفية فحص آثارها مباشرة عبر عدد كبير من السكان من الديدان، وبالتالي فعالية إزالة الحاجة إلى أخذ عينة صغيرة السكان الفرعية. استخدام WF-معاهدة عدم الانتشار لهذا غرض قد حققت بالفعل مزايا كبيرة في إجراءات تهدف إلى تصميم برامج اكتشاف المخدرات مرض الزهايمر (AD)15،،من3435 ومرض باركنسون (PD)18 باستخدام البيانات الحية في تقييم المرشحين العلاجية35،37.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

ايليجانس كاينورهابديتيس نموذج حيوان راسخة في مجال البحوث الطبية الحيوية، تستخدم على نطاق واسع في دراسات الشيخوخة وعلم الجينوم الوظيفي. لتقييم الصحة واللياقة البدنية من الحيوانات تحت الدراسة، واحد يعتمد عادة على قراءات حركية، مثل قياس عدد الانحناءات الجسم أو سرعة الحركة. وعادة ما تنطوي هذه القياسات العد اليدوي، مما يجعل صعوبة في الحصول على دلالة إحصائية جيدة، كالوقت والعمل القيود غالباً ما تحد من عدد الحيوانات في كل تجربة إلى 25 أو أقل. منذ عالية القدرة الإحصائية اللازمة الحصول على النتائج استنساخه والحد من النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة عند التحقيق في تأثيرات المظهرية ضعيفة، بذلت جهود مؤخرا وضع بروتوكولات الآلي التي ركزت على زيادة حساسية للكشف عن حركية والتنميط السلوكي متعدد حدودي. بغية تمديد المهلة للكشف إلى المستوى اللازم لالتقاط التغييرات المظهرية الصغيرة التي غالباً ما تكون حاسمة في الدراسات الوراثية واكتشاف الأدوية، يصف لنا هنا تنمية تكنولوجية التي تمكن من دراسة الحيوانات الفردية يصل إلى 5,000 في نفس الوقت، زيادة القوة الإحصائية للقياسات بحوالي 1,000-fold مقارنة مع الاختبارات اليدوية وحوالي معززات مقارنة بالأساليب الأخرى الآلي المتاحة.

سهولة التشغيل والتحليل مولتيباراميتريك، وإنتاجية عالية من بروتوكول WF NTP المصور (الأرقام 1 و 2) يجعل من الممكن تحديد تغييرات صغيرة جداً في سلوك دودة بطريقة دقيقة جداً. يستند منهاج التصوير ميكانيكا البصريات مصنوعة خصيصا، وأنه يمكن تجميعها باستخدام كاميرا أحادية اللون 6 MP جنبا إلى جنب مع البعد البؤري 16 مم عدسة عالية الدقة لأجهزة الاستشعار 1 ''، ومضيئة مع 8 '' 8 '' بيضاء الخلفية (انظر الجدول للمواد وأيضا الإشارة إلى36 للحصول على تفاصيل إضافية). هو مكتوب في بيثون البرمجيات WF NTP المرتبطة بها ووضعت لتشغيله على أنظمة تشغيل ويندوز. يتم تشغيله على جهاز كمبيوتر مجمع مخصص مع ثماني النواة 3.00 جيجاهرتز و 64 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM). كما كان تصميم البرنامج باراليليزي العمل وتحليل أشرطة الفيديو التي تستند إلى RAM ووحدة المعالجة المركزية للكمبيوتر; أي,، آلة ذات صلاحية حساب انخفاض سيؤدي إلى تشغيل أقل من أشرطة الفيديو في نفس الوقت. الإعداد ونستخدم حاليا هو الأمثل لتشغيل إلى ca. 16 أشرطة الفيديو في نفس الوقت ويمكن إكمال تحليل أشرطة الفيديو 100 ca. بين عشية وضحاها. وعلاوة على ذلك، يسمح ارتفاع مستوى التفاصيل المقدمة في واجهة المستخدم الرسومية من WF-NTP التخصيص سيطرة كبيرة على نوعية تحليل التصوير. ويمكن استخدام واجهة المستخدم الرسومية لمباشرة تحميل قواعد البيانات الكبيرة في أشرطة الفيديو موازية أو الفردية؛ يمكن أيضا تحديد أطر محددة لتحليل مفصل الفرعية، جنبا إلى جنب مع عامل تحويل بكسل، التي يمكن استخدامها لتقدير المقاييس السلوكية. ويمكن اختيار إحدى خوارزميات مختلفة تتبع اثنين (تبقى ميتة وتحويل Z) اعتماداً على أم لا يود المستخدم أن تنظر الحيوانات مشلولا في التحليل. يمكن أن تكون المعلمة العتبة جودة ضبطها تبعاً لذلك مع الفيديو والتجريبية. افتتاح واختتام معلمات تسمح للمستخدم بإزالة الضجيج، وكذلك تنفيذ وظائف مستوى العتبة. خوارزمية سكيليتونيزينج يوفر طريقة بديلة للتحليل. كائن حجم انقطاع (تصفية) يوفر عامل تصفية إضافية للضوضاء الخلفية والمعلمة مثل دودة يسمح للمستخدم بالنظر في الكائنات فقط الديدان بشكل بيضاوي، وبالتالي التمييز بين الكائنات الأخرى التي قد يكون لها نفس حجم بكسل الديدان. بعد هذه العمليات العتبة، يمكن تحديد جميع المناطق توسم الناتجة كالديدان الفردية ومواقف تلك المناطق ثم المخزنة لكل إطار للتحليل اللاحق والتعقب. الانحراف لكل دودة المتعقبة يستخدم لتقدير المقاييس دودة مثل مدى دودة الانحناء (BPM) كدالة للزمن. المستخدمين مسموح أيضا لتحديد عدد الإطارات المستخدمة للحفاظ على دودة في الذاكرة للبرنامج أثر الاصطدام، وعدد وحدات البكسل التي يمكن نقل الفيروس المتنقل بين الإطارات يمكن ضبطها أيضا للتمييز بين الحيوانات من الضوضاء. الخيار طول المسار الحد الأدنى يسمح للمستخدم للتخلص من الديدان التي قد تم تعقبها لإطارات قليلة فقط. البارامترات الرئيسية الأخرى، مثل المنعطفات والسرعة، تسمح للمستخدم بتحديد درجة الانحناء اللازمة تحسب كمنحنى جسم وعدد الإطارات التي تعتبر أن هناك حاجة إليها لتقدير سرعة الحيوانات. معلمات وقف إنتاج المواد الانشطارية يمكن ضبطها كذلك إدراج الحيوانات مشلولة. يظهر الإخراج تلقائياً في ملفات النتيجة. وتعتبر هذه القيم كالحدود العليا للتقييم لجزء صغير الحيوانات مشلولة. يمكن للمستخدم أيضا تحديد منطقة واحدة أو أكثر من الفائدة. هذه الميزة مفيدة بشكل خاص لتحليل الفئات السكانية الفرعية الديدان، ويتم فرز الإخراج تلقائياً في ملفات النتائج. خيار الإخراج يسمح للمستخدم بتحديد مجلد الإخراج وعدد الإطارات التي سيتم إنتاجها لأنها تتبع. يمكن أيضا استخدام مختلف أداة مجموعات لمزيد من التحليل البيانات، مثل الخرائط أداة مسار الأرض يوضح دودة كل المسارات وأداة أخذ البصمات التي تسمح للمستخدم لخلق بصمات الأصابع.
هذه المنهجية بتمكين النهج الجديد الذي سيعتمد، ليس فقط للدراسات البيولوجية من C. ايليجانس ، بل أيضا لأغراض البحوث الطبية والدوائية، مثل الفرز الفائق من التعديلات الوراثية والعلاج بالعقاقير. ونحن قد بينت هذه الإمكانات بوصف توصيف تعمل للدراسات السكانية الكبيرة (N > 1000) لمختلف نماذج دودة الأعصاب مرض الخرف (FTD) (frontotemporal39، مرض باركنسون (PD)7 ، مرض الزهايمر (AD)16،40، والتصلب العضلي الجانبي (المرض)19 (الشكل 3 ألف)، ووصف آثار جزيئات العلاجية المحتملة باستخدام نماذج دودة PD18 وإعلان 15،12 (الشكل 3b). اثنين من الجزيئات الصغيرة، سكوالاميني18 وبيكساروتيني15، كانت تدار بتركيزات تصل إلى 25 ميكرون إلى PD (الشكل 3b) و 10 ميكرون للإعلان38 (الشكل 3b) والديدان، على التوالي. وأظهر كل من المركبات واضحة آثار الجرعة تعتمد على أكثر من التركيزات اختبارها. وقد أظهرنا أن هذه الدقة العالية للقياسات هو يتحقق من خلال زيادة عدد الديدان التي يمكن تحليلها بالمقارنة بالطرق التقليدية (الشكل 3 ج). ونحن تبين أهمية حجم العينة (الشكل 3 جيم) في الفحص الجزيئي، وكذلك كما هو الحال في توصيف سلالات متحولة. الزيادة في درجة الحرارة من 20 درجة مئوية يؤدي إلى ما يقرب من نصف من الديدان الإعلانية أصبحت مشلولة بعد 3 أيام من بلوغه سن الرشد. تم فحص السكان دودة تحت ظروف مختلفة، مثل، عندما كانت تتعرض لتغيرات درجة حرارة خفية (الشكل 3 جيم، غادر (AD الديدان) الديدان الإفراط معربا عن شكل 42-بقايا الببتيد اميلويد بيتا (Aβ1-42) لوحة)، عندما أعرب Aβ1-42 في جميع الخلايا العصبية (الشكل 3 جيم، الفريق المركزي)، أو عندما تتعرض الديدان الإعلانية بيكساروتيني (الشكل 3 جيم، اللوحة اليمنى). كما جرى تحليل الديدان من رويس صغيرة تم اختيارها عشوائياً من مجال الرؤية الكاملة لأشرطة الفيديو المكتسبة مع WF-معاهدة عدم الانتشار (N < 50، الأصفر أشرطة) تسليط الضوء على المقارنة بين حركية هذه الديدان مع حركية متوسط السكان دودة كاملة (N < 1,000). في جميع اللوحات، الفرق تقاس على العموم دودة السكان يبدو أن يعتد به إحصائيا مع p ≤ 0.0001 (*).
يسمح بروتوكول WF NTP الموصوفة هنا أيضا التسجيل المتزامن لمعلمات متعددة (الشكل 1b) لدعم، على الوجه أمثل، التحقق من الصحة الداخلية ووضع بصمة شاملة لمجموعة واسعة من الظروف بالنسبة إلى مراقبة عينة، مما يتيح إجراء مقارنات مفيدة عبر دراسات متعددة. ويشمل هذا النهج متعدد حدودي تحليل السمات السلوكية المتعددة، بما في ذلك الانحناء التردد والسرعة ومعدل الشلل، الحجم، السعة ينحني وبيند تشريد36المتزامنة. وهذا يسمح لآلاف حيوانات التي يتعين رصدها بقدر كبير من التفصيل، وفي حساسية عالية جداً ودلالة إحصائية ويوفر فرصاً للدراسات إعداد كبيرة من السكان. ويمتاز هذا الإجراء تتبع أيضا السماح للدراسات الشلل يجب القيام بها بالتوازي مع قياسات سلوكية أخرى، سمة رئيسية في دراسات الفحص الجزيئي.
النتائج التي تحققت حتى الآن في إعلان15،،من3435 واكتشاف الأدوية18 PD تبرهن على أهمية اكتساب واسعة المجال لعرض البيانات زيادة كبيرة في عدد الحيوانات التي يمكن أن تكون رصد في تجربة واحدة، إلى حد كبير تقليل الأخطاء التجريبية وإلى حد كبير تحسين صحة الدراسات الإحصائية. وبناء على هذه النتائج، ونحن نتوقع أن بروتوكول WF NTP، الذي نحن متاحة ل المجتمع36، سوف تمتد بشكل كبير استخدام C. ايليجانس.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg"> رقم 1: خطوات تحليل WF NTP ومثال لبصمات الأصابع. () 1. الفيديو الأصلي. 2-خلفية الصورة. 3-خلفية طرح الصورة. 4-6-خطوات العتبة. 7-9-وضع العلامات واحدة من الديدان. (ب) تعمل متعددة ترد مع بصمات الأصابع للديدان البرية من نوع ودوده نماذج PD والإعلانية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg"> رقم 2: واجهة المستخدم الرسومية (GUI) من WF-NTP. يمكن تحديد ملفات الفيديو المحددة والإطارات المحددة في واجهة المستخدم الرسومية للتحليل، ويمكن إدراج عامل تحويل بكسل، بعدها يجري التحليل مع إحدى خوارزميات معينة تتبع اثنين. فمن الممكن لتحديد درجة الانحناء اللازمة للاعتماد كمنحنى جسم، فضلا عن العدد من الإطارات اللازمة لتقدير سرعة الحيوانات. هيئة الانحناءات ويمكن تحديد عتبات سرعة الإحصاءات دودة مشلولة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg"> رقم 3: أمثلة لتطبيقات تم تمكينها بواسطة الأسلوب WF NTP. () تطبيق WF NTP في الدراسات السكانية الكبيرة (N > 1,000) القياسات BPM لنماذج C. ايليجانس طائفة من أمراض الأعصاب بما في ذلك FTD، PD، الإعلانية، والمرض. (ب) تطبيق WF NTP في اكتشاف الأدوية. (ج) أهمية الدراسات السكانية في درجة الحرارة حساسية وفعالية العقاقير وتوصيف سلالة متحولة. تعمل للفئات السكانية الفرعية N < 50 (أشرطة صفراء) مقارنة مع أولئك السكان دودة كاملة (N < 1,000). أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

الآلي التحليل السلوكي لكبير C. ايليجانس السكان استخدام واسعة مجال-من-عرض "تتبع النظام الأساسي"

يصف لنا البروتوكولات لاستخدام منصة واسعة المجال لعرض تتبع السلكية (WF-NTP)، الذي يتيح لتوصيف عدد كبير من السكان من ايليجانس كاينورهابديتيسالمظهرية الفائق. يمكن استخدام هذه البروتوكولات لوصف التغييرات السلوكية خفية في سلالات متحولة أو استجابة للعلاج الدوائي بصورة تدرجية عالية.

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في عملية اكتشاف المخدرات حول كيفية سلوك دواء معين في كائن حي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح لأحجام العينة الكبيرة ليتم فحصها بسرعة وكفاءة. ولهذه التقنية بالفعل تأثير كبير في اكتشاف المخدرات من خلال التمكين من إجراء تقييم شديد الحساسية لآثار المرشحين للمخدرات.هذه الطريقة توفر رؤى ميكانيكية جديدة في بداية وتطور الأمراض الخاطئة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضا على أنظمة أخرى، مثل الشيخوخة والفحوصات الجينية. نحن متحمسون جدا من قبل هذه الفرصة لإدخال أساليب مادية جديدة في الفضاء من اكتشاف المخدرات.هذه demonstartions من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما تتطلب خطوات الفرز على دراية عالية مع هذه التقنية التلقائية نوفو. (سيثبت الإجراء أن يكون (سام كاسفورد مساعد بحث من مختبرنا قبل البدء في الإجراء ، أضف 2.2 ملليلتر من كل مركب دوائية عند التركيز المناسب إلى ستة ألواح 5-fluorodeoxyuridine أو FUDR لكل سلالة دودة ، عن طريق نشر المركب بعناية على سطح اللوحة بالكامل ، وتجفيف اللوحات تحت ظروف معقمة.في حين أن الصفائح هي التجفيف، واستخدام 15 ملليلتر من M9 العازلة لغسل الديدان من خمسة لوحات عامل نمو النعمة الخيطية الغنية، ونقل الديدان المحررة في أنبوب مخروطي للطرد المركزي. إعادة تعليق الديدان الخيطية في ثلاثة ملليلترات من M9 العازلة الطازجة للحصول على كمية من عدد الديدان في مرحلة اليرقات L4، وبذور 700 L4 اليرقات على كل من لوحات FUDR الجافة الستة لكل سلالة دودة، لكل مركب. عندما تم زرع جميع الديدان الخيطية ، ضع الصفائح التي تحتوي على السلالات التي يتم حثها على التحلل عن طريق رفع درجة الحرارة عند 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.في اليوم التالي، قم بتشغيل أضواء المسرح لتعقب الدودة الموازية، وتنظيف المرحلة الزجاجية للمتعقب بنسبة 70 في المائة من الإيثانول. إذا لم يبقى بقايا مرئية، قم بإزالة غطاء العدسة واستخدم منفضة الهواء لتنظيف عدسة التصوير. تأكد من أن الكاميرا موصولة بشكل صحيح ومثبتة، ثم ابدأ التسجيل باستخدام برنامج التقاط الصور.اضبط إعدادات الكاميرا لتسجيل 20 إطارًا في الثانية، مع معلمات التسجيل الأحادية 16 المناسبة. استخدام فارغة، تسعة سنتيمتر بتري طبق لضمان أن يتم تعيين المرحلة إلى الارتفاع الصحيح، وضبط المرحلة إذا لزم الأمر. في ظل ظروف معقمة، إضافة ثلاثة ملليلترات من M9 حل ل لوحة فحص حركية، واستخدام مليلترين من M9 حل لغسل ثلث مساحة سطح اثنين من لوحات FUDR تحميل الديدان الخيطية من نفس المجموعة التجريبية في لوحة الفحص.ثم ضع لوحة الفحص على مرحلة المقتفي. استخدام دودة واحدة لتركيز الكاميرا، والبدء في تسجيل الحيوانات. عند اكتمال التسجيل، تجاهل لوحة الحركة، ووضع علامة على لوحات FUDR على أنها تستخدم مرة واحدة قبل إعادتها إلى الحاضنة.لتحليل بيانات الفيديو، افتح واجهة مستخدم المستخدم الرسومية لبرنامج تحليل بيانات تعقب الفيروسات المتنقلة المتوازية، واستخدم وظيفة التصفح لتحميل الفيديو الذي يهمك. حدد مجلد وجهة إخراج وتأكد من تعيين إطارات 600 إلى 1200 لتحليل 30 ثانية. إدراج 0.029 بكسل إلى ملليمتر عامل التحويل لتصوير طبق بتري تسعة سنتيمترات في القرار الكامل، وحدد الحفاظ على الميت تتبع algorithhm.ضمن علامة التبويب معلمات تحديد موقع تعيين الصور استخدام Z إلى 100، حشوة Z إلى 3، بكسل القياسية إلى 54، العتبة إلى 9، الفتح إلى 1، وإغلاق إلى 2. ضبط معلمات التصفية إلى الحد أدنى حجم 20، الحد الأقصى لحجم 180، ودودة مثل 0.94. تعيين معلمات مسارات التشكيل إلى مسافة قصوى تحرك 10، وطول الحد الأدنى 150، وذاكرة 10.تعيين المعلمات الانحناءات والسرعة إلى عتبة ثني من 1.8، والحد الأدنى من الانحناءات 0، وإطارات لتقدير سرعة 150. ضبط إحصاءات الدودة الميتة إلى فوز maxmim في الدقيقة الواحدة من 5 ، وسرعة قصوى من 1. حدد مجلد الإخراج، وحدد عدد إطارات الإخراج إلى 50، وحجم الخط إلى 10.استخدم الدالة المثال لاختبار المعلمات وإخراج الصور عينة للتحقق ما إذا كان الفيروس المتنقل مرئية خلال خطوات العتبة ثمانية. ثم قم ببدء تشغيل وظيفة "Job" ، وقم بدمج النتائج الفردية لمجموعة البيانات بأكملها لتحليل ملفات نتائج الاختبار ، وحفظ النتائج عبر التصدير إلى وظيفة TSV. هذه الطريقة تسمح توصيف أنواع الفينو دياتودا لدراسات سكانية كبيرة من نماذج دودة مختلفة من الأمراض العصبية، مثل الخرف الجبهي الصدغي، مرض باركنسون، مرض الزهايمر، والتصلب الجانبي الضموري.فضلا عن توصيف آثار الجزيئات العلاجية المحتملة، وذلك باستخدام نماذج دودة من مرض باركنسون ومرض الزهايمر. ويتم تحقيق دقة عالية من هذه القياسات عن طريق زيادة عدد الديدان التي يمكن تحليلها مقارنة بالطرق التقليدية. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل الوقت بين إضافة الديدان إلى الحركة وبداية التتبع.بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى لتكملة النتائج وربطها بتجميع البروتين. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض العصبية والتنكسية ، مثل باركنسون والزهايمر ، لاستكشاف تطبيقات الاكتشاف الصحيح. لا تنس أن العمل مع FUDR يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء قفازات النتريل، دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

نهج مؤتمتة شبه لإعداد الجسم المضاد الكوكتيلات لتحليل Immunophenotypic في الدم المحيطي الإنسان

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

متعدد سيتوكين التنميط من سبلينوسيتيس الماوس حفز استخدام منصة المستندة إلى حبة سيتوميتريك المناعة

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

جمع وتجهيز العقد الليمفاوية من الحيوانات الكبيرة لتحليل الحمض النووي الريبي: التحضير للدراسات ترانسكريبتوميك العقدة الليمفاوية للأنواع الحيوانية الكبيرة

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...