Name: automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform
Uploaded: 2018-11-28T13:30:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het centrum voor Misfolding ziekten (CMD). FAA wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship award van de Alzheimer's Society, Groot-Brittannië (Grant nummer 317, AS-SF-16-003). De stammen van C. elegans werden verkregen vanaf de Caenorhabditis elegans genetische centrum (CGC).

1. voorbereiding van de materialen voor C. elegans protocollen
<ol><li>
Ter voorbereiding van een 10 x M9-bufferoplossing, 30 g monobasisch kalium fosfaat, 60 g natriumfosfaat dibasische en 50 g natriumchloride toevoegen aan een fles 1 L autoclaaf.
	<ol>
<li>Voeg 1 liter gezuiverd water en autoclaaf ca. 121 ° C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Verdun 10 keer in gezuiverd water en autoclaaf op ca. 121 ° C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Wanneer afgekoeld, voeg 1 mL van een oplossing van 1 M magnesiumsulfaat. Opmerking: Slechts 1 x M9 (M9) moet worden gebruikt voor worm verwerken in de volgende stappen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ter voorbereiding van de nematode groeimedium (Rich-NGM), Meng 2.7 g natriumchloride, 15.75 g agar, 5.75 g van caseïne, 900 mL gezuiverd water en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten.
	<ol>
<li>Het medium Rich-NGM overbrengen in een warme oven (ca. 70 ° C) als niet gebruikt; de Rich-NGM kan worden bewaard gesmolten bij ca. 70 ° C gedurende maximaal 12 uur vóór het onbruikbaar.</li>
		<li>Aan de Rich-NGM mix, 900 µL van een oplossing van 1 M calciumchloride, 900 µL van een oplossing van 1 M magnesiumsulfaat en 900 µL van een oplossing van 5 mg/mL cholesterol in absolute ethanol toe te voegen. Opmerking: Cholesterol vereist geen autoclaaf vóór gebruik.</li>
		<li>Ter voorbereiding van de experimentele platen die houden van een synchrone beroepsbevolking, voeg 92 µL van 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) op 812 µM tot 900 mL van Rich-NGM. Opmerking: FUDR is zowel giftige en kankerverwekkende, dus is het essentieel om nitril handschoenen naast labjassen en veiligheidsbril dragen. Laat geen afval naar het invoeren van algemene afval stromen en de verwijdering van door verbranding met een naverbrander.</li>
		<li>20 mL van de gesteriliseerde met autoclaaf Rich-NGM giet in een petrischaal 9 cm steriel voor het genereren van een groeischijf (Rich-NGM plaat). Giet de gesteriliseerde met autoclaaf Rich-NGM 15 mL in een petrischaal 9 cm steriel te maken van een plaat van de motiliteit (Mot plaat). Giet 20 mL Rich-NGM met FUDR in een petrischaal 9 cm steriel voor het genereren van een plaat van FUDR. Opmerking: Het lage agar volume van de Mot plaat vergemakkelijkt de camera richten en worm bijhouden (zie stap 3.2.5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De stam van de OP50 Escherichia coli , bereiden in autoclaaf 1 L van de pond-Bouillon bij 121 ° C gedurende 15 minuten en inoculeren met starter cultuur wanneer gekoeld.
	<ol>
<li>Laat de bacteriecultuur groeien 's nachts bij 37 ° C en steriliseren van de buis moet worden gebruikt voor centrifugeren.</li>
		<li>De bacteriën overbrengen in steriele buizen en centrifuge op 4.600 x g gedurende 15 minuten.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof decanteren en in 10% van het oorspronkelijke volume maken 10 x (10 keer geconcentreerd) OP50 voorraad met steriel water, schorten.</li>
		<li>Verdun 15 mL van de 10 x OP50 voorraad 150 ml voor het genereren van 1 x OP50, met steriel water, voordat het wordt gebruikt om het zonebeheer van Rich-NGM platen. Gebruik de resterende 10 x oplossing voor zaad FUDR platen. Opmerking: De Mot platen blijft unseeded en zal alleen worden gebruikt in de afbeelding overname stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aan zaad platen met bacteriën, scheiden de Rich-NGM en FUDR platen.
	<ol>
<li>Voeg onder steriele condities, 350 µL van 1 x OP50 te Rich-NGM platen en gelijkmatig. Opmerking: Verspreiden niet aan de rand van de plaat zoals wormen van de zijkanten van de plaat en sterven kruipen zal.</li>
		<li>Voeg onder steriele condities, 350 µL van 10 x OP50 op FUDR platen en gelijkmatig.</li>
		<li>Laat de platen te droog en Incubeer bij 20 ° C voor 2 d vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van C. elegans voor gebruik met de WF-NTP
<ol><li>C. elegans handhaven op Rich-NGM platen of door de overdracht van een kleine hoeveelheid agar met wormen bedrukte zijde naar beneden op een verse bacteriële laag. Het handhaven van de stammen van C. elegans op deze manier alvorens aan te vangen van de experimentele protocollen.</li>
	<li>Met behulp van de inbrengende techniek (zie stap 2.1), zaad 20 platen van elke stam met behulp van goed gevoed, gemengde fase wormen en laten groeien voor 2 d bij 20 ° C.</li>
	<li>Afwassen 5 platen met wormen met 15 mL M9 en zwembad in een tube van 15 mL. Herhaal voor alle 20 platen van elke stam.</li>
	<li>Centrifugeer de wormen bij 2.000 x g gedurende 2 minuten, verwijder het supernatant en schorten in 2 mL zuiver M9 oplossing.</li>
	<li>10 mL bleken oplossing voor te bereiden door het mengen van 13% natriumhypochloriet en 4 M natriumhydroxide-oplossing bij een verhouding van 3:2 vol/vol Opmerking: Deze oplossing vereist geen autoclaaf. Zowel onderdelen als de resulterende oplossing zijn bijtende en moeten worden behandeld met zorg met behulp van nitril handschoenen. Natriumhydroxide is licht corrosief voor glas en moeten worden opgeslagen in plastic bakjes.</li>
	<li>1 mL van bleken oplossing toevoegen aan elke centrifugebuis en schud krachtig gedurende ongeveer 3,5 min of totdat de epidermis is volledig opgelost.</li>
	<li>Verdun onder steriele omstandigheden, de monsters naar 15 mL M9 en centrifuge op 2.000 x g voor 2 min. Verwijder het supernatant en Suspendeer in 15 mL M9 oplossing.</li>
	<li>Herhaal stap 2.7 6 keer, totdat alleen worm eieren blijven, en de oplossing is niet langer een geur van chloor.</li>
	<li>Centrifugeren van de monsters bij 2.000 x g gedurende 2 min, verwijder het supernatant en Suspendeer in 2 mL M9 oplossing.</li>
	<li>Onder steriele condities, kunt een steriele glazen pipet Pipetteer 2 mL van de M9 met eieren in elk putje van de plaat van een 12-well weefselkweek en Incubeer bij 20 ° C gedurende ten minste 16 h. Opmerking: Gebruik afzonderlijke platen voor elke stam ter voorkoming van kruisbesmetting. De inbrengende stap van de centrifuge buizen naar de multi putten helpt om te voorkomen dat verstikking van de worm.</li>
	<li>Overdracht van de wormen die 's nachts uitgebroed uit de 12-Wells-platen in 15 mL centrifuge buizen. Neem 3 druppels van 5 µL van worm oplossing en Tel het aantal wormen aanwezig op eerste larvale stadium (L1).</li>
	<li>Het aantal wormen per µL van oplossing berekenen.</li>
	<li>Zaad L1 wormen op Rich-NGM platen bij 3.000 wormen per plaat en laat ze groeien voor 2 dagen bij 20 ° C, totdat ze de laatste larvale stadium (L4) stadium bereiken.</li>
</ol>3. algemene WF-NTP Protocol
<ol><li>
2.2 mL van elk medicijn samengestelde toevoegen met de geschikte concentratie (zo 25 of 10 mM voor drugs dergelijke squalamine18 en bexaroteen15, respectievelijk) tot 6 FUDR platen en laten drogen onder steriele omstandigheden voor elk worm stam gewenst. Opmerking: Deze stap wordt herhaald voor elke verbinding in behandeling, voor elke concentratie en elk oplosmiddel gebruikt.<ol>
<li>Wassen van de wormen uit 5 Rich-NGM platen voorbereid op stap 2.13 met 15 mL M9 buffer en de wormen overbrengen in een centrifugebuis.</li>
		<li>Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 2 minuten, verwijderen van supernatant en Suspendeer in 3 mL M9. Neem 3 druppels van 5 µL van de oplossing van de M9 met wormen en Tel het aantal wormen aanwezig bij de laatste larvale stadium L4.</li>
		<li>Bereken het aantal wormen per µL van M9 buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zaad 700 L4 larven op 6 van de droge FUDR platen met een bepaalde stof, herhaal deze stappen voor elke concentratie van elk samengestelde en laten drogen onder steriele omstandigheden.
	<ol>
<li>Incubeer de wormen bij 24 ° C van L4 voor deze stammen waar de verlamming van de worm wordt geïnduceerd alleen door het verhogen van de temperatuur, zoals de AD stam38. Rekenen van de dag volgende op het larvale stadium van L4 als D0 van volwassenheid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inschakelen van de lichten van de fase voor de tracker.
	<ol>
<li>Reinig het glas podium met 70% ethanol en ervoor zorgen dat geen resten zichtbaar residu, verwijder lensdop. Reinig de imaging lens met behulp van een lucht-stofdoek. Zorg ervoor dat de camera is goed aangesloten en geïnstalleerd en start de opname met de afbeelding capture software.</li>
		<li>Pas de instellingen van de camera als u wilt opnemen van 20 frames/s, met mono 16 opnemen van parameters instellen; opnemen van 1200 kaders, opslaan in MJPEG formaat bij een compressiefactor van 95%. Gebruik een lege 9 cm petrischaal om ervoor te zorgen dat het podium is ingesteld op de juiste hoogte en passen indien nodig. Opmerking: Zorgen dat de randen van de plaat zichtbaar in de opname zijn, aangezien dit de 'houden-dood'-algoritme om correct te werken zal toestaan (Figuur 1a).</li>
		<li>Onder steriele condities, neem 2 platen die eerder is bereid bij stap 3.2 met dezelfde voorwaarden en 1 Mot screening plate bereid in stap 1.2.4. Voeg 3 mL van de oplossing van de M9 aan de Mot-plaat. Gebruik andere 2 mL M9 te wassen van 1/3 van de oppervlakte van 2 platen bereid bij stap 3.2 op het bord van de Mot.</li>
		<li>Plaats de plaat van de Mot met circa 5 mL van de oplossing van de M9 en ongeveer 600 wormen op het podium van de tracker. Focus van de camera met behulp van een individuele worm en beginnen met opnemen.</li>
		<li>Wanneer de opname voltooid is, negeren de Mot plaat met de wormen; Markeer de FUDR platen als eenmaal wordt gebruikt en terug te sturen naar de incubator.</li>
		<li>Herhaal stap 3.3.3 aan 3.3.5 voor elke experimentele voorwaarde.</li>
		<li>Herhaal stap 3.3.3 aan 3.3.6 voor elk punt van de tijd in de volwassen levensduur. Opmerking: De screening procedures kunnen worden uitgevoerd op elk punt van de worm van volwassen levensduur (ca. 3 weken). Deze protocollen vergemakkelijken screening tot 9 keer punten; de auteurs raden screening om de 2 dagen vanaf dag 1 van volwassenheid.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. optimalisatie voor Discrete dosis Studies
<ol><li>
Bereiden wormen door 3.1.1 aan 3.1.3 stappen te herhalen.
	<ol>
<li>Zaad ca. 1000 L4 wormen op 5 FUDR platen. Incubeer de platen bij 24 ° C tot D3 van volwassenheid, voor het uittesten van AD38 wormen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Met behulp van een steriele glazen pipet, overdracht de wormen bereid onder steriele omstandigheden van de plaat naar een centrifugebuis 15 mL, centrifuge op 2.000 x g gedurende 2 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
	<ol>
<li>De oplossing van wormen in 1 mL M9 buffer opschorten. De wormen overbrengen in een microcentrifuge buis, centrifuge op 300 x g gedurende 2 minuten, en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voor signaaltransductie eiwitten, 40 µL van de reagens van de transfectie levering en 20 µL van eiwit toevoegen op de gewenste concentratie (meestal 40 µM) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
	<ol>
<li>Onder steriele condities, kunt een steriele glazen pipet wormen van stap 4.2.1 overboeken naar een microcentrifuge buis met ingekapselde eiwitten geven een totaal volume van 1060 µL. plaats buizen horizontaal te schudden bij 60 rpm in een 24 ° C incubator voor 8u schudden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Onder steriele condities, 4 mL M9-oplossing toevoegen aan een Mot-plaat en breng een microcentrifuge buis wormen plus drug op de Mot-bord.
	<ol>
<li>Instellen van de tracker herhaalt u stap 3.3 aan 3.3.2.</li>
		<li>Onder steriele condities, 4 mL M9-oplossing toevoegen aan een Mot-plaat en breng een microcentrifuge buis wormen plus drug op de Mot-bord.</li>
		<li>Plaats de plaat van de Mot op het podium van de tracker, de camera richten op een individuele worm en beginnen met opnemen. Als alles klaar is, het label van de plaat van de Mot en stel aan de ene kant.</li>
		<li>Herhaal stap 4.4.1 en 4.4.3 voor alle monsters.</li>
		<li>Met behulp van een glazen pipet, wormen onder steriele omstandigheden van de Mot plaat overbrengen in een centrifugebuis 15 mL Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 2 min. verwijderen supernatant, overdracht de pellet op een plaat van FUDR en laten drogen onder steriele omstandigheden.</li>
		<li>Herhaal stap 4.4.5 voor alle monsters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de wormen bij 24 ° C tot en met D6 van volwassenheid. Opmerking: Meerdere antilichaam-incubations zijn ook mogelijk.</li>
	<li>
Voeg 3 mL van de M9 buffer naar de Mot-plaat en gebruik van 2 mL M9 oplossing te spoelen van alle de wormen uit een plaat van de FUDR op het bord van de Mot.
	<ol>
<li>Instellen van de tracker herhaalt u stap 3.3 aan 3.3.2.</li>
		<li>Plaats de plaat van de Mot op het podium van de tracker, richten de camera als dit nodig is, en beginnen met opnemen. Wanneer de opname voltooid is, de Mot plaat negeren of herstellen om desgewenst verder te screenen.</li>
		<li>Herhaal stap 4.6 tot en met 4.6.2 voor alle monsters.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. het analyseren van de Video gegevens
<ol><li>
Na het verwerven van de video's, selecteert u de juiste parameters in de software GUI (Figuur 2) voor gegevensanalyse.
	<ol>
<li>Laden één of meerdere video's via de functie Bladeren . Selecteer een doelmap voor uitvoer. Ervoor zorgen dat de frames van 600 tot 1.200 voor een 30 s-analyse gebruikt. Opmerking: Elk willekeurig bereik van frames kan worden geanalyseerd.</li>
		<li>Plaats een pixel mm omrekeningsfactor, die zullen 0.029 voor imaging-een 9 cm petrischalen bij volledige resolutie. Selecteer de tracking-algoritme 'dood houden'. Opmerking: De omrekeningsfactor zal afhangen van het gezichtsveld gebruikt. Z-transformatie algoritme kan ook worden gebruikt als alternatief.</li>
		<li>Invullen van de parameters in de sectie traceren (Figuur 2): Z gebruik afbeeldingen = 100, Z opvulling = 3, Std pixels = 54, drempel = 9, Opening = 1, sluiten = 2. Aanpassen van de parameters van de Filtering voor minimale grootte = 20, maximale grootte = 180, Worm-achtige = 0.94.</li>
		<li>Tune de vervormen trajecten parameters: maximale afstand verplaatsen = 10; Minimale lengte = 150, geheugen = 10.</li>
		<li>Bochten en snelheid parameters instellen. 1.8 voor Bend drempel, 0 voor Minimum bochtenen 150 voor Frames te schatten snelheidgebruiken.</li>
		<li>Het afstemmen van de dode worm statistieken. 5.0 voor Maximum beat per minuut en 1.0 gebruiken voor Maximum snelheid.</li>
		<li>Kies de uitgang van de map. Het aantal frames van de Output op 50 instelt. Grootte van het lettertype ingesteld op 10. Opmerking: Selecteer eventueel een of meer regio's van belang (ROIs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test de parameters met behulp van de voorbeeld functie. Uitgang van de voorbeeldafbeeldingen en controleer of de wormen zichtbaar in de 8 stappen van drempelmethode (Figuur 1).</li>
	<li>Gebruik de functie baan te beginnen .</li>
	<li>
Het analyseren van de tekstbestanden voor resultaat door het combineren van de afzonderlijke resultaten voor de gehele dataset. Het exporteren naar tsv functie gebruiken in de GUI. Opmerking: Individuele statistieken van de wormen kan desgewenst ook worden beschouwd voor bevolkingsvraagstukken.<ol>
<li>Analyseren van gegevens met een statistische softwarepakket.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten.

Vanwege de snelle expansie van de technieken op het gebied van optische wetenschappen is het nu mogelijk inspelen op de behoefte van de geautomatiseerde methoden in C. elegans studies in aanzienlijk nieuwe manieren. Dientengevolge, een aantal digitale platformen20,41,42,43,44,45,46 bijhouden zijn ontworpen en gemaakt beschikbaar zijn via de laatste jaren ter vervanging van de handmatige tellen van parameters zoals de snelheid van de beweging, frequentie, verlamming tarief, evenals de meer complexe vormen van gedrag zoals omega bochten en levensduur metingen buigen. Meest recente geautomatiseerde platformen hebben sterk verbeterd de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van C. elegans bestudeert41 en hoogwaardige gegevens verstrekt op kleine cohorten of zelfs individuele dieren. We besloten te verlengen van de automatisering van de analyse van het gedrag van de worm te maken het ook mogelijk om te evalueren van de fenotypen van cohorten van duizenden dieren in parallel. Het belangrijkste voordeel van de aanpak van het bestuderen van de worm cohorten is dat het mogelijk maakt voor de boekhouding voor de hoge intrinsieke variabiliteit van worm gedrag24 en voor het feit dat de drug behandeling studies vaak leiden tot subtiele fenotypische afwijkingen, die zijn moeilijk op te sporen met voldoende statistische significantie, bij het gebruik van een kleine groep dieren. Een high power van detectie (POD) is inderdaad noodzakelijk te detecteren met vertrouwen belangrijke afwijkingen in gedrag en te beperken van vals-positieve resultaten25.
Hier hebben we een reeks protocols op basis van een onlangs gerapporteerde geautomatiseerde screeningmethode voor C. elegans, het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)36beschreven. Het protocol hier beschreven is verdeeld in 5 delen. Delen 1 en 2 beschrijven de voorbereiding van grote worm populaties. Er zijn kritische stappen de steriliteit van de arbeidsomstandigheden en de bereiding van reagentia en platen nodig om uit te voeren van de experimenten. Wij stellen vast dat, als gevolg van de grotere gegevensdoorvoer geboden door dit protocol in vergelijking met andere methoden36screening, het vereist ook grotere hoeveelheden van reagentia; deze factor moet zorgvuldig worden overwogen in de proefopzet. We constateren ook dat de bleken stap is van cruciaal belang en moet vooraf worden getest als een groot aantal eieren en gezonde larven noodzakelijk zijn voor stormloop van deze experimenten. Deel 3 van dit protocol detailleert hoe te leveren van geneesmiddelen in vaste media en scherm worm populaties. Wij stellen vast dat dit deel van het protocol is sterk afhankelijk van het aantal drugs en drug concentraties worden getest door de gebruiker in parallel. De volledige automatisering van de screeningprocedure en de snelle data-acquisitie verschuiven de beperkende stap uit gedrags observatie naar reagens voorbereiding, de groei en de synchronisatie van grote worm populaties. De belangrijkste stappen tijdens de gedrags screening zijn de tijden van de opname en elk worm behandeling stappen (bijvoorbeeld, de overdracht van wormen uit de NGM platen aan het platform van de tracking). Het protocol beschreven hier is een voorbeeld dat is ontworpen om het scherm van de wormen voor tot 9 dagen tijdens de levensduur van volwassen; Dit protocol kan echter gemakkelijk aangepast aan scherm zoveel tijd punten als de gebruiker, bijvoorbeeld 18 opeenvolgende dagen36 wenst. Deel 4 illustreert de toepassing van het protocol op het leveren van eiwitmolecules (bijv. antistoffen en moleculaire chaperones) vervolgens in C. elegans, en toont hoe het protocol geïllustreerd in de onderdelen 1-3 kan gemakkelijk worden aangepast, afhankelijk van de gewenste toepassing. We laten zien hoe deze procedure kan worden uitgebreid, niet alleen voor de levering van drugs-achtige moleculen, maar ook voor het beheer van moleculaire chaperones of antilichamen37. De eerste vier stappen (delen) worden uitgevoerd onder steriele condities, tenzij anders vermeld. Alle liquide componenten moet gesteriliseerde met autoclaaf voorafgaand aan het gebruik en de incubatie stappen moeten worden uitgevoerd op 70% relatieve vochtigheid. In deel 5 beschrijven we het gebruik van de softwarepakket geboden in combinatie met de tracking-fase. Deze software heeft geweest aangepaste ontworpen voor de analyse van WF-NTP gegevens met betrekking tot het gedrag van grote worm populaties. Wij stellen voor dat de gebruiker de richtsnoeren die voorzien in deel 5 de data-analyse volgt; deze parameters zijn echter afhankelijk van de specifieke kenmerken van de opgenomen video's (dat wil zeggen, fps, gezichtsveld, videoresolutie, aantal verworven frames). De voorbeeldfunctie geboden in de GUI is ontworpen om de evaluatie van de juiste parameters voor de analyse.
Deze serie van protocollen maken het mogelijk voor het analyseren van de fenotypen van grote populaties van C. elegans (momenteel maximaal 5.000 individuele wormen parallel) effectief, vermindering van de artefacten als gevolg van de intrinsieke variabiliteit van het gedrag van de dieren , in overleg met de voorbereidende studies op de kracht van detectie nodig is om de statistische significantie voor studies van C. elegans25. Het platform maakt gebruik van een systeem van hoge resolutie camera's, geschikt voor het opnemen van beelden van grote aantallen dieren op een hoge snelheid, terwijl het gelijktijdig opnemen van meerdere grote cohorten. De hoge prestaties en een hoge doorvoersnelheid van het WF-NTP protocol maakt het mogelijk om zeer kleine veranderingen in gedrag van de worm in een zeer nauwkeurige manier. Daarom maakt deze methodologie nieuwe benaderingen te worden beschouwd, niet alleen voor de studie van de biologie van C. elegans, maar bovendien voor farmacologische en medisch onderzoek, zoals de high-throughput screening van genetische wijzigingen en drug behandelingen. Deze procedure heeft ook het voordeel van het toestaan van verlamming studies in parallel met andere gedrags metingen, een belangrijke functie in moleculaire screening studies worden uitgevoerd.
De resultaten die tot dusver zijn bereikt in de programma's van drugs, ontdekking van AD15,34,35 en PD18 tonen het belang van breed veld-of-view data-acquisitie bij het aanzienlijk vergroten van de het aantal dieren die in een enkele experiment, daardoor aanzienlijk verminderen de experimentele fouten en sterk verbeteren van de statistische validiteit van studies kunnen worden gecontroleerd. Terwijl de huidige in dit protocol beschreven aanpak heeft gericht op het aanpakken van de uitdagingen op het gebied van Geneesmiddelenontwikkeling, wij hopen dat de methodologie algemeen zal worden aangenomen in de Gemeenschap, en dat de toepassing ervan zal worden uitgebreid tot complexe genetische en Behavioral studies en breid de fenotypen die momenteel worden opgespoord.

Ongeveer een halve eeuw geleden, Sydney Brenner geïntroduceerd Caenorhabditis elegans (C. elegans) als een modelsysteem om ontwikkeling en neurobiologie, als dit kleine studie (1 mm in lengte), transparante nematode worm is gemakkelijk te manipuleren genetisch en in het laboratorium1te handhaven. Vandaag, wordt C. elegans gebruikt voor het bestuderen van een breed scala aan biologische processen zoals apoptosis, cel signalering, de aard van de celcyclus, genregulatie, metabolisme en vergrijzing2. Bovendien, de mobiele en weefsel complexiteit, eiwit-expressiepatronen en het behoud van ziekte trajecten tussen C. elegans en hogere organismen (80% van de worm genen hebben een menselijke orthologue), gekoppeld aan de eenvoud en kosteneffectiviteit van de teelt, maken het een modelorganisme effectieve in-vivo vatbaar voor high-throughput genetische3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 en drug14,15,16 screenings. Om al deze redenen, is C. elegans werkzaam voor de karakterisatie van normale en ziekte verband houdende moleculaire trajecten; op het gebied van neurodegeneratie, bijvoorbeeld, heeft het de exploratie van de gevolgen van de vergrijzing op eiwit aggregatie3,4,7,15,17, 18, en de karakterisatie van de initiatiefnemers en remmers van eiwit aggregatie3,4,5,6,7,14, 18.
De algemene geschiktheid van de wormen, die een belangrijke gedrags parameter in te stellen in dit type van studie, kan worden gemeten handmatig in een verscheidenheid van manieren, zoals door het tellen van het aantal lichaam bochten per minuut (hsm)4,6, 19, of door het meten van de snelheid van beweging20,21,22, alsook door het meten van de gemiddelde levensduur en de tarieven van verlamming. Hoewel handmatige metingen van lichaam bochten en snelheid van de beweging hebben geleid tot vele belangrijke inzichten in een verscheidenheid van moleculaire pathways en mechanismen3,4,14,19, 20,23, manuele testen blijven momenteel laag-doorvoer, zeer arbeidsintensief en tijdrovende terwijl u gevoelig voor fouten en menselijke biases. Deze vraagstukken vormen grote uitdagingen in het verzamelen van gegevens met voldoende statistisch onderscheidingsvermogen te onderscheiden van de subtiele gedragsveranderingen. Deze beperking is met name relevant voor drug screening als behandelingen met potentiële drug moleculen vaak tot kleine fenotypische wijzigingen24 leiden, dus die de studie van grote aantallen dieren om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Ter illustratie van dit punt, de recente studies hebben aangetoond dat een hoge macht van detectie (POD) noodzakelijk om te definiëren met vertrouwen belangrijke wijzigingen in gedrag en is aan het beperken van vals-positieve resultaten25. Dit heeft geresulteerd in een sterke motivatie in de Gemeenschap van C. elegans om het vervangen van de manuele tellen met reproduceerbaar, geautomatiseerde, tijd - en goedkoop - cost-effective metingen. Om te voldoen aan deze eis, hebben verschillende laboratoria onlangs methoden ontwikkeld voor het hoog-gevoeligheids metingen en nauwkeurige worm tracking van groter aantal wormen22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
Om uit te breiden verder het proces van automatisering aan de grote cohorten van dieren nodig voor statistisch significant metingen, hebben we onlangs ontwikkeld een breed veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)15,34 ,35,,36, waarmee het gelijktijdige onderzoek van meerdere fenotypische uitlezingen op zeer grote worm populaties, een belangrijke factor statistisch relevant phenotypical detectie25. Niet alleen de WF-NTP momenteel Activiteitenweergave geeft maximaal 5.000 dieren in parallel, maar de fenotypische uitlezingen ook meerdere parameters, met inbegrip van het tarief en de amplitude van lichaam bochten, de snelheid van de beweging, de Fractie van de bevolking dat is verlamd, en de grootte van de dieren. Het is daarom gemakkelijk mogelijk aan scherm duizenden van wormen in parallel en de verschillende uitlezingen combineren in een gedrags kaart maken van een multidimensionale vingerafdruk36. De bijbehorende open-source software is geschreven in Python, die is ook nodig om hem te bedienen en is volledig aanpasbaar. Een grafische gebruikersinterface (GUI) is ook beschikbaar zodat gebruikers kunnen nemen van deze technologie.
Hier presenteren we een aantal protocollen die enkele van de mogelijke toepassingen van de WF-NTP illustreren. In het bijzonder, we bespreken de administratie van stoffen, variërend van kleine moleculen aan eiwit therapeutiek, en wordt beschreven hoe om hun effecten te sluiten direct boven grote populaties van wormen, dus effectief verwijderen van de noodzaak om te genieten van kleine subpopulatie. Het gebruik van de WF-NTP daartoe een heeft reeds geleid tot aanzienlijke voordelen in procedures die zijn gericht op het ontwerpen van de drug discovery-programma's van de ziekte van Alzheimer (AD)15,34,35 en de ziekte van Parkinson (PD)18 met behulp van in-vivo-gegevens voor de beoordeling van de therapeutische kandidaten35,37.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Consumable reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco casein digest</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>211610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol</td>
			<td>Acros</td>
			<td>110190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497.ME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium capsules</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>3002-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13% sodium hypochlorite</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/4880/53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E coli strain OP50</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>Op50</td>
			<td>E coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain wild type</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>N2</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain AD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>GMC101</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain PD</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>NL5901</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain ALS</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>AM725</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Tau</td>
			<td>Supplied by CGC</td>
			<td>BR5485</td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tactrol 2 Autoclave</td>
			<td>Priorclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm sterile petri dishes.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11309283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L erlenmeyer flasks</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FLA4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 1 L Centrifuge pots</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC5C plus floor mounted centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>9900884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R</td>
			<td>Thermofisher scientific</td>
			<td>75004515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11821741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M4 multipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 pipette</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>3123000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.765.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L low retention tips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>70.1130.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipeteboy 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-0927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>CC214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipette 270 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB50255</td>
			<td>Camera for videos recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsin</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>501-04</td>
			<td>Transduction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Standard shaking incubator</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>INFO28573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air duster</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>1511631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8&#39;&#39; by 8&#39;&#39; Backlight</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>88-508</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mm FL high resolution lens for 1&#39;&#39; sensor</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>86-571</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Mpx camera</td>
			<td>Edmond Optics</td>
			<td>33540</td>
			<td>Tracker component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlyCapture Software</td>
			<td>PointGrey</td>
			<td>SDK v2.12</td>
			<td>Image capture software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WF-NTP Software</td>
			<td>Cambridge Enterprise</td>
			<td>v1.0</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office Package</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated behavioral analysis of large c. elegans populations using a wide field-of-view tracking platform

Caenorhabditis elegans is een gevestigde diermodel in biomedisch onderzoek, algemeen werkzaam in functionele genomica en vergrijzing studies. Om te beoordelen de gezondheid en de conditie van de dieren onder studie, een typisch is afhankelijk van de motiliteit uitlezingen, zoals het meten van het aantal bochten van het lichaam of de snelheid van de beweging. Deze metingen meestal sprake van handmatige tellen, waardoor het uitdagend te verkrijgen van goede statistische significantie, als tijd en arbeid beperkingen vaak Beperk het aantal dieren in elk experiment tot en met 25 of minder. Omdat hoge statistisch onderscheidingsvermogen noodzakelijk is om reproduceerbare resultaten te verkrijgen en valse positieve en negatieve resultaten beperken wanneer zwakke fenotypische effecten onderzocht, er onlangs inspanningen zijn verricht om geautomatiseerde protocollen gericht op het vergroten van de gevoeligheid van de motiliteit detectie en multi parametrische gedrags profiling. Oog op de uitbreiding van de limiet van detectie tot het niveau moesten vangen de kleine fenotypische veranderingen die zijn vaak van cruciaal belang in de genetische studies en Geneesmiddelenontwikkeling, beschrijven we hier een technologische ontwikkeling die het mogelijk de studie van maximaal 5.000 individuele dieren maakt gelijktijdig, verhoging van de statistische power van de metingen door ongeveer 1,000-fold in vergelijking met manuele testen en ongeveer 100-fold in vergelijking met andere beschikbare geautomatiseerde methoden.

Het gemak van bedrijfs-, multiparametric analyse en hoge doorvoer van de geïllustreerde WF-NTP protocol (figuren 1 en 2) maakt het mogelijk om zeer kleine veranderingen in gedrag van de worm in een zeer nauwkeurige manier. De imaging platform is gebaseerd op de op maat gemaakte opto-mechanica, en het kan worden gemonteerd met behulp van een 6 MP zwart-wit camera in combinatie met 16 mm brandpuntsafstand met een hoge resolutie lens voor 1'' sensor, verlicht met een 8'' door 8'' witte achtergrondverlichting (Zie Tabel van materialen en ook een verwijzing36 voor meer informatie). De bijbehorende WF-NTP software is geschreven in Python en werd ontwikkeld om uit te voeren op Windows-platforms. Het draait op een aangepaste geassembleerde computer met 3,00 GHz octa-core processor en 64 GB random - access memory (RAM). De software is ook ontworpen om parallelize van het werk en de video-analyse op basis van de RAM en CPU van de computer; d.w.z., een machine met een lager vermogen berekening zal resulteren in minder video's lopen parallel. De instelling die wij momenteel gebruikt is geoptimaliseerd om oplopen tot ca. 16 video's parallel en een analyse van ca. 100 video's 's nachts kunt voltooien. Bovendien kan de hoge mate van gedetailleerdheid van aanpassing verstrekt in de GUI van het WF-NTP grote controle van de kwaliteit van de beeldvorming analyse. De GUI kan worden gebruikt voor direct uploaden van grote datasets in parallelle of individuele video's; specifieke frames kunnen ook worden geselecteerd voor gedetailleerde sub analyse, samen met een conversiefactor van pixel, die kan worden gebruikt om te schatten gedrags statistieken. Een van de twee verschillende tracking-algoritmen (Houd dode en Z-transformatie) kan worden gekozen afhankelijk van wel of niet de gebruiker zou willen nadenken verlamd dieren in de analyse. De drempelmethode-parameter kan bestaan uit tuned dienovereenkomstig met de video en experimentele kwaliteit. Het openen en sluiten parameters kunnen de gebruiker te verwijderen van het lawaai en verder implementeren van de functionaliteit van de drempelwaarde. Het skeletonizing-algoritme biedt een alternatieve methode voor de analyse. Het object grootte cut-offs (filteren) bieden een extra filter voor achtergrondgeluiden en de worm-achtige parameter kan de gebruiker dat wormen alleen objecten met een ellipsoïdale vorm, dus onderscheiden van andere objecten die dezelfde pixelgrootte van wellicht de wormen. Na deze drempelmethode operaties, alle resulterende gelabelde regio's kunnen worden geïdentificeerd als afzonderlijke wormen en de standpunten van deze regio's worden vervolgens opgeslagen voor elk frame voor latere analyse en bijhouden. De excentriciteit van elke bijgehouden worm wordt gebruikt voor het schatten van de worm statistieken zoals de mate van worm buigen (BPM) als een functie van de tijd. De gebruikers zijn ook toegestaan om te selecteren van het aantal frames gebruikt om te houden van een worm in het geheugen van de software na botsingen en het aantal pixels dat een worm tussen frames verplaatsen kunt kan ook worden afgestemd om te onderscheiden van de dieren van het lawaai. De minimale track lengte optie kan de gebruiker negeren wormen die alleen een paar frames zijn getraceerd. Andere essentiële parameters, zoals bochten en snelheid, kunnen de gebruiker selecteren de mate van buiging moet worden geteld als een bocht van het lichaam en het aantal frames beschouwd moeten worden voor het schatten van de snelheid van de dieren. Licht-donkerscheiding parameters kunnen verder worden afgestemd voor de opneming van verlamd dieren. De output wordt automatisch weergegeven in de bestanden met resultaten. Deze waarden worden beschouwd als bovengrenzen voor de evaluatie van de Fractie van de verlamde dieren. De gebruiker kan ook kiezen voor één of meer regio's van belang. Deze functie is vooral handig voor het analyseren van de subpopulaties van de wormen en de uitvoer wordt automatisch gesorteerd in de bestanden van de resultaten. De uitvoeroptie kan de gebruiker selecteren de uitvoermap en het aantal frames dat zal worden geproduceerd voor het bijhouden. Diverse gereedschap sets kunnen ook worden gebruikt voor verdere gegevensanalyse, zoals het gereedschap Tekengebied pad waarin individuele worm tracks en de vingerafdrukken tool waarmee de gebruiker vingerafdruk maken kaarten.
Deze methode maakt het mogelijk nieuwe benaderingen worden aangenomen, niet alleen voor biologische studies van C. elegans , maar ook voor farmacologische en medisch onderzoeksdoeleinden, zoals high-throughput screening van genetische wijzigingen en drug behandelingen. We hebben laten zien dat dit potentieel door het beschrijven van de karakterisering van de fenotypen voor grote populatie studies (N > 1000) van verschillende worm modellen van neurodegeneratieve ziekte (Frontotemporale dementie (FTD)39, van Parkinson (PD)7 , De ziekte van Alzheimer (AD)16,40, en Amyotrofische laterale sclerose (ALS)19 (Figuur 3a), en karakteriseren van de effecten van potentiële therapeutische moleculen met behulp van worm modellen van PD18 en AD 15,12 (Figuur 3b). Twee kleine molecules, squalamine18 en bexaroteen15, werden toegediend bij concentraties tot 25 µM aan PD (Figuur 3b) en 10 µM tot AD38 (Figuur 3b) wormen, respectievelijk. Beide verbindingen toonde duidelijk dosis-afhankelijke effecten over het bereik van concentraties getest. We hebben aangetoond dat deze hoge nauwkeurigheid van de metingen wordt bereikt door verhoging van het aantal wormen die kan worden geanalyseerd in vergelijking met traditionele methoden (Figuur 3 c). We illustreren het belang van de grootte van de steekproef (Figuur 3 c) in moleculaire screening zo goed zoals in karakterisering van gemuteerde stammen. De stijging van de temperatuur van 20 ° C leidt tot ongeveer de helft van de AD-wormen steeds verlamd na 3 dagen van volwassenheid. Worm populaties werden vertoond onder verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld, als wormen over het uitdrukken van de 42-residu-vorm van de amyloid-β-peptide (Aβ1-42) (AD worms) werden blootgesteld aan subtiele temperatuurschommelingen (Figuur 3 c, links deelvenster) als Aβ1-42 werd uitgedrukt in alle de neuronen (Figuur 3 c, centrale paneel), of wanneer AD wormen waren blootgesteld aan bexaroteen (Figuur 3 c, rechter paneel). Wormen zijn ook geanalyseerd van kleine ROIs willekeurig uit de volledige gezichtsveld van de video's verworven met de WF-NTP (N < 50, gele balken) markeren de vergelijking van de beweeglijkheid van deze wormen met de gemiddelde beweeglijkheid van de bevolking van de hele worm (N < 1.000). In alle panelen, het verschil gemeten over het geheel genomen worm bevolking lijkt te zijn statistisch significant met p ≤ 0.0001 (*).
Het WF-NTP protocol beschreven hier staat ook het gelijktijdig opnemen van meerdere parameters (Figuur 1b) te ondersteunen, op een optimale wijze, zowel interne validatie en de ontwikkeling van een uitgebreide vingerafdruk van een brede waaier van voorwaarden ten opzichte van een controlemonster, waardoor voor zinnige vergelijkingen in meerdere studies. Deze multi parametrische benadering omvat de gelijktijdige analyse van meerdere gedrags eigenschappen, met inbegrip van buigen frequentie, snelheid, verlamming tarief, grootte, bocht amplitude en bocht verplaatsing36. Dit maakt van duizenden dieren te worden gecontroleerd in groot detail en op een zeer hoge gevoeligheid en de statistische significantie en biedt mogelijkheden voor grote populaties studies. Deze tracking-procedure heeft ook het voordeel van het toestaan van verlamming studies in parallel met andere gedrags metingen, een belangrijke functie in moleculaire screening studies worden uitgevoerd.
De resultaten die tot nu toe zijn bereikt in de AD15,34,35 en PD18 drugontdekking tonen het belang van breed veld-of-view data-acquisitie te sterk verhogen het aantal dieren dat kunnen worden in een één experiment, aanzienlijk verminderen de experimentele fouten en sterk verbeteren van de statistische validiteit van de studies gevolgd. Op basis van deze resultaten, verwachten wij dat het WF-NTP protocol, die wij gemakkelijk beschikbaar gesteld voor de Gemeenschap36, het gebruik van C. elegansaanzienlijk zal uitbreiden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig1.jpg"> Afbeelding 1: voorbeeld van een vingerafdruk en WF-NTP analyse stappen. (een) 1. Originele video. 2. achtergrond afbeelding. 3. achtergrond afgetrokken afbeelding. 4-6. drempelmethode stappen. 7-9. enkele etikettering van wormen. (b) meerdere fenotypen zijn gemeld met een vingerafdruk voor wild-type wormen en worm modellen van PD en AD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig2.jpg"> Figuur 2: grafische gebruikersinterface (GUI) voor de WF-NTP. Specifieke video's en geselecteerde frames kunnen worden geselecteerd in de GUI voor analyse en een conversiefactor van pixel kunnen worden ingevoegd, waarna de analyse wordt uitgevoerd met een van de twee gegeven tracking-algoritmen. Het is mogelijk om te selecteren van de mate van het noodzakelijke om te tellen als een lichaam bocht, evenals het aantal frames die nodig zijn om een schatting van de snelheid van de dieren te buigen. Lichaam van bochten en snelheid drempels kunnen bepalen de verlamde worm-statistieken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58643/58643fig3.jpg"> Figuur 3: voorbeelden van toepassingen die zijn ingeschakeld door de WF-NTP-methode. (een) toepassing van WF-NTP in grote bevolkingsvraagstukken (N > 1000) van BPM metingen voor C. elegans modellen van een reeks neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van FTD, PD, AD, en ALS. (b) toepassing van WF-NTP in Geneesmiddelenontwikkeling. (c) belang van de bevolkingsonderzoeken in temperatuur gevoeligheid, drug werkzaamheid en karakterisering van het gemuteerde stam. Fenotypes van subpopulaties N < 50 (gele balken) worden vergeleken met die van de bevolking van de hele worm (N < 1.000). De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58643/58643fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform at JoVE.com

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

We beschrijven de protocollen voor het gebruik van het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), waarmee de fenotypische karakterisering van de high-throughput van grote populaties van Caenorhabditis elegans. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor subtiele gedragsveranderingen in gemuteerde stammen of in reactie op farmacologische behandeling in een uiterst schaalbaar mode karakteriseren.

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Dus deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in een drugsontdekkingsproces over hoe een specifiek medicijn zich gedraagt in een levend organisme. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat grote monsterformaten snel en efficiënt kunnen worden gescreend. Deze techniek heeft al een grote impact bij de ontdekking van geneesmiddelen door een zeer quanititatieve beoordeling van de effecten van kandidaat-geneesmiddelen mogelijk te maken.Deze methode biedt nieuwe mechanistische inzichten in het ontstaan en de progressie van misfolding ziekten. Bovendien kan deze methode ook worden toegepast op andere systemen, zoals veroudering en genetische screenings. We zijn erg enthousiast over deze kans om nieuwe fysieke methoden te introduceren in de ruimte van drugsontdekking.Deze demonstartions van deze methode is van cruciaal belang omdat de screeningstappen een hoge vertrouwdheid met deze novo automatische techniek vereisen. Het aantonen van de procedure zal Sam Casford zijn, een zoekassistent van ons laboratorium. Voeg voor het begin van de procedure 2,2 millileter van elke geneesmiddelenverbinding bij de juiste concentratie toe aan zes 5-fluordeoxyuridine- of FUDR-platen per wormstam, door de verbinding zorgvuldig over het hele oppervlak van de plaat te verspreiden en de platen onder steriele omstandigheden te drogen.Terwijl de platen drogen, gebruik 15 milliliter M9 buffer om de wormen te wassen van vijf rijke nematode groeifactor platen, en de overdracht van de bevrijde wormen in een kegelvormige buis voor centrifugatie. Stel de aaltjes opnieuw op in drie milliliter verse M9-buffer voor kwantificering van het aantal wormen in het larvalestadium van L4 en zaad 700 L4-larven op elk van de zes droge FUDR-platen per wormsoort, per verbinding. Wanneer alle aaltjes zijn ingezaaid, plaatst u de platen met de stammen waarvoor parlyse wordt veroorzaakt door de temperatuur 24 uur lang op 24 graden celsius te verhogen.De volgende dag, zet de podiumlichten van de parallelle worm tracker, en maak het glas stadium van de tracker met 70 procent ethanol. Als er geen zichtbare resten achterblijven, verwijder dan de lensdop en gebruik een luchtdring om de beeldlens schoon te maken. Controleer of de camera correct is aangesloten en geïnstalleerd en begin met opnemen met de software voor het vastleggen van afbeeldingen.Pas de camera-instellingen aan om 20 frames per seconde op te nemen, met de juiste mono-16 opnameparameters. Gebruik een lege petrischaal van negen centimeter om ervoor te zorgen dat het podium op de juiste hoogte is ingesteld en pas het podium indien nodig aan. Voeg onder steriele omstandigheden drie milliliter M9-oplossing toe aan een beweeglijkheidsscreeningplaat en gebruik twee milliliter M9-oplossing om een derde van het oppervlak van twee door aaltjes geladen FUDR-platen van dezelfde experimentele groep in de zeefplaat te wassen.Plaats vervolgens de screeningplaat op het trackerpodium. Gebruik een enkele worm om de camera scherp te stellen, en beginnen met het opnemen van de dieren. Wanneer de opname is voltooid, gooi de beweeglijkheidsplaat weg en markeer de FUDR-platen als één keer gebruikt voordat u ze terugbreek naar de couveuse.Als u de videogegevens wilt analyseren, opent u de grafische gebruikersinterface voor de parallelle wormtrackergegevensanalyse en gebruikt u de browsefunctie om de video van belang te laden. Selecteer een uitvoerbestemmingsmap en controleer of 600 tot 1200 frames zijn ingesteld voor een analyse van 30 seconden. Plaats een conversiefactor van 0,029 tot millimeter voor de beeldvorming van een petrischaaltje van negen centimeter op volledige resolutie en selecteer de houd dead tracking algorithhm.Stel onder het tabblad zoekparameters de z-gebruiksafbeeldingen in op 100, de Z-padding op 3, de standaardpixels op 54, de drempelwaarde op 9, de opening op 1 en de afsluiting op 2. Pas de filterparameters aan op een minimale grootte van 20, een maximale grootte van 180 en een worm van 0,94. Stel de parameters van de vormende trajecten in op een maximale afstandsbeweging van 10, een minimale lengte van 150 en een geheugen van 10.Stel de bochten en snelheid parameters op een bocht drempel drempel van 1,8, een minimum bochten van 0, en een frames om de snelheid van 150 schatten. Stem de dode wormstatistieken af op een maxmim beat per minuut van 5 en een maximale snelheid van 1. Selecteer de uitvoermap en selecteer het aantal uitvoerframes op 50 en de tekengrootte op 10.Gebruik de voorbeeldfunctie om de parameters te testen en de voorbeeldafbeeldingen uit te voeren om te controleren of de wormen zichtbaar zijn in de acht drempels. Start vervolgens de functie Starttaak en combineer de afzonderlijke resultaten voor de hele gegevensset om de testresultaatbestanden te analyseren, waardoor de resultaten worden opgeslagen via de functie exporteren naar TSV. Deze methode maakt het mogelijk de karakterisering van nematode fenotypes voor grote populatiestudies van verschillende wormmodellen van neurodegeneratieve ziekte, zoals Frontotemporale dementie, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, en Amyotrofische laterale sclerose.Evenals de karakterisering van de effecten van potentiële therapeutische moleculen, met behulp van worm modellen van de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer. De hoge nauwkeurigheid van deze metingen wordt bereikt door het verhogen van het aantal wormen dat kan worden geanalyseerd in vergelijking met traditionele methoden. Tijdens het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de tijd tussen de toevoeging van de wormen aan de beweeglijkheid en het begin van de tracking te minimaliseren.Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd om de resultaten aan te vullen en te koppelen aan eiwitaggregatie. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van neurodegeneratieve en misfolding ziekten, zoals Parkinson en Alzheimer, om de juiste ontdekkingstoepassingen te verkennen. Vergeet niet dat het werken met FUDR zeer gevaarlijk kan zijn en dat de voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van nitrilhandschoenen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Geautomatiseerde Scheiding van<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel gekoloniseerd door een bacteriële pathogenen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Een semi-automatische Aanpak Voorbereiding Antibody Cocktails voor Immunophenotypic Analyse van de humane perifere bloed

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Multiplex Cytokine profilering van gestimuleerd muis Splenocytes met behulp van een kraal cytometrische gebaseerde Immunoassay Platform

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...