Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af centret for misfoldning sygdomme (CMD). FAA er understøttet af en Senior Research Fellowship award fra Alzheimers Society, UK (Grant antallet 317, AS-SF-16-003). C. elegans stammer blev fremstillet af Caenorhabditis elegans genetiske Centre (CGC).

1. forberedelse af materialer til C. elegans protokoller
<ol><li>
For at forberede en 10 x M9 stødpudeopløsning, tilsæt 30 g af monobasic kalium fosfat, 60 g af dibasiske natrium fosfat og 50 g natriumchlorid til en 1 L autoklaverbart flaske.
	<ol>
<li>Tilføj 1 L, renset vand og autoklave på ca. 121 ° C i 15 min.</li>
		<li>Fortyndet 10 gange i renset vand og autoklave på ca. 121 ° C i 15 min.</li>
		<li>Når afkølet, tilsættes 1 mL af opløsning af 1 M magnesiumsulfat. Bemærk: Kun 1 x M9 (M9) bør anvendes for orm behandling i følgende trin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
For at forberede ødelægge vækstmediet (Rich-NGM), mix 2,7 g natriumchlorid, 15.75 g agar, 5,75 g af kasein, 900 mL renset vand og autoklaver ved 121 ° C i 15 min.
	<ol>
<li>Overføre Rich-NGM medium til en opvarmning ovn (ca. 70 ° C), hvis den ikke anvendes straks; Rich-NGM kan opbevares til smeltet ved ca. 70 ° C i op til 12 timer før han bliver ubrugelig.</li>
		<li>Til Rich-NGM blandes, tilsæt 900 µL af en opløsning af 1 M calciumchlorid, 900 µL af en opløsning af 1 M magnesiumsulfat og 900 µL af en opløsning med 5 mg/mL kolesterol i absolut ethanol. Bemærk: Kolesterol kræver ikke autoklavering før brug.</li>
		<li>For at forberede de eksperimentelle plader, der opretholder en synkron befolkning, tilføje 92 µL af 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) på 812 µM til 900 mL af Rich-NGM. Bemærk: FUDR er både giftige og kræftfremkaldende, så det er vigtigt at bære nitrilhandsker ud over lab frakker og sikkerhedsbriller. Tillad ikke affald, angive generelle affald stream og bortskaffes ved forbrænding med en efterbrænder.</li>
		<li>Hæld 20 mL af den autoklaveres Rich-NGM i en 9 cm steril petriskål til at generere en vækst plade (Rich-NGM plade). Hæld 15 mL af den autoklaveres Rich-NGM i en 9 cm steril petriskål til at gøre en motilitet plade (Mot plade). Hæld 20 mL af Rich-NGM med FUDR i en 9 cm steril petriskål til at generere en FUDR plade. Bemærk: Lav agar volumen af Mot plade letter kameraet fokus og ormen sporing (Se trin 3.2.5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Forberede OP50 Escherichia coli -stamme, ved autoklavering 1 L LB bouillon ved 121 ° C i 15 min og podes med starteren kultur når afkølet.
	<ol>
<li>Tillad bakteriekulturen til at vokse natten over ved 37 ° C og sterilisere røret bruges til centrifugering.</li>
		<li>Overføre bakterier til sterile rør og centrifugeres ved 4.600 x g i 15 min.</li>
		<li>Den dekanteres, og ved hjælp af sterilt vand, suspendere i 10% af den originale lydstyrke til at oprette 10 x (10 gange koncentreret) OP50 lager.</li>
		<li>15 mL af 10 x OP50 bestanden at 150 mL til at generere 1 fortyndes x OP50, ved hjælp af sterilt vand, inden det anvendes til frø rig-NGM plader. Brug de resterende 10 x løsning til seed FUDR plader. Bemærk: Mot plader forbliver unseeded og bruges kun i trinnet billede erhvervelse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
At frø plader med bakterier, adskille Rich-NGM og FUDR plader.
	<ol>
<li>Under sterile betingelser, tilføje 350 µL 1 x OP50 til Rich-NGM plader og jævnt fordelt. Bemærk: Ikke spredes til kanten af pladen som orme vil kravle op sider af pladen og dø</li>
		<li>Under sterile betingelser, tilføje 350 µL af 10 x OP50 til FUDR plader og jævnt fordelt.</li>
		<li>Tillad plader til tørre og inkuberes ved 20 ° C i 2 d før brug.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. forberedelse af C. elegans til brug med Windows Firewall-NTP
<ol><li>Vedligeholde C. elegans på Rich-NGM plader eller ved at overføre en lille mængde af agar indeholdende orme med forsiden nedad på en frisk bakteriel lag. Vedligeholde C. elegans stammer på denne måde før indlede de eksperimentelle protokoller.</li>
	<li>Ved hjælp af den overdragende teknik (Se trin 2.1), frø 20 plader af hver stamme med velnærede, blandede fase orme og tillade dem at vokse for 2 d ved 20 ° C.</li>
	<li>Vaske 5 plader der indeholder orme med 15 mL M9 og pool i en 15 mL tube. Gentag for alle 20 plader af hver stamme.</li>
	<li>Centrifugeres orme på 2.000 x g for 2 min og Fjern supernatanten suspendere i 2 mL af M9 løsning.</li>
	<li>Forberede 10 mL af blegning løsning ved at blande 13% natriumhypochlorit og 4 M natriumhydroxid i forholdet 3:2 vol./vol. Bemærk: Denne løsning kræver ikke autoklavering. Både komponenter og den deraf følgende løsning er ætsende og skal håndteres med omhu ved hjælp af nitrilhandsker. Natriumhydroxid er mildt ætsende glas og bør opbevares i plastic containere.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL af blegning løsning til hver centrifugeglas og omrystes kraftigt i ca 3,5 min. eller indtil neglebånd er helt opløst.</li>
	<li>Under sterile forhold, Fortynd prøver at 15 mL M9 og centrifugeres ved 2.000 x g for 2 min. Fjern supernatanten og suspendere i 15 mL af M9 løsning.</li>
	<li>Gentag trin 2,7 6 gange, indtil kun ormen æg forblive, og løsningen ikke længere har en lugt af klor.</li>
	<li>Centrifugeres prøver på 2.000 x g for 2 min og Fjern supernatanten suspendere i 2 mL af M9 løsning.</li>
	<li>Under sterile forhold, skal du bruge et sterilt glas afpipetteres 2 mL af M9 indeholdende æg overføres til hver brønd med en 12-godt vævskultur plade og inkuberes ved 20 ° C i mindst 16 h. Bemærk: Bruge separate plader for hver stamme for at undgå krydskontaminering. Det indskydende trin fra centrifugeglas til multi wells bidrager til at undgå orm kvælning.</li>
	<li>Overføre ormene udklækket natten af 12-godt plader til 15 mL centrifugeglas. Tage 3 dråber 5 µL af ormen løsning og tælle antallet af orm til stede på første larve stadie (L1).</li>
	<li>Beregne antallet af orme pr. µL af løsning.</li>
	<li>Frø L1 orme på Rich-NGM plader på 3.000 orme pr. plade og tillade dem at vokse i 2 dage ved 20 ° C, indtil de når sidste larve fase (L4) fase.</li>
</ol>3. generelle WF-NTP-protokollen
<ol><li>
Tilføje 2,2 mL af hver enkelt drug sammensatte i den passende koncentration (som 25 eller 10 mM for narkotika lignende squalamine18 og bexarotene15, henholdsvis) til 6 FUDR plader og lad det tørre under sterile forhold for hver ønskede orm stamme. Bemærk: Dette skridt gentages for hvert stof under undersøgelsen, for hver koncentration og hvert opløsningsmiddel anvendes.<ol>
<li>Vaske orme ud 5 rige-NGM plader forberedt på trin 2.13 bruges 15 mL af M9 bufferen og overføre orme til et centrifugeglas.</li>
		<li>Der centrifugeres ved 2.000 x g for 2 min og Fjern supernatanten suspendere i 3 mL af M9. Tage 3 dråber 5 µL af M9 løsning indeholdende orme og tælle antallet af orm til stede på den sidste larve stadie L4.</li>
		<li>Beregne antallet af orme pr. µL af M9 buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Frø 700 L4 larver på 6 af de tørre FUDR plader der indeholder et bestemt stof, Gentag for hver koncentration af hver sammensatte og lad det tørre under sterile forhold.
	<ol>
<li>Inkuber orme på 24 ° C fra L4 for disse stammer hvor orm lammelse er induceret kun ved at hæve temperaturen, som AD stamme38. Tælle dagen efter L4 larver scenen som D0 i voksenalderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tænde scenelys for sporingen.
	<ol>
<li>Rene glas scenen med 70% ethanol og sikre, at ingen synlige rester rester, derefter fjerne Linsebeskytter. Ren de billeddiagnostiske linse bruger en air duster. Sikre, at kameraet er tilsluttet korrekt og installeret og starte optagelsen med image capture software.</li>
		<li>Justere kameraets indstillinger for at optage 20 rammer/s, med mono 16 optagelse parametre setup; optage 1.200 rammer, gemme i MJPEG-format på en 95% kompression sats. Brug en tomme 9 cm petriskål til at sikre, at scenen er indstillet til den korrekte højde og eventuelt justere det. Bemærk: Sikre, at kanten af pladen er synlige i optagelsen, da vil kunne "holde-dødt" algoritme til at fungere korrekt (figur 1a).</li>
		<li>Under sterile forhold, tage 2 plader tidligere forberedt på trin 3.2 med de samme betingelser og 1 Mot screening plade forberedt i trin 1.2.4. Tilføj 3 mL af M9 til Mot pladen. Brug andre 2 mL af M9 at vaske 1/3 af arealet af 2 plader forberedt på trin 3.2 på Mot pladen.</li>
		<li>Placer Mot pladen som indeholder ca. 5 mL M9 løsning og ca 600 orme på tracker scenen. Fokusere kameraet ved hjælp af en individuel orm og begynde optagelsen.</li>
		<li>Når optagelsen er færdig, kassere Mot plade med orme; Mark FUDR plader som bliver brugt en gang og returnere det til rugemaskine.</li>
		<li>Gentag trin 3.3.3 til 3.3.5 for hver eksperimentelle betingelse.</li>
		<li>Gentag trin 3.3.3 til 3.3.6 for hvert tidspunkt i den voksne levetid. Bemærk: Screening procedurer kan foretages på ethvert punkt af den orm voksen levetid (ca. 3 uger). Disse protokoller lette screening op til 9 tiden point; Forfatterne anbefaler screening hver 2 dage fra dag 1 i voksenalderen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. optimering for diskrete dosis undersøgelser
<ol><li>
Forberede orme ved at gentage trin 3.1.1 til 3.1.3.
	<ol>
<li>Frø ca. 1000 L4 orme på 5 FUDR plader. Inkuber plader på 24 ° C, indtil D3 i voksenalderen, for eksperimenter, der involverer annonce38 orme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ved hjælp af et sterilt glas pipette, overførsel orme forberedt under sterile forhold fra pladen til en 15 mL centrifugeglas, centrifuger på 2.000 x g i 2 min og Fjern supernatanten.
	<ol>
<li>Suspendere løsning af orme i 1 mL af M9 buffer. Overføre orme til et microcentrifuge rør, der centrifugeres ved 300 x g i 2 min, og Fjern supernatanten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
For protein transduktion, tilføje 40 µL Transfektion levering reagens og 20 µL af nativt protein på den ønskede koncentration (typisk 40 µM), og Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
	<ol>
<li>Under sterile forhold, skal du bruge et sterilt glas pipette til at overføre orme fra trin 4.2.1 ind i et microcentrifuge rør indeholdende indkapslede protein for at give en samlet maengde paa 1060 µL. sted rør vandret og ryst ved 60 rpm i en 24 ° C ryster inkubator for 8 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Under sterile forhold, tilsættes 4 mL M9 til en Mot plade og overføre et microcentrifuge rør af orme plus stof på Mot pladen.
	<ol>
<li>Oprettet bane ved at gentage trin 3.3 til 3.3.2.</li>
		<li>Under sterile forhold, tilsættes 4 mL M9 til en Mot plade og overføre et microcentrifuge rør af orme plus stof på Mot pladen.</li>
		<li>Placere Mot pladen på tracker scenen, fokuserer kameraet på en individuel orm og begynde optagelsen. Når du er færdig, etiket Mot plade og angivet til én side.</li>
		<li>Gentag trin 4.4.1 og 4.4.3 for alle prøver.</li>
		<li>Bruger et glas pipette, overføre orme under sterile forhold fra Mot pladen til en 15 mL centrifugeglas, og centrifugeres ved 2.000 x g i 2 min. Fjern supernatanten, overførsel pellet på en FUDR tallerken, og lad tørre under sterile forhold.</li>
		<li>Gentag trin 4.4.5 for alle prøver.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkuber orme på 24 ° C indtil D6 i voksenalderen. Bemærk: Flere antistof inkubationer er også muligt.</li>
	<li>
Tilføj 3 mL af M9 buffer til Mot pladen og bruge 2 mL af M9 løsning for at vaske alle orme fra en FUDR plade på Mot pladen.
	<ol>
<li>Oprettet bane ved at gentage trin 3.3 til 3.3.2.</li>
		<li>Placere Mot pladen på tracker scenen, fokuserer kameraet som nødvendigt og begynde optagelsen. Når optagelsen er færdig, kassere Mot plade eller gendanne den til yderligere screening hvis det ønskes.</li>
		<li>Gentag trin 4.6 at 4.6.2 for alle prøver.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analyse af den Video Data
<ol><li>
Efter at erhverve videoerne, skal du vælge de relevante parametre i software GUI (figur 2) til analyse af data.
	<ol>
<li>Indlæse enkelt eller flere videoer via funktionen Browsing . Vælg en output destinationsmappe. Sikre at 600 til 1.200 rammer anvendes til 30 s analyse. Bemærk: Enhver række rammer kan analyseres.</li>
		<li>Indsæt en pixel til mm omregningsfaktor, som vil være 0.029 for imaging en 9 cm petriskåle ved fuld opløsning. Vælg tracking algoritme 'holde døde'. Bemærk: Omregningsfaktoren vil afhænge af synsfeltet anvendes. Z-transform algoritme kan også bruges som et alternativ.</li>
		<li>Udfyld parametrene i afsnittet lokalisering (figur 2): Z bruge billeder = 100, Z polstring = 3, Std pixel = 54, tærskel = 9, åbning = 1, lukke = 2. Justere parametrene filtrering til Minimum størrelse = 20, maksimal størrelse = 180, ormelignende = 0,94.</li>
		<li>Tune danner baner parametre: Maksimal afstand flytte = 10; Mindste længde = 150, hukommelse = 10.</li>
		<li>Bøjninger og hastighed parametre er angivet. Bruge 1,8 for bøje tærskel, 0 for Minimum bøjerog 150 for Frames for at vurdere hastighed.</li>
		<li>Tune døde orm statistik. Bruge 5.0 til maksimalt beat pr. minut og 1,0 for maksimal hastighed.</li>
		<li>Vælg outputmappe. Angive antallet af Output billeder til 50. Sæt skriftstørrelsen til 10. Bemærk: Du kan vælge en eller flere regioner af interesse (ROIs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test af parametre ved hjælp af funktionen eksempel . Output-eksempel billeder og kontrollere, at orme er synlig i hele de 8 tærskel trin (figur 1).</li>
	<li>Brug funktionen Start job .</li>
	<li>
Analysere resultatet tekstfiler ved at kombinere de individuelle resultater for hele datasættet. Brug Eksporter til tsv funktion i GUI. Bemærk: Individuelle målinger af orme kan eventuelt også anses for befolkningen undersøgelser.<ol>
<li>Analysere data med en statistisk programpakke.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at der ingen interessekonflikter.

På grund af den hurtige ekspansion af teknikker inden for optiske videnskaber er det nu muligt at imødegå kravet om automatiserede metoder i C. elegans undersøgelser i væsentlig grad nye måder. Som et resultat, en række digitale tracking platforme20,41,42,43,44,45,46 er blevet designet og stilles til rådighed over de sidste par år for at erstatte manuel optælling af parametre såsom hastighed bevægelighed, bøjning frekvens, lammelse sats, såvel som mere komplekse former for adfærd, såsom omega sving og levetid målinger. De nyeste automatiserede platforme har væsentligt forbedret reproducerbarhed og følsomhed af C. elegans undersøgelser41 og data af høj kvalitet på små årgange eller endog enkelte dyr. Vi besluttede at udvide automatisering af analysen af ormen opførsel gør det også muligt at evaluere fænotyper af kohorter af tusindvis af dyr i parallel. Den største fordel ved tilgang til at studere orm kohorter er at det giver for regnskab for høj iboende variabiliteten af ormen adfærd24 og for, at narkotika behandling undersøgelser fører ofte til subtile fænotypiske variationer, som er vanskelig at opdage med tilstrækkelig Statistisk signifikans, når ved hjælp af en lille gruppe af dyr. En høj effekt af afsløring (POD) er nødvendigt at registrere med tillid nogen betydelig ændring i adfærd og begrænse falske positive resultater25.
Her har vi beskrevet en række protokoller baseret på en nylig rapporteret automatiseret screeningsmetode for C. elegans, bred field-of-view fyrretræsnematoden sporing platform (WF-NTP)36. Protokollen beskrevet her er opdelt i 5 dele. Del 1 og 2 beskriver forberedelsen af store orm populationer. Kritiske trin er sterilitet af arbejdsforholdene og forberedelse af reagenser og plader nødvendigt at køre eksperimenter. Vi noterer os, at det på grund af den øgede overførselshastighed leveres af denne protokol, i forhold til andre screening metoder36, også kræver øgede mængder af reagenser denne faktor skal overvejes nøje i den eksperimentelle design. Vi bemærker også, at trinnet blegning er kritisk og skal være testet på forhånd som et stort antal æg og sunde larver er nødvendige for at køre disse eksperimenter. Del 3 af denne protokol detaljer om, hvordan til at levere narkotika i solid media og skærmen orm populationer. Vi bemærke, at denne del af protokollen er stærkt afhængig af antallet af narkotika og narkotikamisbrug koncentrationer skal testes af brugeren i parallel. Komplet automatisering af sikkerhedsundersøgelsen og hurtig datafangst Skift den begrænsende trin fra adfærdsmæssige observation reagens og vækst og synkronisering af store orm populationer. De vigtigste skridt under den adfærdsmæssige screening er tider af optagelsen og enhver orm behandling trin (f.eks., overførsel af orme fra NGM plader til sporing platform). Protokollen beskrevet her er et eksempel, designet til at screene orme for op til 9 dage i løbet af de voksne levetid; denne protokol kan dog let tilpasses til skærmen så mange gang point som brugeren ønsker f.eks., 18 dage i træk36. Del 4 derefter illustrerer anvendelsen af protokollen til at levere proteinmolekyler (fx, antistoffer og molekylære chaperoner) i C. elegans, og viser hvordan den protokol, der er illustreret i dele 1-3 kan nemt tilpasses, afhængigt af den ønskede ansøgning. Vi demonstrere, hvordan denne procedure kan være udvidet ikke kun til leveringen af narkotika-lignende molekyler, men også for administrationen af molekylære chaperoner eller antistoffer37. De første fire trin (dele) foregår under sterile forhold, medmindre andet er anført. Alle flydende komponenter bør være autoklaveres før brug og inkubation trin skal udføres på 70% relativ luftfugtighed. I Del5 beskriver vi hvordan man bruger softwarepakken leveres i kombination med tracking fase. Denne software har været custom designet til analyse af WF-NTP data relateret til funktionen af store orm populationer. Vi foreslår, at brugeren følger de retningslinjer, der er fastsat i Del5 dataanalyse; disse parametre er dog afhængig af de specifikke funktioner af de optagede videoer (dvs, fps, synsfelt, video opløsning, antal erhvervede rammer). Funktionen eksempel i GUI er udviklet til at lette evalueringen af de korrekte parametre før analysen.
Disse serier af protokoller gør det muligt at analysere fænotyper af store populationer af C. elegans (i øjeblikket op til 5.000 individuelle orme parallelt) effektivt, reducere artefakter på grund af den iboende variation af opførsel af dyrene , efter aftale med forundersøgelser på magten i registrering nødvendig for at opnå Statistisk signifikans for studier af C. elegans25. Platformen bruger et system af højopløselige kameraer, kan optage billeder af stort antal dyr på en høj hastighed, mens samtidig optagelse flere store kohorter. Høj ydeevne og høj produktivitet af WF-NTP-protokollen gør det muligt at bestemme meget små ændringer i orm adfærd i en meget præcis måde. Derfor, denne metode gør det muligt for nye metoder skal betragtes ikke kun for studiet af biologi C. elegans, men desuden for farmakologiske og medicinske forskning, såsom high throughput screening af genetiske modifikationer og stof behandlinger. Denne procedure har også fordelen, at lammelse undersøgelser skal udføres i parallel med andre adfærdsmæssige målinger, et centralt element i molekylær screening studies.
De resultater, der hidtil er opnået i drug discovery programmer AD15,34,35 og PD18 påvise betydningen af brede field-of-view dataopsamling i væsentlig grad øge de antal dyr, der kan overvåges i et enkelt eksperiment, derved betydeligt reducere de eksperimentelle fejl og væsentligt forbedre den statistiske gyldighed undersøgelser. Mens den nuværende tilgang, der er beskrevet i denne protokol har fokuseret på udfordringer inden for drug discovery, vi håber, at metoden, der vil være udbredt i Fællesskabet, og at dens anvendelse vil blive udvidet til komplekse genetiske og adfærdsmæssige undersøgelser og udvide antallet af fænotyper, der er i øjeblikket kan spores.

Omkring et halvt århundrede siden, Sydney Brenner indført Caenorhabditis elegans (C. elegans) som et modelsystem til at undersøge udviklingen og Neurobiologi, som denne lille (1 mm i længden), gennemsigtig ødelægge orm er let at manipulere genetisk og vedligeholdelse i laboratorium1. I dag er bruges C. elegans til at studere en bred vifte af biologiske processer herunder apoptose, celle signalering, arten af cellecyklus, genregulering, stofskifte, og aldring2. Desuden, den cellulære og væv kompleksitet, protein udtryk mønstre og bevarelse af sygdom veje mellem C. elegans og højere organismer (80% af ormen gener har en menneskelig orthologue), forbundet med enkelhed og omkostningseffektiviteten ved dyrkning, gør det en effektiv i vivo model organisme imødekommenhed over for høj overførselshastighed genetiske3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 og narkotika14,15,16 screeninger. Af alle disse grunde, har C. elegans været ansat i karakterisering af normale og sygdomsrelaterede molekylære veje; i feltet i neurodegeneration, for eksempel, har det aktiveret udforskning af virkningerne af aldring på protein sammenlægning3,4,7,15,17, 18, og karakterisering af initiativtagerne og hæmmere af protein sammenlægning3,4,5,6,7,14, 18.
Den generelle kondition af orme, som er en vigtig adfærdsmæssige parameter skal defineres i denne type af undersøgelse, kan måles manuelt i en række forskellige måder, f.eks ved at tælle antallet af kroppen bøjninger pr. minut (BPM)4,6, 19, eller ved at måle hastigheden af bevægelse20,21,22, samt ved at måle den gennemsnitlige levetid og -satserne for lammelse. Selv om manuelle målinger af kroppen bøjninger og hastighed af bevægelse har ført til mange vigtige indsigt i en række forskellige molekylære veje og mekanismer3,4,14,19, 20,23, manuel assays forbliver i øjeblikket low-overførselshastighed, meget arbejdskrævende og tidskrævende samtidig være tilbøjelig til at fejl og menneskelige bias. Disse spørgsmål give betydelige udfordringer i indsamlingen af data tilstrækkelige statistiske magt til at skelne diskrete adfærdsændringer. Denne begrænsning er særlig relevant for stof screening som behandlinger med potentielle drug molekyler fører ofte til små fænotypiske forandringer24, derfor kræver undersøgelse af et stort antal dyr for at erhverve reproducerbare resultater. For at illustrere dette, har nylige undersøgelser vist, at en høj effekt af afsløring (POD) er nødvendigt at definere med tillid til nogen væsentlige ændringer i adfærd og begrænse falske positive resultater25. Dette har resulteret i en stærk motivation i C. elegans Fællesskabet at erstatte manuel optælling med reproducerbar, automatiserede, tid - og omkostninger - effective målinger. For at imødekomme denne efterspørgsel, har flere laboratorier for nylig udviklet metoder for Højfølsom målinger og nøjagtige orm sporing af større antal orme22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
For at udvide yderligere automatisering proces til de store kohorter af dyr behov for statistisk signifikant målinger, har vi for nylig udviklet et bredt felt-of-view nematode sporing platform (WF-NTP)15,34 ,35,36, der muliggør samtidige undersøgelse af flere fænotypiske udlæsninger på meget store orm populationer, en nøglefaktor i statistisk relevante phenotypical påvisning25. Ikke blot kan WF-NTP i øjeblikket overvåge op til 5.000 dyr parallelt, men fænotypisk udlæsninger også omfatter flere parametre, herunder de hastighed og amplitude af kroppen bøjninger, hastighed bevægelighed, brøkdel af befolkningen, der er lammet, og de størrelsen af dyrene. Det er derfor let muligt at skærmen tusindvis af orme i parallel og at kombinere de forskellige udlæsninger i en adfærdsmæssige kort til at oprette en flerdimensional fingerprint36. Den tilknyttede open source-software er skrevet i Python, hvilket er også forpligtet til at betjene det og er helt tilpasselig. En grafisk brugergrænseflade (GUI) tilbydes også til at give brugerne mulighed at vedtage denne teknologi.
Her præsenterer vi en række protokoller, der illustrerer nogle af de potentielle anvendelser af WF-NTP. Især vi diskuterer administration af forbindelser, lige fra små molekyler til protein therapeutics, og beskrive, hvordan til at screene deres virkninger direkte over store bestande af orme, således effektivt at fjerne behovet for at prøve lille delpopulationer. Brug af WF-NTP til et sådant formål har allerede bragt betydelige fordele i procedurer til designer drug discovery programmer af Alzheimers sygdom (AD)15,34,35 og Parkinsons sygdom (PD)18 ved hjælp af in vivo data for vurderingen af terapeutiske kandidater35,37.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

Caenorhabditis elegans er en veletableret dyremodel i biomedicinsk forskning, bredt ansat i funktionel genomforskning og aldring undersøgelser. For at vurdere sundhed og fitness af dyr under undersøgelsen, er en typisk afhængig af motilitet udlæsninger, såsom måling af antallet af kroppen bøjninger eller hastighed af bevægelse. Disse målinger indebære normalt manuel optælling, at gøre det udfordrende at opnå god Statistisk signifikans, som tid og arbejdskraft begrænsninger ofte begrænse antallet af dyr i hvert forsøg til 25 eller mindre. Da høj statistiske effekt er nødvendige for at opnå reproducerbare resultater og begrænsning af falske positive og negative resultater, når svage fænotypisk virkninger er undersøgt, har for nylig gjort en indsats at udvikle automatiserede protokoller fokuseret på at øge den følsomhed af motilitet påvisning og multi parametrisk adfærdsmæssige profilering. For at udvide påvisningsgrænsen til det niveau, der er nødvendig for at fange de små fænotypiske forandringer, der er ofte afgørende for genetiske undersøgelser og drug discovery, beskriver vi her en teknologisk udvikling, der giver mulighed for undersøgelse af op til 5.000 individuelle dyr samtidig øge den statistiske effekt af målinger af 1.000-fold i forhold omkring til manuel assays og 100 i forhold omkring til andre tilgængelige automatiserede metoder.

Lethed af driften, multiparametric analyse og høj produktivitet i illustreret WF-NTP-protokollen (figur 1 og 2) gør det muligt at bestemme meget små ændringer i orm adfærd i en meget præcis måde. Imaging-platformen er baseret på skræddersyede opto-mekanik, og det kan samles ved hjælp af et 6 MP monokrom kamera kombineret med 16 mm brændvidde høj opløsning linse til 1'' sensor, oplyst med en 8'' af 8'' hvide baggrundslys (Se Tabel af materialer og også reference36 for yderligere detaljer). Den tilknyttede WF-NTP software er skrevet i Python og blev udviklet til at køre på Windows-platforme. Det kører på en brugerdefineret samlet computer med 3.00 GHz octa-core processor og 64 GB random access memory (RAM). Softwaren er også udviklet til parallelize arbejde og video analyse baseret på RAM og CPU af computeren; dvs, en maskine med en lavere beregning magt vil resultere i mindre videoer køre parallelt. Opsætningen af vi bruger i øjeblikket er optimeret til at køre op til ca. 16 videoer parallelt og kan gennemføre en analyse af ca. 100 videoer natten over. Desuden, den høje detaljeringsgrad for tilpasning i GUI af WF-NTP giver stor kontrol af kvaliteten af de billeddiagnostiske analyse. GUI kan bruges til direkte uploade store datasæt i parallel eller individuelle videoer; specifikke rammer kan også vælges for sub DETAILANALYSE, sammen med en pixel omregningsfaktor, som kan bruges til at anslå adfærdsmæssige metrics. En af de to forskellige tracking algoritmer (holde døde og Z-transform) kan vælges afhængigt af om brugeren ønsker at overveje lammet dyr i analysen. Parameteren tærskel kan være indstillet i overensstemmelse hermed med video og eksperimenterende kvalitet. Åbning og lukning parametre tillader brugeren at fjerne støj og yderligere gennemføre tærskel funktionalitet. Den skeletonizing algoritme tilbyder en alternativ metode til analyse. Objektet størrelse cut-offs (filtrering) giver et ekstra filter til baggrundsstøj og parameteren ormelignende tillader brugeren at overveje orme kun objekter med en elliptisk form, dermed adskiller fra andre objekter, der kan have samme pixelstørrelse orme. Efter operationerne tærskel alle de resulterende mærkede regioner kan identificeres som individuelle orme og holdninger i disse regioner er derefter gemt for hver ramme for efterfølgende analyse og sporing. Excentricitet af hver sporede orm bruges til at beregne orm målinger såsom omfanget af ormen bøjning (BPM) som funktion af tiden. Brugerne er også tilladt at vælge antallet af rammer, der bruges til at holde en orm i hukommelsen af softwaren efter sammenstød, og antallet af pixels, at en orm kan bevæge sig mellem rammer kan også indstilles til at skelne mellem dyrene fra støj. Indstillingen minimum spor længde tillader brugeren at kassere orme, der er blevet sporet for kun et par billeder. Andre vigtige parametre, såsom bøjninger og hastighed, tillader brugeren at vælge graden af bøjning skal medregnes som en krop bøje og antallet af billeder anses for at være nødvendige for at anslå hastigheden af dyrene. Cut-off parametre kan indstilles yderligere optagelse af lammet dyr. Outputtet vises automatisk i filerne resultat. Disse værdier betragtes som maksimumsgrænser for evalueringen af fraktion af lammet dyr. Brugeren kan også vælge en eller flere regioner af interesse. Denne funktion er især nyttig til at analysere delpopulationer af orme og output sorteres automatisk i filerne resultater. Indstillingen output tillader brugeren at vælge outputmappe og antallet af tracking rammer, der vil blive produceret for det. Forskellige værktøjssæt kan også bruges til yderligere analyse af data, som værktøjet plot kurve, der viser individuelle orm spor og de fingeraftryk værktøj, der tillader brugeren at oprette fingerprint kort.
Denne metode gør det muligt for nye tilgange til at blive vedtaget, ikke kun for biologiske undersøgelser af C. elegans , men også for farmakologiske og medicinske forskningsformål, såsom high throughput screening af genetiske modifikationer og medicinske behandlingsmetoder. Vi har illustreret dette potentiale ved at beskrive karakterisering af fænotyper for store befolkning studier (N > 1000) af forskellige orm modeller for neurodegenerative sygdomme (frontotemporal demens (FTD)39, Parkinsons sygdom (PD)7 , Alzheimers sygdom (AD)16,40, og Amyotrofisk lateral sklerose (ALS)19 (figur 3a) og kendetegner virkningerne af potentielle terapeutiske molekyler ved hjælp af orm modeller af PD18 og AD 15,12 (figur 3b). To små molekyler, squalamine18 og bexarotene15, blev administreret i koncentrationer op til 25 µM til PD (figur 3b) og 10 µM til AD38 (figur 3b) orme, henholdsvis. Begge forbindelser viste klart dosisafhængig virkninger over vifte af koncentrationer testet. Vi har vist, at denne høj nøjagtighed af målingerne, der opnås ved at øge antallet af orme, der kan analyseres i forhold til traditionelle metoder (figur 3 c). Vi illustrerede vigtigheden af stikprøvestørrelse (figur 3 c) i molekylær screening såvel som i karakterisering af mutantstammen. Stigning i temperatur fra 20 ° C fører til ca. halvdelen af ormene annonce bliver lammet efter 3 dage i voksenalderen. Ormen befolkninger blev screenet under forskellige forhold, fx, når orme over udtrykker formen 42-rester af amyloid-β peptid (Aβ1-42) (AD orme) blev udsat for subtile temperaturen variationer (figur 3 c, venstre panel), når Aβ1-42 blev udtrykt i alle neuroner (figur 3 c, centrale panel), eller når AD orme blev udsat for bexarotene (figur 3 c, højre panel). Orme blev også analyseret fra små ROIs tilfældigt udvalgt fra hele synsfeltet af de videoer, erhverves med den WF-NTP (N < 50, gule barer) fremhæve sammenligning af motilitet af disse orme med den gennemsnitlige motilitet for hele orm befolkning (N < 1.000). I alle panelerne, forskellen målt på hele orm befolkningen synes at være statistisk signifikant med p ≤ 0,0001 (*).
WF-NTP-protokollen beskrevet her giver også mulighed for simultan optagelse af flere parametre (figur 1b) at støtte i en optimal måde, både intern validering og udviklingen af et omfattende fingeraftryk af en lang række betingelser forhold til en kontrolprøve, giver mulighed for meningsfuld sammenligninger på tværs af flere undersøgelser. Denne multi parametrisk tilgang omfatter simultan analyse af flere adfærdsmæssige funktioner, herunder bøjning frekvens, hastighed, lammelse rate, størrelse, bøje amplitude og bøje forskydning36. Dette giver mulighed for tusindvis af dyr skal overvåges nøje og på en meget høj følsomhed og Statistisk signifikans og giver muligheder for store befolkningsgrupper undersøgelser. Denne tracking procedure har også fordelen, at lammelse undersøgelser skal udføres i parallel med andre adfærdsmæssige målinger, et centralt element i molekylær screening studies.
De resultater, der hidtil er opnået i AD15,34,35 og PD18 drug discovery påvise betydningen af brede field-of-view dataopsamling høj grad at øge antallet af dyr, der kan være overvåges i et enkelt eksperiment, markant faldende de eksperimentelle fejl og væsentligt forbedre den statistiske gyldighed undersøgelser. Baseret på disse resultater, forventer vi at WF-NTP-protokollen, som vi gjort let tilgængelige for Fællesskabet36, vil udvide brugen af C. elegans.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg"> Figur 1: WF-NTP analyse trin og eksempel på en fingerprint. (en) 1. Originale video. 2. baggrundsbillede. 3. baggrund trækkes billede. 4-6. tærskel trin. 7-9. enkelt mærkning af orme. (b) flere fænotyper er rapporteret med et fingeraftryk for vildtype orm og orm modeller af PD og AD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg"> Figur 2: grafisk brugergrænseflade (GUI) af WF-NTP. Specifikke videoer og markerede rammer kan vælges i GUI for analyse, og en pixel omregningsfaktor kan indsættes, hvorefter analysen er foretaget med en af de to givne tracking algoritmer. Det er muligt at vælge graden af bøjning nødvendigt at tælle som en krop bøje samt antallet af rammer, der er nødvendige for at anslå hastigheden af dyrene. Body bøjninger og hastighed tærskler kan bestemme lammet orm statistik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg"> Figur 3: eksempler på anvendelser som metoden WF-NTP aktiveret. (en) anvendelse af WF-NTP i stor population studies (N > 1.000) af BPM målinger for C. elegans modeller af en vifte af neurodegenerative sygdomme, herunder FTD, PD, annonce, og ALS. (b) anvendelse af WF-NTP i drug discovery. (c) betydningen af befolkningen undersøgelser i temperatur følsomhed, drug effektivitet og mutant stamme karakterisering. Fænotyper af delpopulationer Nielsen < 50 (gule søjler) sammenlignes med dem, for hele orm befolkning (N < 1.000). Fejllinjer angiver standardafvigelsen på middelværdien (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automatiseret adfærdsmæssige analyse af store C. elegans befolkninger ved hjælp af et bredt synsfelt sporer Platform

Vi beskriver protokoller for at bruge den brede field-of-view nematodeprøveudtagning sporing platform (WF-NTP), som giver høj overførselshastighed fænotypiske karakterisering af store populationer af Caenorhabditis elegans. Disse protokoller kan bruges til at karakterisere subtile adfærdsmæssige ændringer i mutantstammen eller svar til farmakologisk behandling i en yderst skalerbar mode.

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Så denne metode kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål i et lægemiddel opdagelse proces om, hvordan et bestemt lægemiddel opfører sig i en levende organisme. Den største fordel ved denne teknik er det giver store stikprøvestørrelser, der skal screenes hurtigt og effektivt. Denne teknik har allerede en stor indvirkning på opdagelsen af lægemidler ved at muliggøre en meget quanititativ vurdering af virkningerne af narkotika kandidater.Denne metode giver nye mekanistiske indsigter i debut og progression af misfolding sygdomme. Desuden kan denne metode også anvendes på andre systemer, såsom aldring og genetiske screeninger. Vi er meget begejstrede for denne mulighed for at indføre nye fysiske metoder i løbet af narkotika opdagelse.Disse demonstartions af denne metode er kritisk, da screening skridt kræver høj kendskab til denne novo automatisk teknik. At demonstrere proceduren vil være Sam Casford, en eftersøgningsassistent fra vores laboratorium. Før proceduren påbegyndes, tilsættes 2,2 millileter af hvert lægemiddel stof ved passende koncentration til seks 5-fluorodeoxyuridin eller FUDR plader pr orm stamme, ved omhyggeligt at sprede forbindelsen over hele overfladen af pladen, og tør pladerne under sterile forhold.Mens pladerne tørrer, skal du bruge 15 milliliter M9 buffer til at vaske ormene fra fem rige nematode vækstfaktor plader, og overføre de befriede orme i et konisk rør til centrifugering. Re-suspendere nematoder i tre milliliter frisk M9 buffer til kvantificering af antallet af orme i L4 larve fase, og frø 700 L4 larver på hver af de seks tørre FUDR plader pr orm stamme, per forbindelse. Når alle nematoder er blevet seedet, skal pladerne indeholdende de stammer, for hvilke parlyse er induceret ved at hæve temperaturen ved 24 grader celsius i 24 timer.Den næste dag, tænde lyset på scenen lys af den parallelle orm tracker, og rense glas fase af tracker med 70 procent ethanol. Hvis der ikke er synlige rester tilbage, skal du fjerne objektivdækslet og bruge en luftdumat til at rengøre billedlinsen. Bekræft, at kameraet er tilsluttet og installeret korrekt, og begynd at optage med billedoptagelsessoftwaren.Juster kameraindstillingerne for at optage 20 billeder pr. sekund med de relevante mono-16-optagelsesparametre. Brug en tom, ni centimeter petriskål for at sikre, at scenen er indstillet til den korrekte højde, og juster scenen, hvis det er nødvendigt. Under sterile forhold tilsættes der tre milliliter M9-opløsning til en motilitetsscreeningsplade, og der anvendes to milliliter M9-opløsning til at vaske en tredjedel af overfladearealet på to nematodebelastede FUDR-plader fra samme forsøgsgruppe i screeningspladen.Placer derefter screeningpladen på trackerens scene. Brug en enkelt orm til at fokusere kameraet, og begynde at optage dyrene. Når optagelsen er færdig, skal du kassere motilitetspladen og markere FUDR-pladerne som brugt én gang, før de returneres til inkubatoren.Hvis du vil analysere videodataene, skal du åbne den grafiske brugergrænseflade til den parallelle orm tracker-dataanalysesoftware og bruge browserfunktionen til at indlæse videoen af interesse. Vælg en outputdestinationsmappe, og bekræft, at 600 til 1200 billeder er indstillet til en 30 sekunders analyse. Indsæt en 0,029 pixel til millimeter konverteringsfaktor for billeddannelse af en ni centimeter petriskål ved fuld opløsning, og vælg hold død sporing algorithhm.Under fanen lokalisering af parametre skal du indstille Z-brugsbillederne til 100, Z-polstring til 3, standardpixel til 54, tærsklen til 9, åbningen til 1 og lukningen til 2. Juster filtreringsparametrene til en minimumstørrelse på 20, en maksimal størrelse på 180 og en orm som 0,94. Indstil parametrene for formularforløb til en maksimal afstandstræk på 10, en minimumlængde på 150 og en hukommelse på 10.Indstil bøjninger og hastighedsparametre til en bøjetærskel på 1,8, et minimum af bøjninger på 0 og en ramme for at estimere hastigheden på 150. Tune den døde orm statistik til en maxmim beat per minut af 5, og en maksimal hastighed på 1. Vælg outputmappen, og vælg antallet af outputrammer til 50 og skriftstørrelsen til 10.Brug eksempelfunktionen til at teste parametrene og output af eksempelbillederne for at kontrollere, om ormene er synlige i de otte tærskeltrin. Start derefter funktionen Start job,, og kombiner de enkelte resultater for hele datasættet for at analysere testresultatfilerne og gemme resultaterne via funktionen eksport til TSV. Denne metode gør det muligt at karakterisering af nematode fenotyper til store befolkningsundersøgelser af forskellige orm modeller af neurodegenerative sygdomme, såsom frontotemporal demens, Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, og amyotrofisk lateral sklerose.Samt karakterisering af virkningerne af potentielle terapeutiske molekyler, ved hjælp af orm modeller af Parkinsons og Alzheimers sygdom. Den høje nøjagtighed af disse målinger opnås ved at øge antallet af orme, der kan analyseres i forhold til traditionelle metoder. Under udførelsen af denne procedure, er det vigtigt at huske at minimere tiden mellem tilsætning af ormene til motilitet og begyndelsen af sporingen.Efter denne procedure, andre metoder kan udføres for at supplere resultaterne og til at forbinde med protein aggregering. Efter det udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for neurodegenerative og misfolding sygdomme, såsom Parkinsons og Alzheimers, at udforske den rigtige opdagelse applikationer. Glem ikke, at det kan være ekstremt farligt at arbejde med FUDR, og at forholdsreglerne, såsom at bære nitrilhandsker, altid bør tages, når du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encellede Analyse af Bacillus subtilis Biofilm Brug fluorescensmikroskopi og Flowcytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Optælling af Major perifert blod leukocytpopulationer for multicenter kliniske undersøgelser med en Whole Blood fænotypebestemmelse Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automatiseret Adskillelse af<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel koloniseret af et bakterielt patogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Genekspressionsprofilering inficere Mikrober hjælp af en digital Bar-kodning Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En Semi-automatiske tilgang til Forberedelse Antibody Cocktails for immunfænotypisk Analyse af Human Perifer Blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Multiplex cytokin profilering af stimuleret mus Splenocytes ved hjælp af en Cytometric perle-baseret immunassay Platform

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Indsamling og behandling af lymfeknuder fra store dyr til RNA analyse: forberede lymfeknude transkriptom undersøgelser af store dyrearter

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

En høj overførselshastighed, High-indhold, væskebaseret C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...